家蚕5-HT受体基因的克隆鉴定及5-HT1ABm受体功能的初步研究 - 图

ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒＭａｓｔｅｒ’ＳＤｅｇｒｅｅｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｌｏｎｉｎｇｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ５－?ＨＴＩＡＢｍｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍ，ＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＭａｊｏｒ，弋ＵｅｎｅｔｌＣＳＪ。ＦｉｅｌｄＡｎｉｍａｌｇｅｎｅｔｉｃｓ—ＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｉｎｇＣｈｅｎＰｒｏｆｅｓｓｏｒＣａｎｄｉｄａｔｅＬｉＨａｉ—ｙｉｎＣｈｏｎｇｑｉｎｇ，ＣｈｉｎａＭａｙ，２０１４删㈣㈣㈣Ｙ２５７芝葺芝葺‘独创性声明学位论文题目：塞蚕５：Ｈ！受佳基国的直隆鉴定区５：Ｈ！！缱堡受佳功能的初生研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者痞渗匆易签字日期：Ⅵ７％年梦月矽日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：匦不保密，口保密期限至年月止）。学位论文作者鲐枷弛锄张晦砀签字日期：锄Ｉ够年ｙ月迟日签字日期：年月日目．录摘要耍……………………………………………………………………………………………………………………………………ＩＡＢＳＴＲＡＣＴ………………………………………………………………………………………………………………………。Ｖ第１章文献综述……………………………………………………………………………………．１１．１５．ＨＴ………………………………………………………………………………………………………………………。１１．１．１５－ＨＴ的发现历史……………………………………………………………………ｌ１．１．２５－ＨＴ的合成代谢……………………………………………………………………２１．１．３５－ＨＴ的功能…………………………………………………………………………．３１．２５－ＨＴ受体………………………………………………………………………………………………………………．４１．２．１５－ＨＴｌ受体家族………………………………………………………………………４１．２．１．１５．ＨＴｌＡ受体……………………………………………………………………………………．．４１．２．１．２５－ＨＴｌＢ受１本……………………………………………………………………………………．．５１．２．１．３５．ＨＴｌＤ受体………………………………………………………………………………………．６１．２．１．４５－ＨＴｌＥ受１本………………………………………………………………………………………．．７１．２．１．５５－ＨＴｌＦ受体……………………………………………………………………………………．．７１．２．２５－ＨＴ２受体家族……………………………………………………………………．．８１．２．２．１５．ＨＴ２Ａ受１本………………………………………………………………………………………．８１．２．２．２５－ＨＴ２Ｂ受体………………………………………………………………………………………．９１．２．２。３５－ＨＴ２Ｃ受｛本……………………………………………………………………………………～１０１．２．３５．ＨＴ３受体…………………………………………………………………………………………………１０１．２．４５－ＨＴ４受体…………………………………………………………………………………………………．１１１．２．５５－ＨＴ５受体家族……………………………………………………………………１２１．２．６５－ＨＴ６受体…………………………………………………………………………………………………．１３１．２．７５－ＨＴ７受１本…………………………………………………………………………………………………。１３１．３昆虫５－ＨＴ受体的研究概况………………………………………………………………１４１．３．１昆虫５－ＨＴ受体的归类和命名……………………………………………………１４１．３．２果蝇５－ＨＴ受体的研究现状………………………………………………………１４１．３．３其他昆虫５－ＨＴ受体的研究现状…………………………………………………１６第２章引言…………………………………………………………………………………………１７２．１研究背景及意义…………………………………………………………………………．．１７２．２主要研究内容……………………………………………………………………………．．１７２．３研究技术路线………………………………………………………………………………１８第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱…………………………………１９３．１材料与方法………………………………………………………………………………．．１９３．１．１材料…………………………………………………………………………………………………………．１９３．１．２主要试剂……………………………………………………………………………１９３．１．３主要试剂的配制……………………………………………………………………２０３．１．４主要仪器设备………………………………………………………………………２０３．１．５生物信息学分析网站及软件………………………………………………………２０３．１．６ＲＮＡ的提取、检测以及ｅＤＮＡ的制备、检测…………………………………．．２１３．１．７目的基因的克隆……………………………………………………………………２２３．２结果与分析………………………………………………………………………………．．２４３．２．１家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆以及核酸序列分析…………………………………２４３．２．２家蚕５－ＨＴ受体基因的蛋白氨基酸序列分析……………………………………２９３．２．３家蚕５－ＨＴ受体基因的组织表达谱………………………………………………３４３．：；讨论……………………………………………………………………………………………………………………．３５第４章家蚕５－ＨＴ受体多序列比对以及进化分析………………………………………………３７４．１材料与方法………………………………………………………………………………一３７４．１．１分析网站及软件……………………………………………………………………３７４．１．２方法…………………………………………………………………………………………………………。３７４．２结果与分析………………………………………………………………………………．３８４．３讨论………………………………………………………………………………………．．４４第５章家蚕５－ＨＴｌＡＢｍ受体的功能初步研究…………………………………………………４５５．１材料与方法………………………………………………………………………………．４５５．１．１材料…………………………………………………………………………………４５５．１．２主要试剂…………………………………………………………………………．．４５５．１．３主要试剂的配制…………………………………………………………………．．４５５．１．４主要仪器设备……………………………………………………………………．．４５５．１．５５－ＨＴｌＡＢｍ在家蚕幼虫中的功能探究……………………………………………４６５．１．６５－ＨＴｌＡＢｍ在家蚕蛹期发育中的作用……………………………………………４６５．１．７５－ＨＴｌＡＢｍ在家蚕成虫中功能探究………………………………………………４６５．２结果与分析………………………………………………………………………………．４７５．２．１５－ＨＴｌＡＢｍ在家蚕幼蚕中的作用研究……………………………………………４７５。２。２５－ＨＴｌＡＢｍ在家蚕蛹期的作用研究……………………………………………一４８５．２－３５－ＨＴｌＡＢｍ在家蚕成虫求偶与生殖中的作用研究………………………………４９５．３讨｛仑……………………………………………………………………………………………………………………．５０第６章结论………………………………………………………………………………………一５３参考文献……………………………………………………………………………………………５５致谢…………………………………………………………………………………………………………………………………．６３附录…………………………………………………………………………………………………………………………………．６５在读期间发表的文章及参研课题…………………………………………………………………６７

摘要家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定及５．ＨＴｌＡＢｍ受体功能的初步研究遗传学专业硕士研究生李海银指导教师陈萍教授摘要５．羟色胺（５－ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ，５－ＨＴ），又名血清素（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ），是一种单胺类小分子物质，广泛分布于脊椎动物与无脊椎动物中。作为神经递质，５－ＨＴ与动物的发育、感觉、行为、认知、记忆等密切相关；作为调质，５．ＨＴ可以促进神经元发育成熟、调节某些激素释放、促进血管收缩等。５－ＨＴ发挥作用必需依靠５－ＨＴ受体来介导完成。在人类，５－ＨＴ受体与偏头痛、老年痴呆、抑郁、自杀等精神性疾病息息相关，目前医学上治疗精神性疾病的药物，８０％都是以５．ＨＴ受体作为治疗靶点。在动物中已发现５－ＨＴｌＡ、５－ＨＴｌＢ、５－ＨＴｌＤ、５－ＨＴｌＥ、５－ＨＴｌＦ、５．ＨＴ２Ａ、５．ＨＴ２Ｂ、５．ＨＴ２Ｃ、５．ＨＴ３、５－ＨＴ４、５．ＨＴ５Ａ、５．ＨＴ５Ｂ、５－ＨＴ６、５－ＨＴ７等１４种５．ＨＴ受体，其中１３种为Ｇ蛋白偶联受体，１种为配体门控离子通道受体。家蚕作为～种重要的鳞翅目模式昆虫，研究其５－ＨＴ受体对探索农林上鳞翅目害虫防治具有重要意义，但迄今未见有关家蚕５．ＨＴ受体的报道。本文克隆了家蚕５－ＨＴ受体，并对其表达以及功能进行了分析，结果如下：１、在家蚕中存在５－ＨＴｌＡＢｍ、５－ＨＴｌＢＢｍ、５－ＨＴ２Ｂｍ、５－ＨＴ７Ｂｍ４种５－ＨＴ受体基因。以家蚕幼虫５龄３天头ｅＤＮＡ为模板，克隆的５－ＨＴｌＡＢｍＣＤＳ为１４４１ｂｐ，其中ＯＲＦ长１３９５ｂｐ。５－ＨＴｌＡＢｍ基因位于家蚕８号染色体，包含３个外显子２个内含子，预测编码４６４个氨基酸，预测其分子量为５１．７５２ＫＤ，等电点为９．１３，含有７次跨膜化学受体蛋白结构域；５－ＨＴＩＡＢｍ主要在５龄３天幼虫的头部、腹部神经、精巢、卵巢有高量表达，其它组织表达较低或者不表达；５－ＨＴｌＡＢｍ在雌性成虫组织中的表达与雄性相似，都是在胸部、触角、足、生殖器有一定表达，其它组织表达量低或者不表达。以家蚕幼虫５龄３天卵巢ｅＤＮＡ为模板，克隆的５－ＨＴｌＢＢｍＣＤＳ为１４２８ｂｐ，其中ＯＲＦ长为１３４１ｂｐ。５－ＨＴＩＢＢｍ位于家蚕１０号染色体，包含３个外显子２个内含子，预测编码４４６个氨基酸，预测其分子量为４８．５９９ＫＤ，等电点为８．９５，具有７次跨膜化学受体蛋白结构域；５－ＨＴＩＢＢｍ在５龄３天幼虫的各个组织中均有表达，在丝腺中表达量较低；成虫期工ＨＴｌＢＢｍ在雌性的胸部、腹部、触角、翅、足、生殖器的扩增带比较暗，在雄性的头、腹部、触角和生殖器有低量表达。西南大学硕士学位论文以家蚕幼虫５龄３天精巢ｅＤＮＡ为模板，克隆的５－ＨＴ２ＢｍＣＤＳ为１８８１ｂｐ，其ＯＲＦ长为１８８１ｂｐ。５－ＨＴ２Ｂｍ基因位于家蚕１５号染色体，包含２个外显子１个内含子，预测编码６２６个氨基酸，预测其分子量为６９．２９４ＫＤ，等电点为９．９７，含有７次跨膜化学受体蛋白结构域；５－ＨＴ２Ｂｍ仅在５龄３天幼虫的头、腹部神经、精巢中有较低表达，而在成虫雌性和雄性各组织未见明显扩增带。以家蚕幼虫５龄３天头ｅＤＮＡ为模板，克隆的５－ＨＴＴＢｍＣＤＳ为１５１０ｂｐ，其中ＯＲＦ长为１４９７ｂｐ。５－ＨＴ７Ｂｍ基因位于家蚕２６号染色体，包含２个外显子１个内含子，预测编码４９８个氨基酸，预测其分子量为５６．１３２ＫＤ，等电点为９．０３，含有７次跨膜化学受体蛋白结构域：５－ＨＴ７Ｂｍ在５龄３天幼虫的头部表达量最高，腹部神经、中肠、脂肪体、精巢、卵巢也有表达，其它组织未见有明显扩增条带：５－ＨＴ７Ｂｍ在雌蛾和雄蛾的胸部、腹部、触角、翅、足、生殖器有表达，尤其在雄蛾的生殖器中表达量最高。２、对５－ＨＴ受体蛋白序列的多序列比对和进化分析：家蚕５－ＨＴｌＡＢｍ、５－ＨＴｌＢＢｍ、５一ＨＴ２Ｂｍ、５－ＨＴ７Ｂｍ４种受体间的氨基酸序列相似性为３０．４％。５－ＨＴＩＡ、５－ＨＴｌＢ、５－ＨＴ２、５－ＨＴ７这４种受体在昆虫中的相似性分别为４５．４％、６１．４％、４８．４％、５４．１％，在人类、小鼠、原鸡、斑马鱼、果蝇和家蚕等脊椎动物和无脊椎动物间跨膜区的相似性分别为７６．９％、７７．７％、６７．１％、５６．８％，非跨膜区的相似性分别为２５．１％、５４．３％、３１．０％、３７．４％，４种受体总的相似度在跨膜区可达４５．２％，在非跨膜区为１２．１％。推测跨膜区的高保守性可能是５一ＨＴ受体结构稳定和信息传递的保障，非跨膜区的保守氨基酸序列可能是配体结合、Ｇ蛋白偶联不可或缺的。进化树结果表明，不同物种的相同受体首先聚为一类，而同一受体随着物种之间亲缘关系的远近而形成分支，其中家蚕５－ＨＴ受体的进化关系与烟草天蛾较为紧密。推测５－ＨＴｌ、５－ＨＴ２、５一ＨＴ７等３类受体可能在脊椎动物与无脊椎动物分化前已经形成：５－ＨＴｌ受体可能在昆虫形成时发生了一次重复，２个拷贝在进化中逐渐形成功能有异的５－ＨＴＩＡ受体和５一ＨＴｌＢ受体。３、对５－ＨＴｌＡＢｍ的功能研究发现：５－ＨＴｌＡＢｍ与家蚕的活力有很显著的关系，无论对家蚕幼虫还是雄蛾注射５－ＨＴｌＡ受体抑制剂，能显著降低其活力。推测５－ＨＴｌＡＢｍ受体可能参与家蚕行为活动的控制。而５－ＨＴｌＡ受体激动剂对家蚕的影响并不明显，可能由于氨基酸序列的差异，导致脊椎动物５．ＨＴｌＡ受体激动剂对家蚕５－ＨＴｌＡ受体结合能力的降低。综合以上结果可得：家蚕存在５－ＨＴｌＡＢｍ、５－ＨＴｌＢＢｍ、５－ＨＴ２Ｂｍ、５－ＨＴ７Ｂｍ４种５．ＨＴ受体基因，且他们的蛋白序列中存在一些非常保守的氨基酸，这可能是受体结构的稳定或功能的发挥不可或缺的。而对５－ＨＴｌＡＢｍ受体进行研究发现，该受体与家蚕的活力显著相关。关键词：家蚕；５－ＨＴ；５－ＨＴ受体；行为ＩＩ摘要ＩＩＩ西南大学硕士学位论文摘要Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ５－ＨＴｌＡＢｍⅢ一?●ｒｅｃｅｏｔｏｒｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍ，Ｂｏｍｂｖｘ聊Ｄｎｏ●Ｍａｓｔｅｒｏｆｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＬｉＨａｉ?ｙｉｎＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＰｉｎｇＣｈｅｎ，ＰｒｏｆｅｓｓｏｒＡＢＳＴＲＡＣＴ５－ＨＴ（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ），ａｍｏｎｏａｍｉｎｅｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，５－ＨＴｃａｎｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ｐｌａｙｓｓｏｍｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎａｓｖｉｖｏ．Ａｓａｍａｊｏｒｃｏｎｔｒｏｌｂｅｈａｖｉｏｕｒ，ｓｕｃｈｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｘｉｅｔｙ，ｌｅａｒｎｉｎｇ，ｍｅｍｏｒｙ，ｅｔｃ。Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，５－ＨＴａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ⅳｉｍｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｅｕｒｏｎｓｃｅｌｌ，ｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｏｆｓｏｍｅｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ５－ＨＴｍｕｓｔｂｅｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｃａｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｌｓｏｉｓｃｌｏｓｅｌｙ５－ＨＴｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｌｅａｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓｒｅｌａｔｅｄｓｏｍｅｍｅｎｔａｌｉｌｌｎｅｓｓｅｓｉｎｈｕｍａｎ，ｓｕｃｈａｓｍｉｇｒａｉｎｅ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ，ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｕｉｃｉｄａｌｔｅｎｄｅｎｃｉｅｓ，ｅｒｅ．．Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ，ａｍｏｓｔｏｆｔｈｅｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃｄｉｓｅａｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｓｔａｋｅ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔ．Ｔｈｅｒｅａｒｅ１４ｓｐｅｃｉｅｓｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｈａｔｈａｖｅｂｅｅｎｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎａｎｉｍａｌｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１Ａ，１Ｂ，１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，２Ａ，２Ｂ，２Ｃ，３，４，５Ａ，５Ｂ，６，７．５－ＨＴ３ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｓａｌｉｇａｎｄ?ｇａｔｅｄｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｔｈｅｏｔｈｅｒｓａｒｅＧｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｉｌｋｗｏｒｍｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｏｄｅｌｉｎｓｅｃｔ，ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎｐｅｓｔｃｏｎｔｒｏｌｉｎｏｎｆｏｒｅｓｔｒｙ，ｈｏｗｅｖｅｒｔｈｅｋｎｏｗｌｅｄｇｅａｂｏｕｔｔｈｅ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓｓｉｌｋｗｏｒｍｉｓｑｕｉｔｅｌｉｍｉｔｅｄ．Ｓｏ，ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｃｌｏｎｅｔｈｅ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒａｄｄｉｔｉｏｎ，ｗｅｇｅｔｔｈｅｆｏｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｆｔｈｉｓｐａｐｅｒａｒｅｏｎｇｅｎｅｓｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＲＴ－ＰＣＲ．Ｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｂｙｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ５－ＨＴｌＡＢｍｆｏｌｌｏｗｓ：ｖｉｖｏ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｓ１．Ｔｈｅｒｅａｒｅｆｏｕｒｋｉｎｄｓｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｓｉｌｋｗｏｒｍ，５－ＨＴｌＡＢｍ、５－ＨＴＩＢＢｍ、５一ＨＴ２Ｂｍａｎｄ５一ＨＴ７Ｂｍ．Ｗｅｃｌｏｎｅｄ５－ＨＴｌＡＢｍｆｒｏｍＯＲＦｔｈａｔｈｅａｄ，ｔｈｅＣＤＳｏｆ５－ＨＴｌＡＢｍｈａｓ１４４１ｂｐｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄｈａｓｏｎｃｏｎｔａｉｎｅｄ１３９５ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ４６４ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｒｅｓｉｄｕｅｓ．５－ＨＴＩＡＢｍｌｏｃａｔｅｄｅｘｏｎｓｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ｃｏｎｔａｉｎｓ３ａｎｄ２ｉｎｔｒｏｎｓｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｓｅｖｅｎｏｆ５－ＨＴＩＡＢｍｉｓ５１．７５２ＫＤ，ｐＩｉｓ９．１３，ａｎｄ５－ＨＴｌＡＢｍｈａｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｉｓｓｕｅｂｅｅｎｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ；Ｔｈｅｈｅａｄ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｍｏｆｌａｒｖａｅｓｈｏｗｔｈａｔ：５－ＨＴｌＡＢｍｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｓｉｎａｂｄｏｍｉｎａｌｎｅｒｖｅｓ，ｔｅｓｔｉｓａｎｄｏｖａｒｙ，ｗｈｉｌｅｉｔｈａｓｗｅａｋｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｏｔｈｅｒｔｉｓｓｕｅｓ；Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆａｄｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔ：ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆ５－ＨＴＩＡＢｍａｒｅｓｉｍｉｌａｒｉｎｍａｌｅａｎｄｆｅｍａｌｅ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｂｒｅａｓｔ，ａｎｔｅｎｎａｅ，ｌｅｇｓａｎｄｇｅｎｉｔａｌｓ．Ｗｅｃｌｏｎｅｄ５－ＨＴＩＢＢｍｆｒｏｍｏｖａｒｙ，ｔｈｅＣＤＳｏｆ５－ＨＴＩＢＢｍｈａｓ１４２８ｂｐｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄｈａｓＶ

西南大学硕士学位论文ＯＲＦｔｈａｔｃｏｎｔａｉｎｅｄ１３４１ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇｅｘｏｎｓ４４６ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．５－ＨＴＩＢＢｍｌｏｃａｔｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０ｃｏｎｔａｉｎｓ３ａｎｄ２ｉｎｔｒｏｎｓｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｏｆ５－ＨＴｌＢＢｍｓｅｖｅｎｉｓ４８．５９９ＫＤ，ｐＩｉｓ８．９５，ａｎｄ５－ＨＴｌＢＢｍｈａｓｂｅｅｎｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ；Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａ钍ｅｒｎｏｆｌａｒｖａｅｓｈｏｗｔｈａｔ：５－ＨＴＩＢＢｍｅｘｐｒｅｓｓｅｓｉｎｍａｎｙｔｉｓｓｕｅｓｅｘｃｅｐｔｓｉｌｋｇｌａｎｄ；ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａＲｅｒｎｏｆａｄｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔ：５－ＨＴＩＢＢｍｅｘｐｒｅｓｓｅｓａｎｄｇｅｎｉｍｌｓｉｎｉｎｂｒｅａｓｔ，ａｂｄｏｍｅｎ，ａｎｔｅｎｎａｅ，ｗｉｎｇｓ，ｌｅｇｓｔｉｓｓｕｅｓｅｘｃｅｐｔｂｒｅａｓｔｉｎｍａｌｅ．ｆｅｍａｌｅ，ａｎｄｗｈｉｌｅｉｔｅｘｐｒｅｓｓｅｓｉｎｍａｎｙＷｅｃｌｏｎｅｄ５－ＨＴ２Ｂｍｆｒｏｍｔｅｓｔｉｓ，ｔｈｅＣＤＳｏｆ５－ＨＴ２Ｂｍｈａｓ１８８１ｂｐｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄｈａｓＯＲＦｔｈａｔｃｏｎｍｉｎｅｄ１８８１ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ６２６ａｍｉｎｏ１５ｃｏｎｔａｉｎｓ２ｉｓｅｘｏｎｓａｃｉｄｓ．５－ＨＴ２ＢｍｌｏｃａｔｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｎｄＩｉｎｔｒｏｎｓｉｎｓｉｌｋｗｏｒｍ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｅｖｅｎｗｅｉｇｈｔｓｏｆ５－ＨＴ２Ｂｍｉｓ６９．２９４ＫＤ，ｐＩ９．９７．ａｎｄ５－ＨＴ２Ｂｍｈａｓｂｅｅｎｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｄｏｍａｉｎｓ；Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａａｅｒｎｏｆｌａｒｖａｅｓｈｏｗｔｈａｔ：５－ＨＴ２Ｂｍｏｎｌｙｈａｓｌｏｗｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｅａｄ，ａｂｄｏｍｉｎａｌｎｅｒｖｅｓａｎｄｔｅｓｔｉｓ；Ｔｈｅｒｅｉｓｎｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ５－ＨＴ２Ｂｍｉｎｍａｌｅｆｅｍａｌｅｉｎａｄｕｌｔｓ．Ｗｅｃｌｏｎｅｄ５－ＨＴ７Ｂｍｆｒｏｍｈｅａｄ，ｔｈｅＣＤＳｏｆ５－ＨＴ７Ｂｍｈａｓ１５１０ｂｐｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄｈａｓｌｏｃａｔｅｄｏｎＯＲＦｔｈａｔｃｏｎｔａｉｎｅｄ１４９７ｃｏｎｔａｉｎｓ２９．０３，ａｎｄｅｘｏｎｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ１ｉｎｔｒｏｎｓｉｎ４９８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．５－ＨＴ７Ｂｍｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２６ａｎｄｓｉｌｋｗｏｒｍ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｖｅｎｏｆ５－ＨＴ７Ｂｍｉｓ５６．１３２ＫＤ，ｐＩｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｉｓｓｕｅ５－ＨＴ７Ｂｍｈａｓｂｅｅｎｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ；ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａＲｅｒｎｏｆｌａｒｖａｅｓｈｏｗｔｈａｔ：５－ＨＴ７Ｂｍｈａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｅａｄ，ｗｈｉｌｅｉｔｈａｓｌｏｗｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｂｄｏｍｉｎａｌｎｅｒｖｅｓ，ｍｉｄｇｕｔ，ｆａｔｂｏｄ弘ｔｅｓｔｉｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆａｄｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔ：５－ＨＴ７Ｂｍｅｘｐｒｅｓｓｅｓｉｎｌｅｇｓｏｖａｒｙ；Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｉｓｓｕｅｂｒｅａｓｔ，ａｂｄｏｍｅｎ，ａｎｔｅｎｎａｅ，ｗｉｎｇｓ，ｉｓｔｈｅａｎｄｇｅｎｉｔａｌｓｉｎｍａｌｅａｎｄｆｅｍａｌｅ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｉｔａｌｓｈｉｇｈｅｓｔｉｎｍａｌｅ．ｓｈｏｗｔｈａｔ：ｉｎ２．Ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎｓｅｃｔｓ，ｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｏｆ５－ＨＴｌＡＢｍ，５－ＨＴｌＢＢｍ，５－ＨＴ２Ｂｍｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆ５－ＨＴｌＡ，５－ＨＴｌＢ，５－ＨＴ２ａｎｄ５－ＨＴ７Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｎｉｎｓｅｃｔｓｏｒａｌｅａｎｄ５－ＨＴ７ＢｍｉＳ３０．４％．Ｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ４５．４％，６１．４％，４８．４％，５４．１％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ（４５．２％）ｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｒｅｍｏｒｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｔｈａｎｎｏｎ—ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓ（１２．１％１．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓｉｓｐｏｓｓｉｂｌｙｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎａｒｅｏｆｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｔｉｓｌｉｋｅｌｙｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆｎｏｎ—ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅ西ｏｎｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇ，Ｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄ．Ｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｔｙｐｅｓａｌｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｇｅｔｓｔｏｇｅｔｈｅｒ，ｔｈｅｎｔｈｅｓａｎｌｅｒｅｃｅｐｔｏｒｆｏｒｍｓｂｒａｎｃｈｉｎａｓｓｐｅｃｉｅｓｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆ５一ＨＴｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｓｉｌｋｗｏｒｍａｒｅｃｌｏｓｅｔｏｂａｃｃｏｈｏｍｗｏｒｍ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅ，ｗｅｓｐｅｃｕｌａｔｅｔｈａｔ：５－ＨＴ１，５－ｏｆｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓａｎｄｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，ＨＴ２，５－ＨＴ７ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｍａｙｂｅｈａｖｅ５－ＨＴｌｆｏｒｍｅｄｂｅｆｏｒｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｈａｓｆｏｒｍｅｄｔｗｏｃｏｐｉｅｓｉｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｉｎｓｅｃｔｓ，ａｎｄｔｈｅｔｗｏｃｏｐｉｅｓａｒｅ５－ＨＴｌＡａｎｄＶＩ摘要５－ＨＴｌＢｗｈｉｃｈｈａｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍ．．３．Ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙｏｆ５－ＨＴｌＡＢｍｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈａｔ：ｎｏｍａｔｔｅｒｌａｒｖａｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆ５－ＨＴｌＡＢｍｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｊｔｈＣａｌｌｏｒｍａｌｅｍｏｔｈ，ｔｈｅａｒｅｄｕｃｅｔｈｅｖｉｔａｌｉｔｙ．Ｉｎｏｔｈｅｒｗｏｒｄｓ，５－ＨＴｌＡＢｍｒｅｃｅｐｔｏｒｈａｓｏｆｔｈｅｖｉｔａｌｉｔｙｓｉｌｋｗｏｒｍ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｗｅｎｅｒｖｅｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔ５－ＨＴｌＡＢｍｒｅｃｅｐｔｏｒｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｆｆｅｃｔｏｎｓｉｇｎａｌｓ．５－ＨＴｌＡｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔｈａｖｅｌｉｔｔｌｅｓｉｌｋｗｏｒｍ，ｗｅｓｐｅｃｕｌａｔｅｔｈａｔｔｈｅａｇｏｎｉｓｔｏｆｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ５－ＨＴｌＡｒｅｃｅｐｔｏｒｈａｓｗｅａｋｂｏｎｄｓｔｒｅｎｇｔｈｆｏｒ５－ＨＴｌＡｒｅｃｅｐｔｏｒｏｆｉｎｓｅｃｔｓａｒｅｓｏｓｉｌｋｗｏｒｍｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｆｒｏｍｗｈａｔｈａｓｂｅｅｎｄｉｓｃｕｓｓｅｄａｂｏｖｅ，ｔｈｅｒｅａｒｅｆｏｕｒｋｉｎｄｓｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｓｇｅｎｅｓｉｎ５－ＨＴＩＡＢｍ，５－ＨＴｌＢＢｍ，５－ＨＴ２Ｂｍ，５－ＨＴ７Ｂｍ．Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｗｈｉｃｈｍａｙｂｅｉｓｓｉｌｋｗｏｒｍ，ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｏｆｔｈｅｍｈａｖｅｓｏｍｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔ５?ＨＴｌＡＢｍｒｅｃｅｐｔｏｒｈａｓｂｅｅｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｖｉｔａｌｉｔｙｏｆｓｉｌｋｗｏｒｍ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｉｌｋｗｏｒｍ；５－ＨＴ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｂｅｈａｖｉｏｒＶＩＩ西南大学硕士学位论文ＶＩＩＩ第１章文献综述第１章文献综述１．１５．ＨＴ５．羟色胺（５－ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ，５．ＨＴ），又名血清素（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ），是一种生物单胺类神经递质和调质。５－ＨＴ的化学结构包含一个芳香族氨基酸核心和一个由２个碳原子组成的脂肪链（图１Ａ）。在哺乳动物中，色氨酸在色氨酸羟化酶（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＴＰＨ）的催化下生成５一羟色氨酸（５．ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，５－Ｈ四），５－ＨＴＰ在芳香族氨基酸脱羧酶（ＡｒｏｍａｔｉｃＡｍｉｎｏＡｃｉｄＤｃｃａｒｂｏｘｙｌａｓｃ，ＡＡＤＣ）的作用下生成５－ＨＴ，其中ＴＰＨ是５－ＨＴ合成的限速酶¨１。ＴＰＨ有两个亚型，ＴＰＨｌ主要在外周神经中表达，ＴＰＨ２主要在中枢神经中表达也３１。５－ＨＴ是一个很古老且保守的生物小分子，在自然界中，５－ＨＴ分布极其广泛，如在香蕉、草履虫、果蝇、人类等生物中都含有５－ＨＴ１４．５１。５－ＨＴ同时是一个重要的生物信号分子，它在动物生理上发挥着重要作用，包括发育、感觉、行为、认知、记忆等都与５－ＨＴ有关晦盯。１．１．１５．ＨＴ的发现历史１８６８年，ＩｒｖｉｎｃＰａｇｅ和其同事在血液中发现了一种由血小板释放，能使血管收缩的物质，他们将其特征和性质进行了分析，并根据其性质将其命名为“血清素”。在１９３０年，意大利学者Ｅｒｓｐａｍｅｒ在哺乳动物的胃和肠粘膜、章鱼的唾液腺中发现了一种复合物，这种复合物能使鼠的子宫平滑肌收缩，后来证明该物质就是血清素。随着科学技术的进步，１９４６年，血清素首次用化学方法合成得到，这更是推动了关于血清素的研究，Ｅｒｓｐａｍｅｒ等随后证明了血清素的化学结构为５－ＨＴ（图１．１Ａ）。在此之后关于５－ＨＴ的研究进入了高潮，在１９４６年到１９４９年间，关于５－ＨＴ的研究论文达到了９００００篇之多。在１９５０年，Ｇａｄｄｕｍ发现５－ＨＴ在肠中的活性可以被迷幻剂麦角酸（ＬＳＤ）抑制，这对５－ＨＴ的研究具有重要的贡献，这为５－ＨＴ的神经药理学研究奠定了基础，而后ＬＳＤ被证明含有与５－ＨＴ相似的分子结构（图１．１Ｂ）。随后不久，ＪｕｌｉｕｓＡｘｅｌｒｏｄ等发现５－ＨＴ同样也在脑中存在，并开始着手关于５－ＨＴ的药理学研究。此外，已有研究证明５－ＨＴ与一些精神病息息相关，且它对精神方面的健康十分重要。由此，研究者们开始转向５－ＨＴ类神经疾病的药物研究，如抗抑郁药物类。１９７１年，Ｇｒａｈａｍｅ－Ｓｍｉｔｈ发表了一篇关于行为综合征的论文，文中提到向老鼠体内注射色氨酸或者一元氨氧化酶的抑制剂可导致老鼠的行为异常。进一步研究证明，５一甲氧基．２．甲基色胺可作为５－ＨＴ的激动剂调节老鼠的一些行为。基于这项研究结果的启发，研究者们对脑内５－ＨＴ含量变化进行了研究，结果表明，５－ＨＴ在脑内的含量变化并非总能导致行为异常，但发现一些行为的异常与５－ＨＴ受体有很密切的联系，而后的研究主要集中于５－ＨＴ受体及其药理学方面㈨３?１４?１５ｌ。西南大学硕士学位论文（Ａ）（Ｂ）Ｅｔ２ＮＯＧＨ孓ＨＴＬＳＤＨ图１．１Ｆｉｇｕｒｅ１．１５－ＨＴ和ＬＳＤ的化学结构组成‘９１Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ５－ＨＴａｎｄＬＳＤ１．１．２５－ＨＴ的合成代谢５．ＨＴ的合成主要包括两个反应步骤：首先，色氨酸在色氨酸羟化酶（四Ｈ）的催化作用下变成５．羟色胺酸（５－ＨＴＰ），这一步是５－ＨＴ合成的限速步骤，该步反应中催化酶的活性直接决定了５－ＨＴ的生成量。而后，５．羟色胺酸经过芳香族氨基酸脱羧酶（ＡＡＤＣ）的作用，转变成５－ＨＴ（图１．２）。在哺乳动物中，ＴＰＨ基因包含两个亚型ＴＰＨｌ和ＴＰＨ２。ＴＰＨｌ主要在外周组织表达，人类肠道通过ＴＰＨｌ催化产生９５％的５－ＨＴ，然后再经血小板将５－ＨＴ运送到身体的其他外周组织。由于５－ＨＴ不能通过人体的血脑屏障，所以脑中的５－ＨＴ主要由ＴＰＨ２催化合成¨叩。在果蝇中，同样存在２种可编码色氨酸羟化酶的基因：ｄＴＰＨ和ｄＴＲＨ。这两个基因在体外实验中均有色氨酸羟化酶活性，但同样ｄＴＰＨ主要在非神经组织表达，而ｄＴＲＨ主要是在神经组织中表达川１。其他一些昆虫中同样存在这两个基因亚型。ＡＡＤＣ可以催化５－ＨＴＰ转化为５－ＨＴ，同时它还与多巴胺的生物合成有关。ＡＡＤＣ主要在一些血清素能和多巴胺能的神经细胞中表达¨羽。５－ＨＴ的分解主要由单胺氧化酶（ｍｏｎｏａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ，ＭＡＯ）来完成，它可催化单胺类物质脱胺反应，主要存在于脑、分泌腺、肝脏等组织中１９１２

第１章文献综述ＯＨＬ－ＴｒｙｐｔｏｐｈａｎＴＲＨ。ＴＰＨ５－Ｈｙｄｒｏｘｙ－Ｌ．ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（５－ＨＴＰ）Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ１５－ＨＴ）图１．２Ｆｉｇｕｒｅ１．２５－ＨＴ合成途径‘１２１Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｏｆ５－ＨＴ１．１．３５－ＨＴ的功能５－ＨＴ主要在动物的神经系统存在，参与调控动物的某些行为习惯。在哺乳动物中，５．ＨＴ主要与动物的焦虑、抑郁、攻击性、自杀倾向等一些精神病相关，但５－ＨＴ也可作为一种调质参加一些生理反应，如血管、胃肠道等收缩、动物的排泄、一些器官组织的发育等眇１。在昆虫中关于５－ＨＴ的研究较晚，但也取得了一些进展。５－ＨＴ同样可以影响昆虫的行为活动，参与一些行为的调控。５－ＨＴ可以参与昆虫的生物节律的调控，同时研究表明５－ＨＴ与果蝇的学习和记忆也是密不可分的¨６’１＂，对果蝇的另一项研究也证明了５－ＨＴ在其求偶交配的过程中具有重要的意义。而对于家蚕的研究也表明了５．ＨＴ在家蚕接受外界激素刺激的信号传导方面发挥着重要的作用，且５－ＨＴ在蛾触角中的大量存在同样印证了５－ＨＴ在家蚕某些行为中发挥的重要作用。另一方面，５－ＨＴ同样对昆虫的一些生理代谢具有重要作用。对粘虫的研究表明，促咽侧体素和５－ＨＴ可以相互调节背血管的收缩，它与５．ＨＴ在哺乳动物血管中的功能相似。一些研究中，发现５－ＨＴ还参与了昆虫某些器官的发育，如神经元、卵巢等的发育成熟‘１８?１９－２０一。西南大学硕士学位论文１．２５－ＨＴ受体５－ＨＴ对于生物体具有重要的作用，然而５－ＨＴ在生物体中要发挥功能主要是通过其特异受体介导来完成。随着现代分子生物学技术的发展，目前已经被克隆鉴定的５－ＨＴ受体有７个家族，共１４种，分别是１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ（１家族）：２Ａ、２Ｂ、２Ｃ（２家族）；３；４；５Ａ、５Ｂ（５家族）：６：７。５－ＨＴ受体均属视紫红质样受体，除５－ＨＴ３受体是配体门控离子通道受体以外，其他５一ＨＴ受体都是Ｇ蛋白偶联受体。Ｇ蛋白偶联受体具有典型的７次跨膜结构域，３个胞外环和３个胞内环。５－ＨＴ受体可调节胞内的第二信使物质ｃＡ！ＶＩＰ、ＩＰ、Ｃａ２＋、ＡＣ等的释放，从而激活胞内的级联反应，进而行使功能‘２１’２”。１．２．１５－ＨＴｌ受体家族５－ＨＴｌ受体家族是最大的一类５－ＨＴ受体家族，包括５个亚型（１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ）。该家族受体对５－ＨＴ具有高度的亲和力，但这类受体活性能被甲硫替平、二甲麦角新碱抑制。由于这个家族受体的氨基酸序列、药理学性质相似性较高，并且它们能特异的耦合对百日咳毒素敏感的Ｇ蛋白亚基Ｇｉ／ｏ致使腺苷酸环化酶活性被抑制，所以将其归为一个家族。１．２．１．１５－ＨＴＩＡ受体５－ＨＴｌＡ是目前研究较多，且较早克隆的５－ＨＴ受体。５－ＨＴｌＡ受体最先是在人类中克隆得到，它主要存在于人的脑、脾脏、肾脏中，且该受体和Ｄ２肾上腺素受体很相似，具有典型的配体结合特征。在鼠体内有两种不同的５－ＨＴＩＡ受体，它们存在于不同的部位，而其蛋白序列仅在第３个胞内环有一个氨基酸的差异眈¨。５－ＨＴｌＡ受体不但可以作为自受体，而且还是突触后受体，５－ＨＴ作用于５ＨＴｌＡ受体，活化内部的钾离子通道，导致神经元细胞膜的去极化，实现信息的传递。５－ＨＴｌＡ可促进乙酰胆碱、去甲肾上腺素等激素的释放，而在一些组织中还会导致５－ＨＴ、谷氨酸、生长素含量的降低”３’３射。１Ａ受体与一些行为、痛觉、情绪调节具有很密切的联系。实验显示，敲除１Ａ受体基因的小鼠会表现出焦虑、抑郁，同时，小鼠还会出现摄食过量、体温调节失常等特征。最近的文献报道还表明，５－ＨＴｌＡ受体还参与小鼠的认知过程，对小鼠施用５－ＨＴｌＡ受体抑制剂和激动剂会使小鼠表现出不同的认知能力。如果将５－ＨＴｌＡ受体基因敲除，小鼠会缺乏对恶劣环境的认知能力，而过量表达１Ａ受体的小鼠相较于一般小鼠，却具有更好识别能力日４’３钉。此外，一些体外实验表明添加５．ＨＴｌＡ受体激动剂可以促进神经细胞的发育成熟，由此推测该受体可能还与动物的记忆能力相关。将１Ａ受体导入到成纤维细胞后，添加５－ＨＴ也可促进细胞的有丝分裂；Ａｂｄｕｌ等在另一项体外实验中发现，５．ＨＴｌＡ受体拮抗剂可显著降低前列腺癌细胞的增值作用。通过以上４第ｌ章文献综述两个实验推测ｌＡ受体可能还与细胞的增殖有关ｕ刀。５－ＨＴｌＡ受体中的一些氨基酸对于该受体发挥功能具有重要的意义，如在人类５－ＨＴｌＡ受体３８５位的天冬氨酸残基作为配体的结合位点对于该受体是非常重要的。同样被证明的位点还有Ａｓｐ８２、Ａｓｐｌ１６、Ｓｅｒｌ９８、Ｓｅｒ３９３、Ａｓｎ３９６，这些位点对于人类５．ＨＴｌＡ受体激动剂和拮抗剂的结合都是不可或缺的ｎ４２钉。因此这些特异的氨基酸对于新药的开发具有重要作用。现今已经被发现和应用的激动剂有８－ＯＨ．ＤＰＡＴ、丁螺环酮、氟辛克生等，这些物质可以有效的增加ｌＡ受体的活性，另外１Ａ受体的拮抗剂有ＷＡＹｌ００６３５、罗巴佐坦、ＷＡＹｌ０１４０５，其中ＷＡＹｌ００６３５是ｌＡ受体的特异拮抗剂。他们大多数已经成为商品化的药物用于治疗一些人类疾病，如抑郁症、神经分裂等ｕ¨。５－ＨＴｌＡ受体可激活某些细胞内的磷脂酶Ｃ、抑制腺苷酸环化酶的活性，但由于没有在组织中对它进行深入研究，所以ＩＡ受体与这些信号通路偶联的生理学意义还不是很清楚。５－ＨＴｌＡ受体介导的磷脂酶Ｃ信号通路在ＨｅＬａ、ＬｔＫ．、ＣＨＯ细胞中研究较多。在对ＨｅＬａ细胞的研究中发现，磷脂酶ｃ的激活依赖于受体的密度。当５－ＨＴｌＡ受体具有较高密度时，伊沙和丁螺环酮类似化合物可作为该受体的激动剂，激活该受体信号通路。相反，如果受体存在的密度较低，那么这些化合物就无法激活磷脂酶Ｃ眩¨。而对ＬｔＫ－细胞的研究发现５－ＨＴ可以激活较低数量的受体来活化磷脂酶Ｃ，在较高的受体密度下却无法激活‘２刀。这两完全相反的实验结果可说明在不同的细胞系中５－ＨＴＩＡ受体的功能也许是有差异的。磷脂酶Ｃ和腺苷酸环化酶耦合不同Ｇ蛋白亚基导致了他们具有不同的被调节机制。实验也证明了在ＨｅＬａ细胞中表达的５－ＨＴ受体优先与Ｑ蛋白亚基耦合，这可以抑制腺苷酸环化酶并且激活磷脂酶Ｃ。而在后续的一些对ＨｅＬａ、ＣＨＯ．Ｋ１细胞的研究中发现，５－ＨＴｌＡ与腺苷酸环化酶抑制作用之间的关系可能是由Ｇａｉｌ、Ｇａｉ２、Ｇａｉ３所决定，并且相关的Ｇ蛋白的表达水平直接影响了腺苷酸环化酶的偶联反应他８。２＂。由此，一些研究者们认为该受体对百日咳毒素敏感的特性可能是由５－ＨＴｌＡ偶联磷脂酶Ｃ的能力所决定，而与腺苷酸环化酶本身无关。５－ＨＴｌＡ受体不仅可参与磷脂酶Ｃ信号相关通路，同时该受体还与蛋白激酶ｃ的调节、Ｎａ＋／Ｋ十．ＡＴＰ酶的活化相关‘３０’３１１。１．２．１．２５－ＨＴＩＢ受体人类５．ＨＴｌＢ受体由３９０个氨基酸组成，主要在基底神经节中表达（特别是黑质、苍白球、纹状体）。５－ＨＴｌＢ不仅可作为５－ＨＴ能神经元的自受体，同时他还可以作为ｔ氨基丁酸、乙酰胆碱和谷氨酸能神经元的异受体玎７‘３８１。体外实验表明，ｌＢ受体可以调节多巴胺（ＤＡ）、乙酰胆碱（ＡＣｈ）、谷氨酸、Ｙ．氨基丁酸（ＧＡＢＡ）、去甲肾上腺素（ＮＡ）的释放。另外一些研究还证明了，ｌＢ受体可以促进催乳素、皮质醇、肾素的分泌。脑中５－ＨＴｌＢ受体的活性与一些神经活动息息相关，可调节动物的一些行为活动。当对小鼠注射１Ｂ激动西南大学硕士学位论文剂时，小鼠将变得不活跃、抑郁，而敲除１Ｂ受体基因的小鼠会更加积极活跃，甚至表现出强烈的攻击性。但是敲除ｌＢ受体基因的小鼠相比于正常小鼠具有更强的学习能力。此外，据研究，５－ＨＴｌＢ还与药物成瘾现象相关。５－ＨＴｌＢ受体不止与动物的行为相关，对神经胶质细胞的研究发现，ｌＢ受体也可以促进细胞的生长‘３４‘３９’４０’４１?枷。像所有５－ＨＴｌ受体家族的其他成员一样，ｌＢ受体同样可以抑制腺苷酸环化酶的活性。这种抑制作用可以被ｌＢ受体拮抗剂所打断，如甲硫唾庚嚓、百日咳毒素，这说明该受体也是与Ｇ蛋白亚基Ｇｉ／Ｇｏ相偶联的。ｌＢ受体不但可以负调控腺苷酸环化酶，而且在Ｌｔｋ．细胞中，ｌＢ受体还可以提高胞内Ｃａ２＋离子和肌醇磷脂的水平。而后来研究者们证明１Ｂ可以同时参加ｃＡＭＰ和Ｃａ２＋离子信号通路途径‘４３?２柏。目前已经发现１Ｂ受体激动剂有阿莫曲坦、依立曲坦等曲坦类，拮抗剂有ＡＲ－Ａ００００２，ＧＲ５５５６２，ＧＲ１２７９３５等，而曲坦类药物现已被用于治疗偏头痛。１．２．１．３５－ＨＴＩＤ受体５－ＨＴｌＤ与５－ＨＴｌＢ有很多相似性，如人类的１Ｂ和１Ｄ受体的氨基酸序列的相似度可达９３％，他们不但具有相似的药理学性质，且他们在脑中的分布也十分相似。１Ｄ受体首先在狗中克隆得到，编码３７４个氨基酸‘２¨。相对于５－ＨＴｌＢ受体而言，该受体表达量极低，所以对其表达进行定位较困难。利用原位杂交实验发现１Ｄ受体ｍＲＮＡ在脑许多区域存在，如纹状体、嗅皮质、中缝背核等。利用１Ｄ特异的荧光标记配体进行检测，能在脑的苍白球、腹侧苍白球、黑质观察到１Ｄ受体蛋白的存在，但是在该区域却没有检测到１Ｄ受体的ｍＲＮＡ。５－ＨＴｌＤ受体与许多人类疾病相关，如偏头痛、厌食和神经衰弱等。在猪的研究中发现，１Ｄ受体在抑制脑膜神经性炎症和神经损伤中具有重要作用，并且神经性炎症刺激被认为是偏头痛的一个可能的原因，这说明了ＩＤ受体可能与偏头痛具有一定的相关性。这些研究结果与１Ｄ存在于人类和其他哺乳动物三叉神经细胞的神经纤维中是相符的，事实上免疫组化分析表明ｌＢ、１Ｄ受体都存在于人的三叉神经处，所以１Ｄ受体关于偏头痛的推测还需进一步的实验验证。ｌＤ受体可参与一些物质的调控，如在人的心脏中可能参与调控５－ＨＴ的释放。１Ｄ受体的蛋白活性是可由生物体自身调节的，有报道指出生物体内存在一种４肽类物质Ｌｅｕ＿ｓｅｒ＿Ａｌａ－Ｉ觑】，这种４肽可以与１Ｂ、ｌＤ受体蛋白结合，调节其活性Ｈ５。４”。１Ｄ受体同样具有一个很清楚的第二信使系统。它可以通过结合对百日咳毒素敏感的Ｇｏ蛋白抑制腺苷酸环化酶的活性。研究表明人类该受体可能还与胞内Ｃａ２＋和肌醇磷酸的浓度相Ｍ［４６１７Ｃｏ对于５－ＨＴｌＢ受体和５－ＨＴｌＤ受体的鉴别现在已经比较容易了，他们的选择性配体结合位点不同，如ＳＢ２１６６４１可以特异的与ｌＢ受体结合，ＢＲＬｌ５５７２可以与１Ｄ受体特异结合。舒马曲坦类可以与１Ｄ受体结合，是现今用于治疗偏头痛的最主要的药物，但它不具有特异６第ｌ章文献综述性，它还可作用于ｌＢ受体。曲坦类药物可以促进血管的收缩，而一些实验表明特异的ｌＤ受体激动剂并不能导致血管的收缩加剧，这就说明了导致血管收缩主要是曲坦类药物作用于ｌＢ受体的结果，而不是ｌＤ受体。ＰＮＵ．１４２６３３，１Ｄ的特异性激动剂的单独使用也并不能改善偏头痛的症状。这两个研究结果也暗示了类似曲普坦类的药物治疗偏头痛的机制还需进一步的研究‘２２?枷。１．２．１．４５．ＨＴＩＥ受体ｌＥ受体是继１Ａ、１Ｂ受体之后发现的又一５－ＨＴｌ家族受体。１Ｅ受体最早是在人类的侧额叶中被鉴定出的，由于当时所用的检测物缺乏特异性，所以研究者们在很多位置都发现了该受体。到目前为止，研究者们依然没有找到一个特异的１Ｅ选择性配体用于实验研究。人类５－ＨＴｌＥ含有３６５个氨基酸，该受体同样抑制腺苷酸环化酶的活性，但是它的抑制作用仅有其他ｌ家族受体效能的５０％左右‘４钉。利用放射自显影技术发现１Ｅ受体主要存在于人的皮质、屏状体、海马回等部位。对人和猴的脑进行原位杂交实验发现，１Ｅ的ｍＲＮＡ主要存在于皮质、尾壳、杏核等部位。ｌＥ受体在人类和猴等灵长类动物的脑中研究较多，而５－ＨＴｌＥ受体是否存在于啮齿类动物（如小鼠）中，目前尚未发现，这就为该受体的功能研究设置了很多障碍‘４７’４８４＂。另外，５－ＨＴｌＥ受体缺乏一个特异的配体对它进行研究，这更是增加了受体功能研究的难度，所以关于它的功能研究还比较缺乏。在哺乳动物细胞中表达的５－ＨＴｌＥ受体对一些物质具有一定的亲和性，如二甲麦角新碱、麦角胺、酮色林，但是这些物质不仅与５－ＨＴｌＥ受体特异的结合，他们同时还对其他一些５．ＨＴ受体具有亲和力，如５－ＨＴｌＦ受体ｍ１。１．２．１．５５－ＨＴＩＦ受体５．ＨＴｌＦ是目前发现的５－ＨＴｌ受体家族中的最后一个亚型。５－ＨＴｌＦ最早是在小鼠中发现的，而后不久在人类中也发现了１Ｆ受体的存在‘５０’５１１。人类１Ｆ受体主要由３６６个氨基酸组成，同样它也与Ｇｉ／ｏ蛋白相偶联抑制腺苷酸环化酶的活性ｂ３’５钔。由于该受体的药理学特性与５．ＨＴＩＥ很相似，并且它与１Ｅ的氨基酸序列相似度达到了７０％，所以它也被称为５．ＨＴｌＥｐ。虽然１Ｆ与１Ｅ具有很相似的药理学特性，但是它们在脑的ｍＲＮＡ表达的位置却十分不同Ｈ２‘５＂。原位杂交实验表明，１Ｆ受体ｍＲＮＡ在猪脑的嗅觉皮层、嗅前核、齿状回、扣带回等处高量表达。利用放射自显影方法对５－ＨＴｌＦ受体定位发现，该受体蛋白大量存在于皮质和海马区域、屏状核、尾状核等区域。利用１Ｆ的特异性放射性配体［３Ｈ］ＬＹ３３４３７０对ｌＦ在脑中的分布进行探究也得到了同样的结果＂蚰。对１Ｆ受体的细胞水平研究发现１Ｆ可以抑制腺苷酸环化酶活性，并且可以激活磷脂酶Ｃ和影响Ｃａ２＋的流动‘５４１。７

西南大学硕士学位论文在对偏头痛的模式动物猪的研究中发现，１Ｆ在神经性炎症反应中具有重要作用。神经性炎症反应可能引发偏头痛，那么１Ｆ是否与偏头痛相关，现在还不能确定。但有报道指出，治疗偏头痛的药物舒马曲坦和那拉曲坦不但与５－ＨＴｌＢ＼ＩＤ受体有亲和力，对１Ｆ同样具有很强的亲和力，这也许能为ｌＦ受体与偏头痛之间的关系提供线索巧５’５６１。虽然现今依然没有获得缺乏５－ＨＴｌＦ受体的突变小鼠，且关于这个受体的功能研究也还不是很深入，但是１Ｆ具有特异的激动剂ＬＹ３３４３７０，也许可以为研究作出一定贡献巧７。５８１。１．２．２５－ＩＴＴ２受体家族５－ＨＴ２受体家族包含三个亚型：２Ａ、２Ｂ、２Ｃ，这三个亚型的氨基酸序列具有５０％的相似度。５－ＨＴ２家族成员优先与Ｇｑ蛋白亚基结合，参与肌醇磷脂信号转导途径。５－ＨＴ２受体可以提高肌醇磷脂和细胞溶质Ｃａ２＋的含量，且该家族与肌肉的收缩和大脑中激素的释放有关。１．２－２．１５－ＨＴ２Ａ受体人类５－ＨＴ２Ａ受体基因编码４７１个氨基酸，据研究，编码该受体的基因在染色体上的分布是５－ＨＴ２受体家族中最复杂的一个。５－ＨＴ２Ａ在中枢神经系统中分布很广，在皮质、屏状体、海马回、下丘脑、基底神经节表达量最高。５－ＨＴ２Ａ受体能在多巴胺、Ｙ．氨基丁酸、谷氨酸和乙酰胆碱能神经元中表达，充当突触异受体。５－ＨＴ２Ａ被证明是神经化学和行为应答中的重要物质。在脑部的一些区域，５－ＨＴ２Ａ受体可促进神经元的去极化，实现神经信号的传递。活体微量透析实验表明５－ＨＴ２Ａ对ＤＡ、谷氨酸、ＧＡＢＡ的释放具有促进作用，但同时会抑制ＮＡ的释放＂９‘６∞。在啮齿类动物的行为学研究中发现，５－ＨＴ２Ａ亦可促进催产素、肾素、催乳素、促’肾上腺皮质激素（ＡＣＴＨ）、皮质醇的释放Ｍ¨。小鼠５－ＨＴ２Ａ基因敲除实验证明，该受体与小鼠的焦虑和抑郁有一定联系，但具体机制还不清楚。５－ＨＴ２Ａ受体除了与焦虑、抑郁、精神分裂相关，它还与平滑肌的收缩、血小板的凝集、抽搐、颤抖、求偶等行为密不可分‘６２?２”。在测定细胞磷脂酰肌醇二磷酸的过程中发现，２Ａ受体具有活化磷脂酶Ｃ的能力，并且它还可介导Ｃａ２＋的转移。在小鼠体细胞中，２Ａ受体还可参与Ｎａ＋、Ｋ＋、ｃｌ一的协同运输。然而，有研究报道指出５－ＨＴ２Ａ还可通过激活腺苷酸环化酶或者活化磷脂酶Ａ２促进某些细胞内源性物质的表达¨３埘’６钉。先前的一些研究报道已经说明了，细胞分裂分化与磷脂酶Ｃ和蛋白酶ｃ的活性相关，在对ＮＩＨ．３Ｔ３细胞的研究中证实２Ａ受体可以刺激细胞的分裂，这也许与磷脂酶Ｃ的活化相关。而在仓鼠细胞的研究中表明，虽然２Ａ受体与纤维原细胞生长因子共同作用下可以诱导ＤＮＡ的合成，但它并没有刺激细胞的分裂（虽然磷脂酶Ｃ活性提高了）１６６１。由此看来，２Ａ受体有许多功能，但在不同的细胞类型中２Ａ受体的功能可能不一样。对２Ａ受体的药理学研究也说明了，在不同细胞中２Ａ受体对同一激动剂或者拮抗剂的结第１章文献综述合浓度不一样。对５－ＨＴ２Ａ受体进行脱敏实验表明该受体的理化性质、功能在不同细胞类型中是有差异的‘６７１。用仓鼠的５－ＨＴ２Ａ受体在ＰＳ２００细胞系中表达会出现脱敏现象，而这种自然的脱敏现象与该受体的磷酸化相关，如果移除该受体上５个蛋白激酶Ｃ的磷酸化位点或者抑制蛋白激酶Ｃ的活性，那么导入到ＰＳ２００细胞系的２Ａ受体就不会出现脱敏现象。在细胞系中表达的２Ａ受体不但可以磷酸化，而且还可以发生内在化，但这种内在化并不是十分强烈¨引。另外，即使５－ＨＴ２Ａ受体发生了内在化也不会影响该受体的整个信号通路，其放射性配体的结合位点不会丢失，且该受体调控的下游物质也没有任何改变‘６９１。一些临床研究表明５－ＨＴ２Ａ受体拮抗剂和多巴胺Ｄ２受体拮抗剂类药物混合使用对精神分裂有较好的治疗效果，由此认为５－ＨＴ２Ａ可以作为治疗神经病药类的一个重要靶点。而现今对５－ＨＴ２Ａ受体具有高亲和力的激动剂和拮抗剂类药物（如奈法唑酮）的研究也可为以后治疗神经病类疾病提供很好的帮助‘６¨。目前已经发现了许多５－ＨＴ２Ａ的激动剂，如ＤＯＩ、ＤＯＢ、ＤＯＭ等。５－ＨＴ２Ａ的拮抗剂有４Ｆ４ＰＰ、Ｍ１００９０７。拮抗剂沙格雷酯可以作为抗血小板凝集剂在一些动脉血管疾病中运用，另外一些拮抗剂或者激动剂在治疗失眠方面也有较多应用＂叩。１．２．２．２５－ＨＴ２Ｂ受体５－ＨＴ２Ｂ受体也是较早发现的５－ＨＴ受体之一，人类５一ＨＴ２Ｂ受体包含有４８１个氨基酸。５－ＨＴ２Ｂ与基底平滑肌的收缩有关，这与５－ＨＴｌ家族受体较为类似，所以在早期，研究者们始终无法将其进行归类，最后研究者发现该受体蛋白更靠近５－ＨＴ２受体家族，故将其划分为５－ＨＴ２家族＂¨。２Ｂ受体的ｍＲＮＡ主要存在于老鼠的肠道、心脏、肺、血管等部位。利用免疫反应可以在鼠的脑中检测到５－ＨＴ２Ｂ类似受体，但该受体是否在脑中存在，目前还有较大的争议。相较于５．ＨＴ２家族的其他受体，虽然２Ｂ受体的ｍＲＮＡ和蛋白产物的表达量都较低，但是它在动物体内却具有不可替代的功能＂”。研究表明５－ＨＴ２Ｂ受体可能参与调节小鼠摄食，以及存在于小鼠颈静脉的内皮细胞中调节血管收缩＂”。敲除２Ｂ受体的小鼠会引起胚胎缺陷，如果过表达会显著影响小鼠的心血管系统，引起心脏肥大。不但如此，２Ｂ受体还与其他生理活动相关，如小肠肌肉的收缩，肿瘤的转化等＂钔。当用小鼠的５－ＨＴ２Ｂ基因在非洲爪蟾的卵母细胞中表达时，可以激活依赖Ｃａ２＋的氯离子通道，而后激活磷脂酶Ｃ，但是这个激活的效果不是非常显著…７５１。在一些哺乳动物的细胞中２Ｂ同样具有激活磷脂酶Ｃ的功能，激活的磷脂酶Ｃ可以刺激ｃＡ．ＭＰ的生成，形成细胞级联反应¨¨。关于５－ＨＴ２Ｂ的药理学研究也较多，ＢＷ７２３Ｃ８６可以作为５－ＴＨ２Ｂ的激动剂，但同时也对２Ａ、２Ｃ具有一定的亲和性。５－ＨＴ２Ｂ的拮抗剂有ＬＹ２７２０１５、ＳＢ２０４７４１，同样他们也与９西南大学硕士学位论文２Ａ、２Ｃ有较低的亲和性。因此，目前还未发现对２Ｂ特异性较高的激动剂和抑制剂‘７＂。１．２．２．３５．ＨＴ２Ｃ受体５－ＨＴ２Ｃ受体与５－ＨＴ具有高度的亲和性，以前被称为５－ＨＴｌＣ，后经研究证明其药理学特性、偶联信号通路、基因特征与５－ＨＴ２家族成员相似，所以将其归为５－ＨＴ２家族，改名为５－ＨＴ２Ｃ１７８１。人类５－ＨＴ２Ｃ受体含有４５８个氨基酸，在脉络丛中高量表达，主要是控制中枢神经系统与脑脊液的物质交换，而在人脑的中皮层、海马回、杏仁核、纹状体、黑质等处有低量表达。２Ｃ受体可在ＧＡＢＡ、谷氨酸、ＤＡ能神经元中充当异受体，且脑中的２Ｃ受体同样可以引起神经元的去极化。活体实验表明５－ＨＴ２Ｃ可以抑制ＤＡ、ＮＡ的释放，也有一些研究报道证明了２Ｃ受体可促进泌乳刺激素和血液中ＡＣＴＨ的释放。另外，２Ｃ受体还可以引起发热、食欲过剩、活动障碍、疼痛感知等行为‘７９’８伽。５－ＨＴ２Ｃ与５－ＨＴ２Ａ的药理学性质极其相似，所以目前关于２Ｃ许多的功能研究还具有很大的争议。但是通过基因敲除的方法，在鼠中的功能研究是可以确定的，如果敲除２Ｃ基因会导致鼠的饮食习惯改变，从而体重超标，而且还会出现癫痫、认知缺乏。在对癫痫病患者的研究中也表明了，该受体可能是治疗癫痫病的一个潜在靶标‘７¨。用非洲爪蟾卵母细胞作为载体表达５－ＨＴ２Ｃ来研究其功能发现，刺激５－ＨＴ２Ｃ受体会使胞内磷脂酶Ｃ被激活，并且之后会引起Ｃｌ。的流动。非洲爪蟾卵母细胞同时还被用以５－ＨＴ２Ｃ受体的Ｇ蛋白偶联研究，研究表明２Ｃ受体主要与Ｇｏ、Ｇｉ相偶联，并且它可以被磷脂酶Ｃ激活。同时，研究者们还发现５－ＨＴ２Ｃ同样还与胞内的Ｃａ２＋和Ｋ＋的流动相关‘８¨。当在培养基中加入２Ｃ受体激动剂时，５－ＨＴ２Ｃ受体可以介导５－ＨＴ促进纤维母细胞的发育，而该过程还伴随着磷脂酰肌醇二磷酸的水解哺刀。目前已经报道的５－ＨＴ２Ｃ受体激动剂有很多，如较常用的ＭＫ２１２、Ｒ０６０．０１７５，但是他们与２Ａ受体同样具有亲和力，所以他们不是２Ｃ受体的特异性激动剂。相较于以上两个激动剂，ＣＰ８０９１９１和ＷＡＹｌ６３９０９对２Ｃ受体的亲和力分别是其他受体的１００和６６倍，因此他们通常被视为２Ｃ的特异激动剂。而氯卡色林也是２Ｃ的激动剂，现已被临床试验用于治疗肥胖症。ＲＳｌ０２２２１和ＳＢ２４２０８４可以作为２Ｃ受体的高效拮抗剂‘８３?洲。１．２．３５－Ｉ－ＩＴ３受体５－ＨＴ３受体是５－ＨＴ受体家族中较特别的一类受体，该受体家族不是与Ｇ蛋白偶联，而是门控离子通道受体鸭钉。通过电子显微镜观察，可发现５．ＨＴ３受体主要由５个亚基形成一个中空环镶嵌于细胞膜上随酣。据报道，目前已被证明可以编码５－ＨＴ３受体的基因有２个：５－ＨＴ３Ａ可编码４８７个氨基酸，最初是从神经细胞瘤中克隆得到的，它与Ｃｙｓ—Ｃｙｓ环门控离子通道受体超家族中的其它受体具有很高的相似性，如ＧＡＢＡａ受体、甘氨酸受体。而关于１０第ｌ章文献综述该受体的电生理和放射性配体研究也是较多的１８７１。５－ＨＴ３Ｂ受体基因编码笋１个氨基酸，但其五聚体并没有活性，所以通常我们所说的５－ＨＴ３受体都属于３－ＨＴ３Ａ受体ｎ８‘８蚰。除了以上两类５－ＨＴ３受体亚型，有研究认为还存在５－ＨＴ３ＣｋＤｋＥ等受体，但是这些受体是否具有５．ＨＴ３受体的功能还存在许多争议眇们。通过放射自显影技术对小鼠进行研究发现，５－ＨＴ３受体主要在中枢神经系统中表达，它会通过调整Ｎａ＋、Ｋ＋、ｃａ２＋离子的流动，使神经快速的去极化。５－ＨＴ３受体在背侧迷走神经中也有较高水平的表达，而迷走神经与条件反射性呕吐的引发和调节相关，亦有相关报道证明，利用５－ＨＴ３受体拮抗剂可以明显抑制呕吐的发生。相较于背侧迷走神经，５－ＨＴ３受体在前脑的表达量较低。原位杂交实验显示５－ＨＴ３Ａ受体的转录本主要在鼠脑的梨状皮质、内嗅皮质、海马回区有表达，这个结果与放射性配体研究中５－ＨＴ３受体存在的位置一致四¨。在其他的一些物种中，５－ＨＴ３同时还在背侧根部神经节、三叉神经节中检测到分布。但是目前的技术水平检测到的５－ＨＴ３受体的分布大多都是５－ＨＴ３Ａ和５－ＨＴ３Ｂ共同表达的位置，无法区分蚴。５．ＨＴ３在自主神经元和感觉神经元细胞中均有表达，且在该区域表达的５．ＨＴ３受体的活力会显著影响心血管系统、肠道的蠕动和分泌活动‘９＂。实验表明５－ＨＴ３受体还可以介导５．ＨＴ促进胆囊收缩素、ＤＡ、ＧＡＢＡ、Ａｃｈ的生成，而降低谷氨酸的释放。在其他实验中发现５．ＨＴ３受体还可能与小鼠的认知、痛觉和感光等行为有关Ｄ４。７阳。目前已被发现的５－ＨＴ３受体激动剂有２．甲基．５．羟色胺和ＳＲ５７２２７等，其中ＳＲ５７２２７是该受体的高效特异性激动剂。关于５－ＨＴ３的拮抗剂也较多，如贝美司琼、贝美司琼、昂丹司琼等。一些拮抗剂现已被临床用于治疗呕吐、恶心、应激性肠道综合症等‘７跗。１．２．４５－ＨＴ４受体研究者们在培养小鼠神经元的实验中发现了一种新的受体，即５－ＨＴ４受体，该实验表明苯甲酰胺和托烷司琼（５．ＨＴ３受体拮抗剂）可以通过５－ＨＴ４受体增加腺苷酸环化酶的活性，而增加的腺苷酸环化酶活性又可以耦合Ｋ＋和Ｃａ２＋通道从而调节胞内Ｋ＋和Ｃａ２＋的浓度。这个实验导致当时的研究者们认为５－ＨＴ４受体可能与５－ＨＴ３受体有某种相关性，但后来的实验证明该想法是错误的，因为５－ＨＴ４受体为Ｇ蛋白偶联受体，而５－ＨＴ３受体却为典型的门控离子通道受体Ｄ５’９酣。但是通过以上实验也证明了托烷司琼可以作为一种拮抗剂同时打断５－ＨＴ３和５－ＨＴ４受体信号通路。５－ＨＴ４受体在被克隆之前就已经发现该受体在中枢和外围组织中存在，但早些年并不能很好的区分５－ＨＴ４受体，因为５－ＨＴ４和５－ＨＴ３以及其他的一些５－ＨＴ受体的分布形成了重叠。直到１９８０年ＰｒａｍｏｄＳａｘｅｎａ才从心血管中分离得到了５－ＨＴ４受体‘９¨。通过放射性配体发现５－ＨＴ４受体在人和小鼠脑中的分布十分相似，主要存在于黑质、腹侧苍白球、纹状体、西南大学硕士学位论文海马回、杏仁核等区域。已经有研究证明５－ＨＴ４受体和胆碱能受体共同存在于海马回区域，这也许预示着５－ＨＴ４的某一新的功能‘４５１。５－ＨＴ４受体基因被克隆后发现人类该受体的基因组结构非常复杂，该基因在基因组上有７００ｋｂ，包含３８个外显子。人类５－ＨＴ４受体基因通过不同外显子可以形成许多类型的拼接体，目前已被发现的５－ＨＴ４拼接体有５．ＨＴ４Ａ——５．ＨＴ４Ｓ，虽然５－ＨＴ４受体的拼接体如此之多，但他们的药理学特点、受体与配体的亲和性却没有太大差异。除５－ＨＴ４Ｄ仅在肠道中表达，其他类型拼接体的表达位置都非常的广Ｄ＂。敲除５－ＨＴ４受体的小鼠在正常的饲养环境中并不表现出行为异常，但是给予压力和新奇感刺激时，基因敲除小鼠的移动活力明显不如正常小鼠。而且敲除５－ＨＴ４受体的小鼠会对促惊厥物质戊四唑更为敏感，这也许与５－ＨＴ４受体在ＧＡＢＡ能神经元中表达有关。实验表明５－ＨＴ４还与记忆、抑郁、摄食相关‘９８。４５１。将５－ＨＴ４受体基因导入ＣＯＳ．７细胞进行表达发现，该受体可以激活腺苷酸环化酶，提高胞内ｃＡＭＰ的水平。但是通过实验表明，不同的５－ＨＴ４受体亚型之间的活力是有差异的，如５－ＨＴ４Ｌ激活腺苷酸环化酶的活力要比５．ＨＴ４Ｓ高得多。后有研究者指出导致５－ＨＴ４受体亚型之间活力差异的原因很有可能是该受体家族Ｃ端氨基酸对Ｇ蛋白耦合差异造成的眨”。目前市场上运用较多的５－ＨＴ４受体的激动剂有必利类药物，如扎考必利、西沙必利等，他们被用于肠胃疾病类的治疗。而５－ＨＴ４受体的的另外一些激动剂也正在被用于治疗老年痴呆‘７８】。１．２．５５－ＨＴ５受体家族５－ＨＴ５受体的功能目前的研究比较缺乏，该受体优先与Ｇｉ／ｏ偶联还是Ｇｓ偶联都还不确定。研究表明５－ＨＴ５受体家族可能存在两种亚型：５－ＨＴ５Ａ和５－ＨＴ５Ｂ，这两个亚型的受体的氨基酸序列的相似度有７０％。人类５－ＨＴ５Ａ受体具有３５７个氨基酸。重组人类５－ＨＴ５Ａ受体发现，该受体可以抑制腺苷酸环化酶的活性‘９＂。人类５－ＨＴ５Ｂ受体基因无法完整编码５．ＨＴ５Ａ受体蛋白，因为其编码序列中段含有一个终止密码子提前终止了蛋白的翻译¨ｏ∞。而鼠类５－ＨＴ５Ｂ受体基因可编码３７０个氨基酸¨们１。利用原位杂交实验验证了５－ＨＴ５Ａ受体ｒｎＲＮＡ在鼠、人脑中的分布。在小鼠脑中，５Ａ受体的转录本主要存在于脑皮层、齿状回、锥体细胞层等区域。在人脑中，主要分布于脑皮层、海马回、小脑等部分‘１０”。５．ＨＴ５Ａ受体敲除小鼠对新环境的探索能力会加强，并且对迷幻剂ＬＳＤ的反应降低，由此研究者们推测５－ＨＴ５Ａ受体可能与小鼠的适应性相关。另一研究也表明５－ＨＴ５Ａ受体的选择性拮抗剂对抗抑郁、治疗神经病有一定帮助，这也许与５Ａ受体在皮层区域高量表达有一定联系¨０３１。５－ＨＴ５Ａ受体的突变也会导致小鼠脑的发育异常，推测５Ａ受体可能还与脑的发１２

第１章文献综述育相关ｍ们。目前关于５－ＨＴ５受体的药理学研究也十分缺乏，仅有ＳＢ６９９５５１可作为该受体的拮抗剂【１０５ｌ１．２．６５．ＨＴ６受体很早以前，人们在检测脑纹状体中腺苷酸环化酶活性的时候发现了５－ＴＨ６受体，而此时５－ＨＴ受体家族还没有进行分类。克隆的人类５－ＨＴ６受体基因可编码４４０个氨基酸，且该受体与Ｇｓ蛋白亚基相偶联，正调节ｃＡＭＰ的生成‘１０酗。鼠和人类的５－ＨＴ６受体的ｍＲＮＡ主要在纹状体、杏仁核、海马回、脑皮层等脑区域表达，在周围组织中没有检测到５－ＨＴ６受体的表达。免疫组化研究表明５－ＨＴ６受体蛋白在纹状体、皮质含量较高，在杏仁核、海马回、小脑、下丘脑含量较低ｎ０７１。５－ＨＴ６可以调节谷氨酸、ＧＡＢＡ、多巴胺、和去甲肾上腺素的释放。利用５－ＨＴ６受体的拮抗剂进行研究发现，５－ＨＴ６主要与动物的学习和记忆相关‘７８?１０阳。在ＣＯＳ．７细胞系中表达５－ＨＴ６受体可以检测到腺苷酸环化酶活性的增加，但ｃＡＭＰ含量却并未发生变化，而其原因还不得而知。同样，在ＨｅＬａ细胞中也发现５－ＨＴ６受体是与腺苷酸环化酶的活性紧密相连的眨加。目前已有许多５－ＨＴ６受体的拮抗剂被用于老年痴呆的临床研究，如ＳＢ７４２４５７、ＳＡＭ．５３１等。而５－ＨＴ６受体的激动剂的研究较少，还未找到该受体的特异激动剂＂舳。１．２．７５－ＨＴ７受体研究者们在血管中发现了一种受体，该受体可以接受５－ＨＴ刺激使血管舒张，但是这个受体却不属于当时已经被知晓的５－ＨＴ受体家族中的任何一个。由于没有特异的药理学工具去定义这个受体，所以当时一直称该受体为类似５－ＨＴｌ受体。最后研究者们在鼠、猪和人类中克隆得到了该受体基因，将其命名为５－ＨＴ７受体。不同物种间５－ＨＴ７受体蛋白的相似度很高，最高可以达到９０％，但是５．Ｈ１’７受体与其它５－ＨＴ受体家族的氨基酸序列相似度却较低，不到５０％。人类５．ＨＴ７受体基因编码４７９个氨基酸，且该受体与Ｇｓ蛋白亚基偶联，正调控ｃＡＭＰ的形成。５－ＨＴ７受体还可以激活胞外调节蛋白激酶（ＥＲＫ）１４５１。编码５．ＨＴ７受体的基因可形成４种５．Ｈ１’７受体：５一ＨＴ７Ａ——５一ＨＴ７Ｄ，这些亚型具有不同的Ｃ端。虽然５．ＨＴ７具有４个受体亚型，但这些亚型的药理学和信号通路，以及他们的分布都比较类似【１０９ｌＯ５－ＨＴ７受体在血管组织中广泛存在，此外５．ＨＴ７还存在于非血管的平滑肌组织，如结肠等。一项研究指出５－ＨＴ７受体蛋白还在苍白球、腹侧苍白球、黑质部位存在，但是在该区域却未检测到５．ＨＴ７受体的ｍＲＮＡ１１１０１。１３西南大学硕士学位论文５－ＨＴ７可以介导５－ＨＴ对血管的刺激，致使血管出现明显的舒张作用。不但如此，５－ＨＴ７还与睡眠、生物节律、痛觉和情绪相关。对小鼠进行研究发现，使用激动剂和抑制剂，或者敲除小鼠的５－ＨＴ７受体基因都会对小鼠的体温造成影响‘１…１２?１１３１。而将５－ＨＴ７受体导入ＣＯＳ．７、ＣＨＯ、ＨｅＬａ等细胞系，可激活腺苷酸环化酶，提高胞内ｃＡＭＰ的含量眨柏。目前已合成的５－ＨＴ７受体激动剂有ＡＳｌ９、ＬＰｌ２、ＬＰ４４等，其中ＡＳｌ９是５－ＨＴ７受体的选择性激动剂。５－ＨＴ７受体的拮抗剂有ＳＢ２５８７１９、ＳＢ２６９９７０１７８１。１．３昆虫５－ＨＴ受体的研究概况５－ＨＴ和其受体在脊椎动物中存在且发挥着重要的功能，那么在昆虫中是否存在５．ＨＴ和其受体呢？随着５－ＨＴ受体研究热潮的兴起，昆虫学家们也开始着手昆虫５－ＨＴ及其受体的研究。研究者们发现在昆虫中同样存在５－ＨＴ和５－ＨＴ受体，研究表明５－ＨＴ和其受体在昆虫的一些组织中大量存在，且在中枢神经中发挥着重要功能。而关于５－ＨＴ受体，在昆虫中研究较早、较多且较深入的是模式生物果蝇，因此果蝇中关于５－ＨＴ受体的研究几乎可以代表整个昆虫界的相关研究概况ｕ川。１．３．１昆虫５－ＨＴ受体的归类和命名许多昆虫中都存在５－ＨＴ受体，但是随后研究者们发现昆虫５－ＨＴ受体与脊椎动物５－ＨＴ受体的氨基酸序列有较大的差异，这为昆虫５－ＨＴ受体的归类带来麻烦。随着被发现克隆的５．ＨＴ受体越来越多，昆虫５－ＨＴ受体的命名也越来越混乱。为了让昆虫５－ＨＴ受体的命名标准化，有的研究者建议用“受体类型＋物种名”来进行命名，如５－ＨＴｌＡＤｒｏ、５－ＨＴ７Ｄｒｏ川们。虽然昆虫５－ＨＴ受体的命名可规范，但是昆虫５－ＨＴ受体的分类还存在另一问题：大多数克隆的昆虫５－ＨＴ受体缺乏相关功能和药理学研究，都是基于生物信息学的比对结果进行分类，而有的５－ＨＴ受体亚型之间氨基酸序列相似度非常高，如５－ＨＴｌＢ和５－ＨＴｌＤ，这就有可能形成错误的分类。１．３．２果蝇５－ＨＴ受体的研究现状果蝇是开始研究５－ＨＴ受体最早的昆虫，也是现今研究较为全面深入的昆虫。５－ＨＴｄｒｏ受体是昆虫中第一个被克隆的５．ＨＴ受体。该基因在基因组上没有内含子，编码５６４个氨基酸，蛋白序列具有８次跨膜结构，主要在果蝇头部表达Ⅲ钉。５．ＨＴｄｒｏ受体蛋白的Ｎ端具有一个甘氨酸．丝氨酸重复序列，该序列是葡糖氨基葡聚糖的结合位点，而同源的重复序列在果蝇的时钟基因ｐｅｒ和脉孢菌的基因中都存在，这说明５－ＨＴｄｒｏ可能参与生物节律的调控。５．１４第ｌ章文献综述ＨＴｄｒｏ蛋白与Ｇ蛋白偶联受体蛋白具有很高的相似性，且与人类５－ＨＴｌＡ受体的相似度较高，所以当时将该受体归为５－ＨＴｌＡ。将５－ＨＴｄｒｏ蛋白导入老鼠ＮＩＨ．３Ｔ３细胞表达时，５－ＨＴ可以通过该受体活化腺苷酸环化酶产生ｃＡＭＰ。该实验还对不同激动剂与５－ＨＴｄｒｏ亲和效率进行了研究，研究表明５－ＨＴ的亲和力最高，２．甲基．５．色胺和ＬＳＤ的亲和力较低，而没有检测到８－ＯＨ．ＤＰＡＴ与５－ＨＴｄｒｏ受体结合ｕ１们。而在另一项关于５－ＨＴｄｒｏ（在该研究中称为５．ＨＴｄｒ０１）的药理学研究中发现，在ＣＯＳ．７细胞中，ＬＳＤ对５－ＨＴｄｒｏ受体却有很高的亲和力，一些物质与５－ＨＴｄｒｏ亲和力高低的顺序为：麦角隐亭＞布他拉莫二甲麦角新碱＞５．ＨＴ＞哌唑嗪＞布他拉莫育亨宾＞８．ＯＨ．ＤＰＡＴ［１１６１。虽然研究初期一致认为５－ＨＴｄｒｏ与人类１Ａ受体比较类似，但是随后的比对发现５－ＨＴｄｒｏ的跨膜区与鼠和人类的５－ＨＴ７受体的相似度分别为５６％、５７％。５－ＨＴｄｒｏ受体、哺乳动物５．ＨＴ７受体都是正调控腺苷酸环化酶的活性，且研究也表明５－ＨＴｄｒｏ受体与哺乳动物５－ＨＴ７受体具有相类似的功能，可能调节神经活动、生物节律。所以最终将５－ＨＴｄｒｏ改名为５－ＨＴ７ｄｒｏ１９４｝。在人类５－ＨＴ７的药理学研究中发现一些物质对受体的亲和力为：甲硫替平＞５．甲基．色氨酸＞甲麦角林＞５一ＨＴ＞８．ＯＨ．ＤＰＡＴ。然而这些物质对于５－ＨＴｄｒｏ的亲和力也不一样，特别是８－ＯＨ．ＤＰＡＴ对５－ＨＴｄｒｏ的亲和力非常小，这更能说明５．ＨＴｄｒｏ属于５－ＨＴ７受体，而不是５．ＨＴｌＡ受体…¨。５－ＨＴｄｒ０２Ａ、５．ＨＲ的２Ｂ是继５．ＨＴ（ｈ之后克隆的基因，５－ＨＴｃ№２Ａ基因编码８３４个氨基酸，５．ＨＴｄｒ０２Ｂ基因编码６４５个氨基酸Ⅲ叫。５－ＨＴｄｒ０２Ａ和５－ＨＴｄｒ０２Ｂ基因在果蝇胚胎和成虫的中枢神经系统中均有表达。同样将５－ＨＴｄｒ０２Ａ、５－ＨＴｄｒ０２Ｂ受体基因导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞表达发现，当５－ＨＴ作用于这两个受体时，它们均可抑制腺苷酸环化酶的活性。这两个受体同样可以激活磷脂酶Ｃ的活性，增加肌醇磷脂的含量。再者这个受体的氨基酸序列与人类的５－ＨＴｌ家族中的受体序列同源性较高，所以５－ＨＴｄｒ０２Ａ后被更名为５－ＨＴｌＡｄｒｏ，而５．ＨＴｄｒ０２Ｂ后被更名为５－ＨＴｌＢｄｒｏ。药理学分析显示一些物质对于５－ＨＴｄｒ０２Ａ受体的亲和力为：麦角隐亭＞哌唑嗪＞ｄ－布他拉莫＞二甲麦角新碱＞１．布他拉莫＞５．ＨＴ＞育亨宾＞８．ＯＨ．ＤＰＡＴ；对５－ＨＴｄｒ０２Ｂ受体的亲和力为：麦角隐亭＞ｄ．布他拉莫＞二甲麦角新碱＞５一ＨＴ＞哌唑嗪＞１．布他拉莫＞育亨宾＞８．ＯＨ．ＤＰＡＴ。而这两个受体对５－ＨＴ的亲和力有较大的不同，５－ＨＴｄｒ０２Ｂ对５．ＨＴ的亲和力是５．ＨＴｄｒ０２Ａ的八倍‘１１４?１１阳。５－ＨＴ２ｄｒｏ是果蝇中的第四个５－ＨＴ受体，该受体与人类５－ＨＴ２受体结构和药理学性质相似。５－ＨＴ２ｄｒｏ受体基因编码８６８个氨基酸，有五个内含子，８个疏水区，其中７个为跨膜区。５－ＨＴ２ｄｒｏ受体的跨膜区与人类５－ＨＴ２受体的相似度为４０％［１１９１。将５－ＨＴ２ｄｒｏ受体基因导入到ＣＯＳ．１细胞表达，用不同的激动剂和拮抗剂研究其药理学特性发现：对５－ＨＴ２ｄｒｏ受体抑制作用大小为：利坦色林＞酮色林＞苯噻啶＞５．ＨＴ＞司托哌隆＞螺环哌丁苯＝赛庚啶＝美舒麦角＝Ｎ．乙酰．５．ＨＴ＞二甲麦角新碱，这个药理学特性与鼠５－ＨＴ２Ｂ受体较类似¨１８１。而关于５．１５西南大学硕士学位论文ＨＴ２ｄｒｏ受体的细胞信号通路还未见有报道，但可推测５；－ＨＴ２ｄｒｏ的信号同路也许类似于脊椎动物５．ＨＴ２受体，激活胞内的磷脂酶Ｃ。５－ＨＴ２ｄｒｏ主要在果蝇成虫的中枢神经系统中表达，在早期的胚胎中也检ＮＮＴ５－ＨＴ２ｄｒｏ的存在‘１１们。１．３．３其他昆虫５－ＨＴ受体的研究现状当第一个５－ＨＴ受体基因在果蝇中被发现后，陆续有其他类昆虫５－ＨＴ受体基因被克隆。特别是近年来生物信息学的兴起和一些昆虫基因组测序的完成，越来越多的昆虫５－ＨＴ受体研究被报道，如烟草天蛾、赤拟谷盗、意大利蜜蜂、双斑蟋等。虽然研究者们对果蝇中的５．ＨＴ受体进行了一定的药理学分析，但是相较于脊椎动物，昆虫中的相关研究还很缺乏。最重要的是，虽然目前已经有许多昆虫５－ＨＴ受体被克隆，但是关于昆虫５．ＨＴ受体的功能还知之甚少，鲜有相关研究报道。１６第２章引言第２章引言２．１研究背景及意义５－ＨＴ是一种单胺类物质，在生物体内发挥着重要的功能。作为神经递质，５．ＨＴ主要与生物的一些行为习惯相关，如抑郁、焦虑、学习、记忆等。５－ＨＴ不但是神经递质，而且它还可作为一种调质在生物体内发挥作用，如促进神经元的发育成熟、调节一些激素的释放、促进血管的收缩等。而５－ＨＴ发挥功能，需要其特异的受体来介导。目前已发现的５－ＨＴ受体有１４种，分别为５．ＨＴｌＡ、５－ＨＴｌＢ、５－ＨＴＩＤ、５－ＨＴｌＥ、５－ＨＴｌＦ、５－ＨＴ２Ａ、５－ＨＴ２Ｂ、５－ＨＴ２Ｃ、５．ＨＴ３、５－ＨＴ４、５－ＨＴ５Ａ、５－ＨＴ５Ｂ、５－ＨＴ６、５－ＨＴ７。这１４种受体除了５－ＨＴ３属于配体门控离子通道受体，其他５－ＨＴ受体都是Ｇ蛋白偶联受体。因为５－ＨＴ受体与人类的一些精神性疾病息息相关，如人类的偏头痛、老年痴呆、抑郁、自杀倾向等，所以对５－ＨＴ受体的研究具有重要的价值。而目前治疗一些精神性疾病的药物，８０％都是以５－ＨＴ受体作为治疗靶点。家蚕作为一种重要的鳞翅目模式昆虫，已有研究证明家蚕中同样含有５．ＨＴ，然而其５．ＨＴ受体的研究还未见有报道。本研究通过生物信息学、ＲＴ－ＰＣＲ等方法，在家蚕中成功克隆鉴定到４种５－ＨＴ受体：５－ＨＴｌＡＢｍ、５－ＨＴｌＢＢｍ、５－ＨＴ２Ｂｍ、５－ＨＴ７Ｂｍ。并且我们还对５－ＨＴＩＡＢｍ受体的功能进行了初步探究。通过本研究可以为家蚕５．ＨＴ受体的功能研究奠定基础，为昆虫的生物防治提供一个新的思路，同时对人类相关疾病的研究也具有一定的借鉴意义。２．２主要研究内容１．家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析以及表达谱利用ＮＣＢＩ、家蚕基因数据库和生物信息学等方法，克隆鉴定得到家蚕中存在的５－ＨＴ受体基因，并对克隆基因的核酸和蛋白序列进行分析。而后，设计表达谱引物对５－ＨＴ受体的组织表达进行分析。２。家蚕５－ＨＴ受体蛋白多序列比对以及进化分析．通过克隆得到的５－ＨＴ受体基因序列，利用下载得到的其他物种蛋白序列进行多序列比对，并构建进化树分析进化关系。３．家蚕５－ＨＴｌＡＢｍ受体的功能初步探究对家蚕幼虫、蛹、成虫注射５－ＨＴｌＡＢｍ受体的特异激动剂和拮抗剂，观察家蚕的生理和行为变化。１７

西南大学硕士学位论文２．３研究技术路线第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱５－ＨＴ在生物中存在非常广泛同时也发挥着重要的作用，是一种很古老的神经递质和调质，而其发挥功能往往需要通过不同的受体来介导，而现今大多数精神性疾病都与其受体功能异常相关。目前已被发现的５－ＨＴ受体有１４种，在生物中广泛存在，包括人类、鱼类、简单的多细胞动物类。在昆虫中也有关于５－ＨＴ受体研究的报道，主要集中在果蝇、赤拟谷盗、烟草天蛾等模式生物中。家蚕作为昆虫中另一个重要的模式生物，关于５－ＨＴ受体的研究还很少，甚至还处于起步阶段，所以对家蚕中５－ＨＴ受体进行克隆鉴定十分必要。本章通过检索，从ＮＣＢＩ下载得到了人类、褐家鼠、果蝇、赤拟谷盗、双斑蟋、烟草天蛾、意蜂的５－ＨＴ受体蛋白序列，结合家蚕基因组数据库和信息分析手段克隆鉴定到家蚕中存在４种５－ＨＴ受体。本章还对这４种受体基因进行了组织表达谱分析。３．１材料与方法３．１．１材料本章所用实验材料为西南大学家蚕基因库提供的家蚕Ｄａｚａｏ品种。蚕卵在正常条件下（温度２５＂Ｃ、相对湿度８０％）催青，孵化后的幼虫在２５℃下用新鲜桑叶饲养。取材时，预先准备好无ＲＮａｓｅ的１．５ｍＬ离心管，并向里加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ，将取好的材料迅速放入到管内．８０℃保存备用。３．１．２主要试剂１９西南大学硕士学位论文３．１．３主要试剂的配制（１）０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐｎｇ８．０１ｍＬ称取９３．０７ＥＤＴＡ溶于４００ｄｄＨ２０中，加入１２．３ｇＮａＯＨ调节溶液ｐＨ值至７．８，然后用１０ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调节ｐＨ值至８．０，１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ，４＂Ｃ保存备用。（２）ＴＡＥ电泳缓冲液（５０ｘ母液，ｐＨ８．５）称取１２１ｇＴｒｉｓ碱，加入大约３５０ｍＬ双蒸水，再加入５０ｍＬ２８．５５０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）和ｍＬ冰醋酸，玻璃棒搅拌溶解。后用双蒸水定容至５００ｍＬ，使用时稀释成１倍即可。（３）ＬＢ培养基ＬＢ液体培养基：分别称取１ｇ胰化蛋白胨、０．５ｇ酵母提取物、ｌ１００ｇＮａＣｌ，加去离子水定容至ｍＬ，１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ。ｇＮａＣｌ、１．５ＬＢ固体培养基：分别称取ｌｇ胰化蛋白胨、０．５ｇ酵母提取物、１ｇ琼脂粉，加去离子水定容至１００ｍＬ，１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ。待培养基冷却至手刚好能触摸时，加入适量抗生素混匀，并立即制备平板。３．１．４主要仪器设备仪器名称ＪＴ２０２Ｎ电子天平ＴＯＭＹＡｕｔｏｃｌａｖｅＳＳ．３２５型高压灭菌锅生产厂家上海精天电子仪器有限公司ＴＯＭＹＡ８０００自动双蒸水仪摇床３７℃培养箱金属浴超净工作台制冰机冷冻离心机微量移液器凝胶成像系统Ｓｍａｒｔ北京泰亚赛福科技发展有限责任公司华普达常州菲普实验仪器厂杭州瑞诚仪器有限公司苏州佳宝净化工程设备有限公司ＳＡＮＹ０日本日立公司ＥｐｅｎｄｏｒｆＢｉｏ．ＲａｄＳｐｅｅｄ３０００型分光光度计ＰＣＲ仪ＤＹＹ－６Ｃ型电泳槽Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司北京六一仪器厂上海菲恰尔分析仪器有限公司台式高速离心机ＴＧＬ－１６Ｇ３．１．５生物信息学分析网站及软件美国国立生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／家蚕基因组数据库：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｌｋｄｂ．ｏｒｇ／ｓｉｌｋｄｂ／信号肽预测：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／跨膜区预测：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／２０第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱结构域预测：ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／三级结构预测：ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｗｏｒｋｓｐａｃｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｆｕｎｃ＝ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ＿ｓｉｍｐｌｅｌ相关软件：ＤＮＡＭＡＮ、Ｐｒｉｍｅｒ５．０、Ｂｉｏｅｄｉｔ３．１．６ＲＮＡ的提取、检测以及ｃＤＮＡ的制备、检测ＲＮＡ的提取将洗净的研钵、研棒用锡箔纸包好放于烘箱１６０＂Ｃ烘４小时以上，为防止ＲＮＡ降解，整个实验过程中需佩戴一次性口罩，且尽量在低温下进行。（１）从．８０＂Ｃ冰箱中取出材料立即放入已预冷的研钵中，加入液氮反复迅速的研磨，直至将材料研磨至足够细。（２）取磨好的材料１００ｍｇ装入含有１ｍＬＴｒｉｚｏｌ的１．５ｍＬ无ＲＮａｓｅ离心管中，剧烈震荡５ｍｉｎ，静置１０ｍｉｎ。ｒｐｍ，离心１５ｍｉｎ。将上清转移至新的无ＲＮａｓｅ离心管中。”）钉））４＂Ｃ，１２５００加入２００ｕＬ氯仿，剧烈震荡２ｍｉｎ，静置１０ｍｉｎ。４０Ｃ，１２５００ｒｐｍ，离心１５ｍｉｎ。将上清水相转移至新的无ＲＮａｓｅ离心管中。＂Ｄ）））加入５００ｕＬ异丙醇，颠倒混匀，静置１０ｍｉｎ。４０Ｃ，１２５００ｒｐｍ，离心１５ｍｉｎ。弃上清，加入１ｍＬ７５％乙醇洗涤沉淀３次。４＂Ｃ，９０００＂曲”）玲Ｄｒｐｍ，离心５ｍｉｎ。弃上清，将离心管倒置于一干净的一次性手套上干燥ｌＯ．３０ｍｉｎ。加入４０ｕＬＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ。¨ｌ、，、ＪＲＮＡ的检测首先用琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ的完整性，用紫外分光光度计测定Ａ２３０／Ａ２６０和Ａ２６０／Ａ２８０值及浓度。然后于一８０＂Ｃ冰箱保存备用。ｃＤＮＡ的制备取２００ｕＬ无ＲｎａｓｅＰＣＲ管，依次加入如下试剂。第一阶段：变性解链总ＲＮＡＲＮＡ４ｐ．Ｌ１ｐＬ９¨ＬＯｌｉｇｏ（ｄＴ）ＤＥＰＣ水７０。Ｃ温浴６分钟后，立即冰浴５分钟以上。２ｌ西南大学硕士学位论文第二阶段：逆转录反应５ｘＢｕｆｆｅｒｍ叮ＴＰ５ｕＬ２ｕＬ１ｐＬ１ｕＬ２５ｕｌＲＮａｓｅ抑制剂Ｍ—ＭＬＶ加ＤＥＰＣ水将体积补至将２５此反应体系置于４２。Ｃ温浴２的ｅＤＮＡ。ｈ后，７０＂Ｃ５ｍｉｎ灭活反转录酶，．２０＂Ｃ冷冻保存转录合成ｃＤＮＡ模板检测将ｃＤＮＡ模板稀释３—５倍后，以家蚕管家基因ＢｍＡｃｔｉｎ３为检测基因，ＰＣＲ扩增检测反转录的ｃＤＮＡ质量。ＰＣＲ反应体系：１０ｘＢｕｆｆｅｒ１．５ｕＬＭｇＨｄＮＴＰ１．２此１．２ｐＬｐＬＡ３上游引物０．６Ａ３下游引物ｒＴａｑ０．６ｕＬ０．１２ｐＬ１ｐＬ１５¨ＬＳ，２４模板ｃＤＮＡ加双蒸水将总体积补至ＰＣＲ扩增程序：９４＂Ｃ预变性４ｒａｉｎ；９４。Ｃ变性４０ｓ，５６。Ｃ退火４５Ｓ，７２＂Ｃ延伸４５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，１２℃保存。电泳检测ＰＣＲ产物：取ＰＣＲ产物３ｕｌ点样于１％琼脂糖胶，以溴酚蓝为指示剂，恒压２００Ｖ进行电泳。待指示剂条带电泳至胶２／３处时，取出琼脂糖胶至ＥＢ液中染色１０ｍｉｎ，然后于凝胶成像系统中观察条带并照相保存。３．１．７目的基因的克隆目的片段的ＰＣＲ扩增以家蚕５龄３天头（５－ＨＴｌＡＢｍ／５－ＨＴ７Ｂｍ）、精巢（５－ＨＴ２Ｂｍ）、卵巢（５－ＨＴＩＢＢｍ）的ｅＤＮＡ为模板，用设计的克隆引物（表３．１）进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ体系如下：

第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱．１０ｘＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ２．５ｇＬ２ｇＬ２ｇＬ１”ＬＭ９２＋ｄＮＴＰ上游引物下游引物ＥｘＴａｑ１此０．２ｇＬ模板ｅＤＮＡ加双蒸水将总体积补至ＰＣＲ反应条件：２此２５此９４。Ｃ预变性４ｍｉｎ；９４。Ｃ变性４０ｓ，５６＂Ｃ退火４５ｓ，７２。Ｃ延伸４５ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，１２℃保存。表３．１引物序列Ｔａｂｌｅ３．１Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ基因名称表达谱引物序列克隆引物序列目的片段的回收将获得的ＰＣＲ产物进行１．５％的琼脂糖胶电泳，ＥＢ染色，于凝胶成像系统切下目的片段，按照Ａｘｙｇｅｎ胶回收试剂盒说明书回收目的片段，具体操作步骤如下：（１）割下含ＤＮＡ的琼脂糖块，使它尽可能小，放入预先称好重量的１．５ｍＬ离心管中。再次称重，获得胶块重量。（２）按每１００ｍｇ琼脂糖块加入３００ｕＬＳｌ液的比例加入Ｓｌ液，于５００Ｃ温浴１０ｍｉｎ，使胶块完全融化，期间每２ｍｉｎ颠倒混匀一次。（３）将融化后的Ａｇａｒｏｓｅ液移入吸附柱，９０００ｇ离心１ｍｉｎ。倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管。（４）在吸附柱中加入６００ｕＬＷ１液，静置１．５ｍｉｎ，离心ｌｍｉｎ。倒掉收集管中液体，将吸２３西南大学硕士学位论文附柱放回收集管。（５）（６）加入２５０ｕＬＷｌ液，离心２ｍｉｎ。ｕＬ将吸附柱转入一干净的１．５ｍＬ离心管中，在吸附柱膜中央加入２０．５０静置１ｍｉｎ，离心２ｍｉｎ。将ＤＮＡ轻微混匀后，．２０℃保存。Ｔ１液，室温目的片段的连接回收的目的片段ＤＮＡ直接与购自ＴａＫａＲａ的ｐＭＤｌ９．Ｔ载体连接，连接体系如下：回收ＤＮＡＳｏｌｕｔｉｏｎＩ４ｕＬ５ｕＬ１ｕＬｐＭＤｌ９－Ｔ混匀，１６℃连接４ｈ。转化（１）（２）将感受态细胞放于冰上融化。待其完全融化后加入５ｕＬ连接产物，冰浴３０ｍｉｎ。ｍｉｎ。ｈ。（３）４２℃金属浴热击９０Ｓ，冰浴５（４）（５）加入６００ｕＬ不含有抗生素的ＬＢ液体培养基，３７＂Ｃ，２２０ｒｐｍ摇床培养１取２００ｕＬ菌液涂布于含有氨苄青霉素的ＬＢ固体培养基上，３７。Ｃ正置培养３０ｍｉｎ后倒置培养１４．１６ｈ。阳性克隆的筛选及测序取出平板，挑取单菌落于含有ｌｍＬＬＢ液体培养基的１．５ｍＬ离心管内，３７。Ｃ，２２０ｒｐｍ摇床培养６ｈ后，进行菌液电泳和菌液ＰＣＲ，琼脂糖电泳检测。将得到的阳性克隆菌液写好标签送给公司测序。３．２结果与分析３．２．１家蚕５．ＨＴ受体基因的克隆以及核酸序列分析本研究从ＧｅｎＢａｎｋ中下载得到人类、果蝇的５－ＨＴ受体家族蛋白序列，将这些序列在家蚕基因组数据库中进行比对，共得到４个家蚕中可能存在的５－ＨＴ受体基因，分别将其命名为５－ＨＴｌＡＢｍ、５．ＨＴｌＢＢｍ、５－ＨＴ２Ｂｍ、５－ＨＴ７Ｂｍ。将家蚕中可能存在的受体基因核酸序列进行ＯＲＦ预测，根据预测结果设计可包含完整ＯＲＦ的克隆引物，并对这四个基因进行克隆测序（图３．１）。第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱ｌＡ）１８Ｉ《ＣＩｔＤＩ瀚辫糯季ｌ黝渤图３．１家蚕５．ＨＴ受体基因克隆图（Ａ：５－ＨＴｌＡＢｍ．．Ｂ：５－ＨＴＩＢＢｍ．Ｃ：５－Ｈ１２Ｂｍ．Ｄ：５－ＨＴ７Ｂｍ．每个圈左边为叫收的ＰＣＲ产物电泳图，右边为菌液ＰＣＲ产物电泳图）Ａｇａｒｏｓｅｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｆｏｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆｓｉｌｋｗｏｒｍ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓ（Ａ：５－ＨＴｌＡＢｍ．Ｂ：５－ＨＴＩＢＢｍ．Ｃ：５－ＨＴ２Ｂｍ．Ｄ：５－ＨＴＴＢｍ．ＴｈｅｒｅｃｏｖｅｒｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｉｓｓｈｏｗｅｄｏｎｔｈｅｌｅｆｔ，ｂ扯ｔｅｒｉａＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｉｓｓｈｏｗｅｄｏｎｔｈｅＦｉｇｕｒｅ３．１ｒｉｇｈｔ）将克隆得到的核苷酸序列与家蚕基因组数据进行比对，结果一致，而５－ＨＴＩＡＢｍ（图３．２）、５－ＨＴＩＢＢｍ（图３．３）、５－ＨＴ２Ｂｍ（图３．４）、５－ＨＴ７Ｂｍ（图３．５）预测的ＯＲＦ的长度分别为１３９５ｂｐ、１３４１ｂｐ、１８８１ｂｐ、１４９７ｂｐ，可编码氨基酸４６４ａａ、４４６ａａ、６２６ａａ、４９８ａａ。ＧＣＧＡＴＧ汨ＡＴＧＣＧＴＣＴＣＡＡＣｌ７ＡＴＣＡＡＧＣＧＡＧＴＴＧＡＡＣＡＣｌ．ＡＣＴＡＡＣ＾＾ＴＧＡＣＧＴＣＧＣＡＴＡＴＣＣＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣＧＡＣＧＣＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＭＧＴＧＧＴ，汀ＣＧＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＣＴＡＣＧＧＴＣＡＡＣＡＧ｝ＣＡＣＡＧＣＡＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＧＴＣＡＣＧＴＣＧＣＴＣＧＴＣＣＴＴＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＡＧＣＴＡＣＴ盯ＣＧＴＴＧＧＣ＾ＡＴＧＴＴＴＴＣＧＴＧＡＴＡＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＣＧＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＧＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＧＴＣＧＣｌ－ＡＧＣＧＧＴＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣＧＣＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣＧＣＴＧＴＡｒ＾ＴＧＡＡＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣ：ＧＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＧＣＡＴＣＧＮｒＡＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＧＣＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＡＣＡＧＧＴ丙ｒＴＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＴＧＴＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＣＧＴＡＡＣＧＡＧＡＡＡＣＧＧ＾ＴＣＴＴＣＡＣＣ＾ＴＧ＾ＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＧＴＣＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＡＴ盯ＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＡＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＣＴＡｃＴＧＧＡＡＧⅪ酊ＴＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧ忑酊”、ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＣＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＧＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＧＣＣＣＡ声ＩＴＣＣＡＧＴＣＧＧＣＧＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＡＡＧＡＡＡ＾ＧＡＴＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＴＣＡＧＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＴＣＧＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＴＴＡＴＴＡＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＴＣＡＡＡＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＧＧＴＴＧＡＴＡＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＡＣＴＧＣＧＴＴＴＡＣＣＧ、、Ｎ嬉、℃ＧＡＧＡＡＡＡＴＧＣＮ虱ＣＴＧＴＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＧＴＣＡＣＮ蠛ｔＧＧＣＴＣＧＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＣＴＣＧＡＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＴＧＣＡＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＧＡＧＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＧＴＴＣＴＴＣ＾ＴＣＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＣＡ＾ＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＧＣＴＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＡＡＣＴＣＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＧＴ朋伪弱ＣＡＣＧＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣＣＧＧＡＴＴＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＣＴＴＣＧＣＴＣＧＡ—ＩＴＣＣＴＴＴＴＣＧＧＡＡＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＣＧＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡ＾ＣＡＧＣＧＴＴＧｅＣＴｅＴｐ—ＴＡｅＡＴＴＴＡＣＡＣＣＴＡ＃汀ＣＣＧＡＴＡＣＴＣＧＧ丁ＭＮＡＳＱＬＳＳＥＬＮＴＴＮＮＤＶ＾ｙＰＴＳＥＷＦＤＡＮＣＳⅥ『ＶＥＷＳＷＧＣＮＴＴＶＮＳＴＡＳＮＳＴＳＳＤＶＴＳＬｌＩ，ＬＭ，ⅣＴＳＶＶＬＡＬ¨Ｌ＾ＴｌｖＧＮＶＦＶＩＡＡＩ¨ＥＲＮＬＱｈⅣＡｈＩＹＵ／ＡＳｌ凤脏ＤＬＭＶＡＣＬｖＭＰＬＧ风ⅣＥＶＳＱＧＷｌＬＧＰＥＬＣＤＭＷＴＳＳＤＶＬＣＳＳＡＳＩＬＨＷＡｌ＾ＴＤＲＹⅥ艏ＶＴＤＶＤＹＩＨＩＲＮＥＫＲＩＦＴＭＩｖＵ舢ＧＡＡＬＷＳＬＡＰＱＬＧⅥ，ＫＤＰＤＹｌ＾刚ＴＱＱＱＫＣＬＶＳＱＤＬ—ⅣＱｌＦＡＴＩＣＳＴＦＹＶＰＬ，ⅣＩＵＬＹＷⅪＦＱ＂ＩＲＲ剐ＲＲＲＲＥＰＰＰＰＲＰＴＳＡＤＧ＾ＰＰＳＧＲＰ｜ＱＳＡＲＤ煦ＦＶＫＫＲＦＬＮＬＫＫＣＮＱＲＴＲＶＥＴＩ＾Ａ＾ＩＬＬＴＥＧＱＳＴＳＴＶＤＴＬＤＥＥＰＲＴＴＡＦＴＶＮＥＫＭＱＳＶＳＰＥＫＳＳＳＴＶＴＮＧＳＫＰＥＫＡⅣＳＡＰＴＨＲＥＫＫＥＳＬＥＡＫＲＥＲＫ＾ＡＫＴＬＡ¨ＴＧ＾ＦＶＦＣ＿ｌｆｖＬＰＦＦＩＭＡｌＶＭＰＩＣＱＴＣｖＩＳＤＹＬＡＳＦＦＬ、＾，ＬＧＹＦＮＳＴＬＮＰ、，ＩＹＴＩＦＳＰＤＦＲＱＡＦＡ刚ＬＦＧＴＨＲＲＧＲＮＫＫＦ图３．２Ｆｉｇｕｒｅ３．２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｃ矗１５陌阴历玎基因ｏＩ河序列和预测蛋白序列（黑色字体为ＯＲＦ，下划线为引物序列）ＯＲＦａｎｄｐｕｔａｔｉｖｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ５－ＨＴｌＡＢｉｎｇｅｎｅ（ＢｌａｃｋｆｏｎｔｉｓＯＲＦ，ｐｒｉｍｅｔｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ）西南大学硕士学位论文￡§鱼！鱼』！触Ｇ亟§ｅ＾ＴＧＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＭＧＧＧＣ＾＾Ｇ＾ＧＧＡＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣ＾ＧＭＣＴＧＣＴＣ＾ＴＧＧＭＣＴＣＣＡＣ＾ＧＧ，ｆｒＧＧＧ＾ＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧ＾＾ＴＧＴＧ＾ＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＣ＾＾１．＾ＣＭＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣ，盯ＣＣＧＣＧＣＣＣＴＴＣＧ＾ＣＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣＧＣＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＣＧＧＣＴｌ－ＡＣＴＴ＾ＴＴＴＴＡＧＣｌ－ＡＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴ＾＾ＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧ觚＾ＧＣＴＧＣ＾＾ｍ盯ＴＧＴｌ．ＡＧ＾ＧＡＧＡＣＡＣＣＴＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＭＣ＾＾ＴＣＴＧ＾ＴＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣ＾Ｇ＾ＣＴＴＧＣｌ．ＡＧｌ．ＡＧＣＣＴＧＴＴＴＧＧＴＧＡｌ’ＧＣＣＣＣＴＣＧＧＧＧＣＧＧＴ盯ＡＣＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣ＾＾＾Ｇ＾ＴＧＧＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣ＾ＧＭＣＴＴＴＧＣＧ＾Ｔ＾ＴＧＴＧＧＡＣＴＴＣＡＧＧＣＧＡＣＧＴＣＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣ下＾Ｃ＾ＩＴＣＴＡＧＴＣＧＣＴＡｒＴＧＣＡＣＴＣＧＡＣＡＧＧｌ－ＡＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＴＧＡＣＴ＾ＣＡｒＡＣ＾ＣＧＣＣＴＣＴ＾ＣＡＧＣＴ＾＾ＧＣＧＧＧＴＧＧＧＴ＾ＴＧＡＴＧ＾ＴＣＧＣＣＴＧＴＧ玎盯ＧＧ＾ＣＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＣＡ＿ｒＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＴ＾ＧＧＡＴＧＧＡＪ蚺Ｇ＾ＩＴＣＣＧＧＡＣＴＧＧＭＣＣＭＣＧＣＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧ＾ＴＣＴＴＡＧＡＴＧＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＣＡ＾Ｇ＾ＣＧＴＴＧＧＡｌ＿ＡＣＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＣＭＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣ，汀ＴＣｌ．ＡＴＧＴＧＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＴｌ．ＡＴＴＴｍ蚺ＴＴＴＴＧＴＡＣＴＧＧＣＧＧ＾ＴＡ＿ｒ＾ＴＣＡＡ＾ＣＣＧＣＴ＾ＧＧＡ＾ＭＧ＾芮ｒ＾ＣＧＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＡＣＧＧＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＧＡＧＧ＾ＧＣ＾ＣＴＧＧＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣ＾ＧＣＧＧＡＧＧＴ＾ＴＴＧＣＧＧＣＧＧＣ＾ＧＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＡＴＣＧＧＡＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＭＣＧ＾下＾ＴＣＴＧＡＭＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＴＴＴＣＡＣＧＡ＾ＴＧＴＴＴＣＡＴＣＧＡＡＣＭＣＡＣＧＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＣ从ＴＣＴＴＧＴＧＣＣＭＣＧＧＣＣＴＣＧ＾ＧＧＣ＾Ｇ≯盯ＣＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＧＧＧＴｌ－ＡＣＧＧＴＧＣＴＧＴ＾ＧＣＡＧＣＧＧＣ肖ｒＡＣＴ＾ＴＣＣＧＴＣＧＣＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧＣＭＧＣＣＭＭＧＭＧＣＣＧＣＴＧ＾ＣＴＣｌＡ＾＾ＣＧＧＧⅣｌ＾ＧＭＡＡＧＣＧＧＣＴＭＧＡＣＡＴｌ－ＡＧＣＴ＾融ＡＴＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＧＣ囊汀ＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＧＴＧＴＴＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＧＴＴＣＣＧＡＣＧＴＧＴＧＡＴＴＧＴＧＭＧＴＧＡＧＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＴＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧ兵ｒＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＴ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西南大学硕士学位论文●ＡＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣ＾＾ＡＴＡ＾ＴＡ＾ＡＴＣＣＣＡＣＴＣＡＣＴＧＣＣＴＡＧＣＴＴＴ盯ＣＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＣＡＴ＾ＣＴＧＧＴＧＴＴＣ＾ＴＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＣＭＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣ＾ＴＣＴＧ＾ＴＴＴＣ＾ＣＡＧＡＩ蚺Ｃ＾ｌＴＣＣＣＣＧＧ＾＾Ｔ＾ＣＧＡＴｌ－ＡＣ＾ＴＡＴＴＧＡＣＣ＾＾１－＾ＡＣＴＣＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＴＴＴＴＴＣＧ＾ＡＧＧ＾Ａ＾ＣＧＣＣＡＧＴＣ＾ＣＡ＾ＧＣＣＧＧＴＧＣＡＣ＾Ｔ＾＾＾＾Ｃ＾ＴＴＣ＾＾Ａ＾１－＾ＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＧＴＴＴＣ＾＾ＴＴＴＴＣＴＴ盯Ｃ＾ＴＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＴＣＧＴＧＡｌ－ＡＧＴＴＧＧ从ＣＧＡＴＴＧＴＴＧＧＴ＾ＡＴ盯ＣＣＴＡＧＴＴＴＧＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＣＧ＾ＣＴＧＧＴＣＡＧＭ＾＾ＴＴＧ＾ＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＴＴＴ＾＾ＴＡＧＴＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＣＡＧＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＣＧＣＡＡＴＣＡ．ｒＡＧＴＣ＾ＩＴＧＣＣ＾Ｇ１－ＡＧＣＣＡＣＴＧＴＪ町－ＡＣＧ＾ｍ盯＾ＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＣＣＣＧＴＡＡＴＴＴＧＣＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＴＡＴＣＧＡＧＴＧ月ＴＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＣＣＴＧ鼬ＣＣＴＣＴＧＣ＾ＴＧＡ丁ＣＴＣＡＧＴＧＧＡｌ．ＣＧＡ－ｒＡＣｌ．ＡＣＧＣＧ＾ＴＴＡＣ＾Ｍ＾ＣＣＡＴＴ＾Ｇ＾盯＾ＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧ＾ＧＧＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＣｌ－ＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＣ＾１＿＾Ｇ１ｊ＾ＴＧＧ月ＩＴ＾ＡＧＴＧＣ＾ＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣ＾ＣＣＡＧＴＴＴｌ－Ａ＾１－ＡＣＴＡＧＧＣＡＡＣＧＡＧ＾ＡＧＡＣＴＧＡＧＡＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣ＾＾＾—ｌＴＣ＾ＧＴＡＴｌ－ＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣｌ－ＡＣＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＴｍＴＣＣＣＧＴＴＧＡＣＴＧＴｌｊ＾ＴＧＧＴ＾＾ＴＴＧＴＧ‘ｒＪ盯１＿＾Ｃ＾＾＾＾１。ｊ—ｌＴＴＣ黼ＧＣＧＧＣ＾＾ＧＡ＾＾＾＾ＴＡＧＴＧ＾＾＾ＧＡＴＧ＾ＧＡＡＡＣＧＴＧＣＴＣＡＡＴＣＧＣＡＴＴＴ＾Ｇ＾＾ＧＣＧＣＡＴＴＧＣＴｌＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＡ＾ＣＧＴＴ＾＾Ｇ＾ＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＧＡＣＣＧＭＧＣＧ剐执ＣＴＴＣＴＣＧＧＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＡＣＴＣ御记：ＣＧＣＣ～潲Ｇ＾ＴＣＷ黼ＣＧＡＧＣＡＣＴＡＡＣＡＣＡＡＣ．『ｌＡＧＴＡＧ＂ＡＣＭＧ＾１－ＡＡＡＴ＾Ｃ＾ＡＡＣＡＧ＾＾ＴＴＣＧＣＴＣ＾ＴＣＣＣＴＣＴＣＴＡ盯ＴＴＴＧＣＴＣ＾＾＾＾＾＾ＧＴＣ＾Ｔ＾＾ＡＧＣＣ＾ＭＧ—１．ＡＴＧＴＴＣＣＡＭＣＧＣ＾ＧＴＣＧＣＣＧＣ＾ＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＭＣＴＧＧＣＧ＾Ａ＾ＧＡＧＣＧＧ＾ＭＧＣＣＴＣＣＡＣＧＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＴＴ＾ＴＴ—ＩＴＧＴＣＡＧＣＧＴＴｌ。］＾１－＾ＧＴＴＴＧＣＴＧＧＴｌ．ＡＣＣＧＴＴＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＩＡＣＴＣ＾ＧＧＣＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧ＾ＧＧＡＣＧＣＴ＾ＴＣＣＣＧＧ＾ＴＧＣＡＧＴＧ＾ＧＣＧＣＴＣＴ月ＩＴＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴ＾ＴＴｌ）Ｖ徂Ｃ＾ＧＣＣｌ．ＡＣＴＣＡ＾ＴＣＣＡ＾ＴＣＪ＾ＴＴｌｉ＾ＣＧＣＧＡＣ：ＡＴｌＡ＾＾Ｃ＾ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＧＧＭＧＣＣＴＴＴＣＣ＾ＡＧＡＧ＾ＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＧ从ＣＣＴＧＭＣＣＡＣ＾－ｒＧ＾ＴＧＣＧＣＧＡＧＧ＾ＧＴＴＣＴＡＣＣ＾ＣＡＧＣＣＡＧＴ＾ＣＧＧＡＧ＾ＴＣＣＧＧＡＣＣ＾Ｔ１．ＡＣＴＧＴＧＴ～ＵｃＪ＾ＡｃＡＣＧＡＣＧＭＧＣＷ沮＾Ｗ蚺ＣＴＡＣＧＡＣＧＭＧＧ＾ＧＴＣＧ＾＾觚＾ＧＴＴＴＣＧＧＣＴＧＴＣＧ＾ＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＭＧ＾ＧＣ＾ＴＣＡＧ＾Ｇ＾ＧＣＴＴＴＣＴＡｒＧＡＴＴ§ＴＣＡＡ．ＴＡｅｅＧＧ～ＩＡＴＳＮＮＫＳＨＳＬＰＳＦｌＡＬＰＳＳＬＵＬＶＦＩＶＬＬＱＮＮ、，＾＾ＴＳＤＦＴＥＴＳＰＥＹＤＹＩＬＴＮＮＳＴＬＮｌＷ＿ｒＦＦＥＧＮＡＳＨＫＰＶＨＩＫＨＳＫＹＳ＾ＰＶＳＩＦＬＳＬＬＦＩⅥ爪，ＧＴＩＶＧＮＩＬｖＣⅥＷ同ＶＲⅪＲＲＰＳＮ丫ＬⅣＳＬＡ、佑ＤＬＣ～～ⅣＭＰｌ州Ｔ、，ｙＤ哪ＧＳＷＰＦＧＰｖｌＣＤＲⅣＶＳＳＤＶＬＳＣＴＡＳＩＬＮＬＣＭＩＳＶＤＲｎ川ＴＫＰＬＥｌｒＧＶＫＲＴＰＲＲＭＬＦＣＶＦＩｖＷｌＳＭＦＩＳＬＰＰＶＵＬＧＮＥＫＴＥＴＳＣｓ、，ｓＱＮＱＹＹＱ、，ＹＡＴＬＧＳＦＹＩＰＬＴＶＭＶＩｖＹＹＫＩＦＲＡ＾ＲＫ～ｒＫＤＥＫＲ＾ＱＳＨＬＥ—ｌＨＣＹＬＥＩＮＶＫＮＧＧ盯Ｅ＾ＫＵ．ＧＡＱＴＴＴＱＰＰＲＧＳｌ－ＡＳＴＮＴＴＳＳＮ闷ＮＴＮＲＩＲＳＳＬＳＮＦＡＱＫＳＨＫｐＫＤＭＦＱＴＱＳＰＨＱＫＫＬＲＦＱＬＡＫＥＲＫ＾ＳＴＴＬＧＩＩＭＳＡＦＩＶＣＷＬＰＦＦⅥ＾Ｕ．ＲＰＦＬＮＥＤ舢ＰＤＡＶＳＡＬＦＬＷＬＧＹＬＮＳＬＬＮＰＩⅣ，汀ＬＮＲＤＦＲＫＰＦＱＥＩＬＦＦＲＣＳＮＬＮＨＭＭＲＥＥＦＹＨＳＱＹＧＤＰＤＨＹＣＶＮＮＴＴＫＬＮＮＹＤＥＧＶＥＩＶＳＡ、，ＤＲＥＥＴＲＡＳＥＳＦＬ图３．５Ｆｉｇｕｒｅ３．５ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｃ５－ＨＴ７Ｂｍ基因ＯＲＦ序列和预测蛋白序列（黑色字体为ＯＲ＿Ｉ：，下划线为引物序列）ＯＲＦａｎｄｐｕｔａｔｉｖｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ５－ＨＴ７Ｂｍｇｅｎｅ（ＢｌａｃｋｆｏｎｔｉｓＯＲＦ，ｐｒｉｍｅｆｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ）将克隆得到的序列与家蚕基因组图谱进行比对发现５－ＨＴＩＡ．Ｂｍ基因转录本编号为ＢＧｍＭＧＡ０１４１２８－ＴＡ，位于家蚕８号染色体，包含３个外显子２个内含子；５－ＨＴｌＢＢｍ基因转录本编号为ＢＧＩＢＭＧＡ００６９２９．ＴＡ，位于家蚕１０号染色体，包含３个外显子２个内含子；５－ＨＴ２Ｂｍ基因转录本编号为ＢＧｍＭＧＡ００３４１８．ＴＡ，位于家蚕１５号染色体，包含２个外显子１个内含子；５－ＨＴ７Ｂｍ基因转录本编号为ＢＧｍＭＧＡ００２２８７．ＴＡ，位于家蚕２６号染色体，包含２个外显子１个内含子。２８第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱３．２．２家蚕５－ＨＴ受体基因的蛋白氨基酸序列分析将预测的家蚕５－ＨＴ受体氨基酸序列提交到ＥｘＰＡＳｙ、Ｓｍａｒｔ等服务器进行理化性质、功能域、跨膜区、三级结构等预测。结果显示：５．ＨＴｌＡＢｍ受体蛋白含有４６４个氨基酸，预测其分子量为５１．７５２ＫＤ，等电点为９．１３。将该序列提交到ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｌｌ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ颀测其信号肽，结果显示该蛋白序列无信号肽（图３．６Ａ）。同时，我们进行了Ｓｍａｒｔ结构域预测（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／），预测得到该蛋白含有典型的７次跨膜化学受体蛋白结构域（图３．６Ｃ）。而我们利用ＴＭＨＭＭ对该蛋白进行的跨膜区在线预测也同样显示该蛋白具有７次跨膜（图３．６Ｂ）。利用ＳＷＩＳＳ．ＭＯＤＥＬ同源建模对该蛋白的三级结构预测结果如图３．６Ｄ所示。综上所述，同时结合对５．ＨＴｌＡＢｍ受体蛋白的Ｂｌａｓｔ比对结果，可以得到我们克隆的５－ＨＴＩＡＢｍ基因为家蚕的５．ＨＴ受体基因，属于５－ＨＴｌＡ受体基因家族。５－ＨＴｌＢＢｍ受体蛋白含有４４６个氨基酸，预测其分子量为４８．５９９ＫＤ，等电点为８．９５。依照５．ＨＴｌＡＢｍ受体蛋白的预测方法对５－ＨＴｌＢＢｍ受体蛋白进行预测。该蛋白序列同样无信号肽（图３．７Ａ）、具有７次跨膜（图３．７Ｂ）、含有典型的７次跨膜化学受体蛋白结构域（图３．７Ｃ）。三级结构预测结果如图３．７Ｄ，对５－ＨＴｌＢＢｍ受体蛋白进行Ｂｌａｓｔ比对，结果显示克隆的５－ＨＴＩＢＢｍ基因为家蚕的５－ＨＴ受体基因，属于５－ＨＴｌＢ受体基因家族。５－ＨＴ２Ｂｍ受体蛋白含有６２６个氨基酸，预测其分子量为６９．２９４ＫＤ，等电点为９．９７。该蛋白序列与５－ＨＴＩＡＢｍ受体蛋白、５－ＨＴｌＢＢｍ受体蛋白相似，无信号肽（图３．８Ａ）、７次跨膜（图３．８Ｂ）、含有典型的７次跨膜化学受体蛋白结构域（图３．８Ｃ）。三级结构预测结果如图３．８Ｄ，结合对５－ＨＴ２Ｂｍ受体蛋白的Ｂｌａｓｔ比对结果可得，该基因为家蚕的５－ＨＴ受体基因，属于５－ＨＴ２受体家族。５－ＨＴ７Ｂｍ受体蛋白含有４９８个氨基酸，预测其分子量为５６．１３２ＫＤ，等电点为９．０３。５－ＨＴ７Ｂｍ受体蛋白序列与以上３个受体蛋白序列有一些差异，该蛋白序列含有信号肽（图３．９Ａ）、且具有８次跨膜（图３．９Ｂ）。与Ｓｍａｒｔ结构域预测结果相似，该蛋白也含有典型的７次跨膜化学受体蛋白结构域（图３．９Ｃ）。三级结构预测结果如图３．９Ｄ。而Ｂｌａｓｔ比对结果也显示该基因为家蚕的５－ＨＴ７受体基因。西南大学硕士学位论文（Ａ）１．０ＳｉｇｎｅｌＰ－４．１ｐｒｅｄｉｃｌＪｏｎ（ｅｕｋｎｅｔｗｏｒｋｓ）：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ’Ｃ－ｓｃｏｒｅ’————０．８Ｏ．６∞ｏ∽１．２０４Ｏ２０．Ｏ．时１『１霄网‘『『闹彳『『ｍ而冈ｎ丽１１１１１ｗｆ］ｗ硐二。『１雨『ｉ、而订而而１０１０２０３０Ｐｏｓｉｔｉｏｎ４０５０６０７０＃Ｍｅａｓｕｒｅｍａｘ．Ｃｍａｘ．Ｙｍａｘ．ＳｍｅａｎＳＤＰｏｓｉｔｉｏｎ７０７０６７Ｉ－６９ｌ一６９Ｖａｌｕｅ０．１３７０．１３９０．１８５０．１０８０。１２ＴＣｕｔｏｆｆｓｉｇｎａｌＰｅｐｔｉｄｅ？０．５００１２７ＮＤＨｅｔｗｏｒｋｓ＝ＳｉｇｎａｌＰ—ｌⅢＮａｍｅ＝Ｓｅ口ｕｅｎｃｅＳＰ＝’ｌ帕’Ｄ＝０．Ｄ—ｃｕｔｏｆｆ＝０．５００（Ｂ）ＴＭＨＭＭｐｏｓｔｅｒｉｏｒｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓｆｏｒＷＥＢＳＥＱＵＥＮＣＥ５０１００１５０２００２５０３００３５０４００ｅ－．．－．．——４５０ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ——ｎｓｊｄｅ——（Ｄ）ｏｕｔｓｉｄ（Ｃ）图３．６Ｆｉｇｕｒｅ３．６５－ＨＴｌＡＢｍ蛋白信号肽、跨膜区、结构域、三级结构预测结果ｏｆ５．ＨＴｌＡＢｍＳｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ，ｄｏｍａｉｎ，ｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱（Ａ）１．０ＳｉｇｎａｌＰ－４．１ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ｅｕｋｎｅｔｗｏｒｋｓ）：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ●。Ｃ－ｓｃｏｒｅ。——一！；－ｓｃｏｒｅ～’ｙ－ｓｃｏｒｅ．．—，—————．０８０．６∞ｏ荡０．４Ｏ．２０Ｏ．而讦丽丽。丽闹‘斫丽『『丽隔雨ｍ阑｝丽ｍ『［０１０２０３０Ｐｏｓｉｔｉｏｎ４０５０６０７０＃ＨｅａＳＵＥｅｍａｘ．Ｃｍａｘ．Ｙ－ａｘ．Ｓ＾ｅａｎＳＤＰｏｓｉｔｉｏｎ６ｌ１ｌ１Ｉ－１０ｌ一１０Ｖａｌｕｅ０．１１Ｉ０．１２９０．１８８０．１３３Ｏ．１３ｌＣｕｔｏｆｆｓｉｓａｌｐｅｐｔｉｄｅ？０．４５０ＮＯＮｅｔｗｏｒｋｕ＝ＳｉｇｎａｌＰ－ｎｏＴＮＮａｌｅ＝ＳｅｑｕｅｎｃｅＳＰ＝’ＮＯ’Ｄ＝０．１３１Ｄ—ｃｕｔｏｆｆ＝０．４５０（Ｂ）１．２ＴＭＨＭＭｐｏｓｔｅｄｏｒｐｒｏｂａｂＪｌｉｔｉｅｓｆｏｒＷＥＢＳＥＱＵＥＮＣＥ＞，０．８童０．６△０４０２Ｏ５０１００１５０２００２５０３００３５０４００ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ——ｒｌｓｊｄｅ——ｏｕｔｓｉｄｅ一（Ｃ）（Ｄ）图３．７Ｆｉｇｕｒｅ３．７５－ＨＴｌＢＢｍ蛋白信号肽、跨膜区、结构域、三级结构预测结果０ｆ５．ＨＴｌＢＢｍＳｉｇｎａｌｐｅｐｆｉｄｅ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ，ｄｏｍａｉｎ，ｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ３ｌ西南大学硕士学位论文（Ａ）ｓＩｇｎａＩＰ－４－１ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ｅｕｋｎｅ‘ｗｏｒｋｓ）：ｓｅｑｕｅｎ。ｅ。Ｃ－ｓｃｏｒｅ。————１０。Ｓｊｓｃｏｒｅ……。Ｙ－ＳＣ０ｒｅ．．．．．———．、．、．．——０８Ｏ６尘。拐Ｏ４Ｏ２Ｏ．０．｜＝：『丽丽碉一ｉ了而矾１１１丽而霄丽１１Ｔ丽啸丽：ｆ研硼幸黼ｆ梳０１０２０３０４０５０６０７０ＰｏｓｉｔｉＯＲ＃ＨｅａｓｕｒｅＰｏｓｉｔｉｏｎＶａｌｕｅＣｕｔｏｆｆｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ？］［ｔａｘ．Ｃ６２０．１３９ｎａｘ．Ｙ４１０．１０９ｍａｘ．Ｓ６８０．１２９ｌｅａｎＳＩ－４００．０９９Ｄ１－４００．１０５０．５００ｌ的Ｎａｍｅ＝ＳｅｑｕｅｎｃｅＳＰ＝’ＮＯ’Ｄ＝０．１０５Ｄ＿ｃｕｔｏｆｆ＝０．５００翦ｅｔｗｏｒｋｓ＝ＳｉｇｎａｌＰ－ＴＨ（Ｂ）ＴＭＨＭＭｐｏｓｔｅｒｉｏｒｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓｆｏｒＷＥＢＳＥＱＵＥＮＣＥ１．２１０．Ｂ０．６壹一｝∞０．４０．２００１００２００３００４００５００６００ｔｒａｎ５ｍｅｒｎｂｒａｎｅ——ｉｒｉｓｉｄｅ——ｏｕｔｓｉｄｅ（Ｃ）（Ｄ）图３．８５－ＨＴ２Ｂｍ蛋白信号肽、跨膜区、结构域、三级结构预测结果Ｆｉｇｕｒｅ３．８Ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ，ｄｏｍａｉｎ，ｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆ５．ＨＴ２Ｂｉｎ３２

第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱（Ａ）１．Ｏ。９９”ａｌＰ‘４１ｐｒｅ删ｏ“（ｅｕｋｎｅｔｗｏｒｋｓ）：Ｓｅｑ嘲。ｅ。Ｃ－ｓｃｏｒｅ’———Ｓ－ｓｃｏｒｅＵｓｃｏｒｅ…一。Ｏ８：，～●．；．Ｏ６竺Ｏ一：ｉ；ｉ?。ｔ．；。ｊ舄０．４０．２?ｉｃｉ√；Ｏ．Ｏ～一一…一～一…一一～’“一■川…ｉ㈤ｌｉ……｜０１０２０３０ｍ『门而、市ｆｆ：丽：ｎＴｒｉ｜ｗ嗣＊ｉ｛４０５０６０７０ＰｏｓｉｌＪｏｎ＃Ｘｅａｕｕｒｅ＾ａｘ。Ｃｌａｘ．Ｙｍａｘ．ＳｍｅａｎＰｏｓｉｔｉｏｎ３７３７３０１－３６１－３６Ｖａｌｕｅ０．４．８６０．５９３０．８８００．５８８Ｃｕｔｏｆｆｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ？ＳＤＮｎｅ＝Ｓｅｑｕｅｒｔｃｅ０．５９ｌ０．５００啊ｉＳＳＰ＝－’ＹＥＳ’Ｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｂｅｔｗｅｅｎｐｏｓ。３６∞ｄ３７：Ｖ，ＭＬ－ＴＳＤ＝Ｏ．５９１Ｄ－ｃｕｔｏｆｆ＝Ｏ．５００Ｎｅｔｗｏｒｋｓ＝Ｓｉ弘ａｌＰ－－Ｔｉ（Ｂ）１２１ＴＭＨＭＭｐｏｓｔｅｒｉｏｒｐｒｏｂａｂｉｌｉＵｅｓｆｏｒＷＥＢＳＥＱＵＥＮＣＥ０８兰蚤量０．６星０?４０２０５０１００１５０２００２５０３００３５０４００４５０ｔｒａｎｓｍｅｒｎｂｒａｎｅ——ｉｎｓｉｄｅ——ｏｕｔｓｉｄｅ一—．—－—－——（Ｃ）＿圈图３．９（Ｄ）５－ＨＴ７Ｂｍ蛋白信号肽、跨膜区、结构域、三级结构预测结果ｏｆ５．ＨＴ７ＢｍＦｉｇｕｒｅ３．９Ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎ，ｄｏｍａｉｎ，ｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ３３西南大学硕士学位论文３．２．３家蚕５－ＨＴ受体基因的组织表达谱我们取家蚕Ｄａｚａｏ品种５龄３天的头、腹部神经、表皮、中肠、脂肪体、马氏管、丝腺、精巢、卵巢、气管丛、血液共１１个组织进行表达谱分析（图３．１０）。结果表明５．ＨＴｌＡＢｍ受体基因在头部、腹部神经、精巢、卵巢有高表达，在表皮、中肠、脂肪体、马氏管、气管、血液有中等表达，而在丝腺中表达较弱；５－ＨＴｌＢＢｍ受体基因在各个组织中均有表达，同样在丝腺中表达量较低；５－ＨＴ２Ｂｍ仅在头、腹部神经、精巢中有较低表达，在其他组织均未见扩增条带；５－ＨＴ７Ｂｍ在头部表达量最高，在腹部神经、中肠、脂肪体、精巢、卵巢也有表达，而在其他组织未见有明显扩增条带。１２３４５６７８９１０１１５．ＨＴｌＡ８ｍ５．ＨＴｌＢＢｍ５．ＨＴ２Ｂｍ５．ＨＴ７ＢｍＡｃｆｉｎ３图３．１０５．ＨＴ受体基因５龄３天组织表达谱（１：头：２：腹部神经；３：表皮；４＝中肠；５：脂肪体；６：马氏管：７＝丝腺：８＝精巢；９＝卵巢；ｌＯ＝气管丛：１ｌ＝血液）Ｆｉｇｕｒｅ３．１０Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓｉｎｌａｒｖａｌｔｉｓｓｕｅｏ＝ｈｅａｄ；２＝ａｂｄｏｍｉｎａｌｎｅｒｖｅ；３＝ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ；４＝ｍｉｄｇｕｔ；５＝ｆａｔｂｏｄｙ；６＝Ｍａｒｋｏｖｔｕｂｅ；７＝ｓｉｌｋｇｌａｎｄ；８＝＝ｔｅｓｔｉｓ；９＝ｏｖａｒｙ；１０＝ｔｒａｃｈｅａｌｐｌｅｘｕｓ；ｌ１＝ｂｌｏｏｄ、对家蚕成虫进行的表达谱分析（图３．１１），结果显示：５－ＨＴｌＡＢｍ受体基因在雌性和雄性组织中的表达相似，主要在胸部、触角、脚、生殖器表达，而在其他组织（头、除去生殖器的腹部、翅）未见表达条带；５－ＨＴｌＢＢｍ受体基因主要在雌性的胸部、腹部、触角、翅、脚、生殖器表达，而在头部未见表达。该基因在雄蛾的头、腹部、触角、翅、脚、生殖器表达，而在胸部未见扩增条带；５－ＨＴ２Ｂｍ受体基因在雌蛾和雄蛾的各个组织中均未见有明显的扩增条带；５．ＨＴ７Ｂｍ受体基因在雌蛾和雄蛾的胸部、腹部、触角、翅、脚、生殖器表达，而在雄蛾的生殖器中表达量最高。５－ＨＴＩＡＢｍ—蠢罂翟—豳豳——■—■■■誓潮■■■■—誓ｆｅｍａｌｅｍａｌｅ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４５拊侣Ｂｍ■■———■——————■誓—■—————一５－ＨＴ２Ｂｍ５－ＨＴ７Ｂｍ滗愁愁阉淄圈●■曩曩曩—■●墨震圈曩曩■曩鬣■Ａｃｔｉ叫墨蓄嗣墨Ｚ翟巴Ｚ置巴，■Ｅ皇竺罡５巴２墨巴譬置图３．１１５－ＨＴ受体基因成虫组织表达谱（１：头早；２：胸部早；３：腹部早：４＝触角早：５：翅膀早：６：脚早：７：生殖系统早：８＝头ｄ：９＝胸部ｄ；１０＝腹部ｄ：１ｌ＝触角ｄ：１２＝翅膀ｄ：１３＝脚ｄ；１４＝生殖系统ｄ）Ｆｉｇｕｒｅ３．１１Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆ５－ＨＴｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅｓｉｎａｄｕｌｔｔｉｓｓｕｅｆ１＝ｈｅａｄ早；２＝ｃｈｅｓｔ早；３＝ａｂｄｏｍｅｎ早；４＝ａｎｔｅｎｎａｅ￥；５＝ｗｉｎｇｓ早；６＝ｆｏｏｔ早；７＝ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍ早；８＝ｈｅａｄｃ｝；９＝ｃｈｅｓｔｄ；１０＝ａｂｄｏｍｅｎ（，；ｌ１＝ａｎｔｅｎｎａｅｄ；１２＝ｗｉｎｇｓｄ；１３＝ｆｏｏｔｄ；１４＝ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍｄ）第３章家蚕５－ＨＴ受体基因的克隆鉴定、序列分析及表达谱３．３讨论５－ＨＴ是一种古老且保守的神经因子，它在自然界中存在极其广泛。在哺乳动物中已被鉴定克隆的５－ＨＴ受体基因有１４种，且关于其功能和药理学研究也较多。而在昆虫中同样存在５－ＨＴ和相应的受体，如果蝇、烟草天蛾、蜜蜂等。而家蚕作为一种具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫，有关于其５－ＨＴ的研究，但关于５－ＨＴ受体的研究还比较缺乏‘２¨。本研究共克隆鉴定得到家蚕５－ＨＴ受体基因４个：５－ＨＴｌＡＢｍ、５－ＨＴＩＢＢｍ、５－ＨＴ２Ｂｍ，５－ＨＴ７Ｂｍ。ＯＲＦ的长度分别为１３９５ｂｐ、１３４１ｂｐ、１８８１ｂｐ、１４９７ｂｐ，可编码４６４、４４６、６２６、４９８个氨基酸。对其氨基酸序列分析发现除５－ＨＴ７Ｂｍ以外，其他受体蛋白均无信号肽序列，且都具有７次跨膜化学受体蛋白结构域，属于典型的Ｇ蛋白偶联受体大家族。而５－ＨＴ７Ｂｍ受体蛋白含有信号肽和８次跨膜结构域，这个预测结果与果蝇的５－ＨＴ７ｄｒｏ类似。对果蝇５．ＨＴ７ｄｒｏ受体蛋白的药理学研究发现，该受体各方面特性与哺乳动物５－ＨＴ７受体蛋白相似，结合比对结果，可知我们所克隆到的５－ＨＴ７Ｂｍ基因也应属于５－ＨＴ７受体家族。对家蚕５－ＨＴ受体基因在家蚕幼虫和成虫各个组织中的表达情况进行分析：５－ＨＴｌＡＢｍ受体基因在Ｄａｚａｏ５龄３天的头部、腹部神经、精巢、卵巢有高表达，在成虫的胸部、触角、脚、生殖器也有表达。这个结果暗示了５－ＨＴｌＡＢｍ可能在这些组织中具有重要的功能，如控制行为活动、促进某些器官的发育成熟等。５－ＨＴｌＢＢｍ受体基因在幼虫的各个组织中均有表达，说明该基因属于一种类似看家基因，影响着家蚕的基本生理活动。５－ＨＴ２Ｂｍ受体基因仅在幼虫头、腹部神经、精巢中有较低表达，而在成虫各个组织中均未检测到５－ＨＴ２Ｂｍ基因的表达，这说明了该受体可能仅在幼虫某些组织中发挥作用，而在成虫中可能发生了功能退化，不具有功能。有研究表明５．ＨＴ２基因与小鼠的食性有关疆”，而家蚕仅在幼虫期取食，在其他时期均不进食，这也许与５－ＨＴ２Ｂｍ基因有一定的相关性。５－ＨＴ７Ｂｍ在幼虫和成虫中的表达具有明显的特异性，在幼虫头部有高量表达，也许该基因对幼虫脑部的神经活动具有重要的作用。有报道指出５－ＨＴ７对血管的收缩具有重要作用¨１３１，而５．ＨＴ７Ｂｍ在家蚕成虫的生殖器具有高量表达，暗示着该受体可能与雄蛾交配过程中输精管的蠕动有一定关联。在哺乳动物（小鼠）中关于５－ＨＴ受体功能的研究较多、较深入。而在昆虫中关于其功能的研究还较少，很多昆虫５－ＨＴ受体的功能还不知晓，所以以上这些推测还需要进一步的实验验证。西南大学硕士学位论文第４章家蚕５－ＨＴ受体多序列比对以及进化分析第４章家蚕５－ＨＴ受体多序列比对以及进化分析。除５－ＨＴ３受体以外，其它５－ＨＴ受体均属于Ｇ蛋白偶联受体。Ｇ蛋白偶联受体具有典型的结构特征，如７次跨膜，具有Ｇ蛋白结合位点等。在脊椎动物中，不同物种之间的５－ＨＴ受体是比较保守的。在昆虫中亦有果蝇等克隆了相关的５－ＨＴ受体基因。而在家蚕中，我们也克隆鉴定到５－ＨＴｌＡＢｍ、５－ＨＴｌＢＢｍ、５－ＨＴ２Ｂｍ、５－ＨＴ７Ｂｍ４种５－ＨＴ受体，那么家蚕５一ＨＴ受体与其它物种５－ＨＴ受体之间的进化关系如何，是否也有较高的保守性？本章将对其进行分析。４．１材料与方法４．１．１分析网站及软件美国国立生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）＂ｈｔｔｐ：Ｎｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／跨膜区预测：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／磷酸化、糖基化位点预测：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／相关软件：ＭＥＧＡ５．０、ＤＮＡＭＡＮ、Ｂｉｏｅｄｉｔ４．１．２方法利用ＮＣＢＩ下载得到人类、小鼠、果蝇等５－ＨＴ受体蛋白序列（表４．１）。利用预测跨膜区和ＤＮＡＭＡＮ比对结果分析氨基酸序列的保守性，并利用在线网站预测家蚕５－ＨＴ受体可能的磷酸化和糖基化位点。将家蚕和下载的其他物种的５－ＨＴ受体氨基酸序列导入到ＭＥＧＡ５．０构建进化树。表４．１相关基因名及登录号Ｔａｂｌｅ４．１Ｎａｍｅａｎｄｒｅｇｉｓｔｒｙｎｕｍｂｅｒｏｆｇｅｎｅｓ３７

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