环境工程微生物实验指导书 - 图文

实验一 光学显微镜的操作及细菌形态观察

1.1 实验目的

(1) 掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。 (2) 观察几种典型细菌的形态与构造，学会绘制微生物图。

1.2 实验器材

显微镜、二甲苯、香柏油、载玻片、盖玻片、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、球衣菌、假单胞菌、固氮菌标本片。

1.3 显微镜的结构及其操作方法

1.3.1 普通光学显微镜(Light Microscope) 1.3.1.1 光学显微镜的结构和各部件作用

观察、检验微生物通常用光学生物显微镜（见图1-1），显微镜分机械装置和光学系

统两部分。

一 机械装置

(1) 镜筒：镜筒长度一般是160cm。它的上端装目镜，下端装物镜回转板。回转板上一般有三个物镜。

(2) 转换器：位于镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个孔或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。

(3) 载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载破片。有的载物台上装有自动推物器。

(4) 调节器：镜筒旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调节物镜与被观察物体之间的距离。

二 光学光学系统

（1）目镜：一般使用的显微镜具有2—3个目镜，其上刻有“5×”、“10×”、“15×”(或“16×”)

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等数字及符号，意即放大5倍、10倍、15倍(16倍)。这三种透镜的焦距分别为50mm、25nn、16mm，线视场分别为20mm、14mm、10mm。

（2）物镜：物镜装在回转板上，可分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种。相应的放大倍数是10×（5×）、40×（50×）、100×（90×），相应的工作距离是7.63mm、0.5mm、0.198mm，物镜上常标注数值孔径（N.A）。使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体观察，不进行染色。在观察原生动物时，低倍镜主要用来观察全部原生动物的种类和观察它的活动状态，而高倍镜则可以看清楚微生物的结构特征。油镜在大多数情况下是用来观察染色的涂片。

（3）集光器 集光器在载物台的下面，用来集合反光镜反射来的光线。集光器可以上下调整，中央装有光圈，可以调整光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。

（4）反光镜 反光镜装在显微镜的最下方，有平凹面反光镜。

1.3.1.2 光学显微镜的分辨率与放大倍数

显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。光学显微镜的分辨

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率受光干涉现象的限制。

分辨率（最小可分辨距离）=1/2光波波长/数值孔径 （1-1）

D=λ/2n·sin(α/2 ) （1-2） N.A.=nSin(α/2 ) （1-3）

式中 D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。

N.A：数值孔径。

λ：可见光的波长（平均0.55mm）。 n：物镜和被检标本间介质的折射率。

a：镜口角（即入射角），该角度决定于物镜的直径和焦距见图（1-2）。

例如：最大入射角为120°，其半角的正弦为sin60=0.87，以空气为介质时，N.A =1×0.87=0.87；以水为介质时，N.A.=1.33×0.87=1.15；以香柏油为介质时，N.A.=1.52×0.87=1.31，见图（1-3）。

肉眼所能感受光波的波长从200mm（紫光）到700nm（红光）。设感受光波的平均长度为550nm（0.55um），N.A.=1.25，则分辨率=1/2×0.55/1.25=0.22um，而细菌大小从0.5～2um，故正好看到细菌。用紫光光源效果更好。

显微镜的总放大倍数等于物镜与目镜放大倍数的乘积。

即：显微镜的放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数

观察微生物时，常用放大10倍或15倍的目镜。目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察，主要是指使用不同物镜而言。例如使用10×目镜和40×物镜（高倍镜）所得物象的放大倍数是400倍。

油镜的放大倍数是最大的（90`或100倍）。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短，直径就很小，从标本片透过来的光线，因介质密度不同（从标本片进入空气，再进入油镜），有些光线因折射或全反射，不能进入镜头，致使进入的光线较少，物象显相不清。所以为了不使通过的光线有所损失，须在物镜和标本片中间加入与玻璃折射率（n=1.52）相仿的油（香柏油，n=1.55）。因为这种物镜使用时须加香柏油，所以我们称它为油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以也称干镜。

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1.3.1.3 光学显微镜的使用与保管

一 低倍镜的使用方法

（1）置显微镜于固定的桌上，窗外不宜有障碍视线之物： （2）拨动回转板，把低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒连接而直对；

（3）拨动反光镜向着光线的来源处(对光时应避免太阳直射，可向着自然光日光灯或显微镜照明灯)。同时用肉眼对准目镜(选用适当放大倍数的目镜)仔细观察，调节反光镜(光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜)，使视野完全成为白色，表示光线已反射到镜里；

（4）把载玻片放在裁物台上，要观察的标本放在圆孔的正中央；

（5）将粗调节器向下旋转，同时眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的下端距离载玻片约0.5cm时即停止旋转；

（6）把粗调节器向上旋转，同时左眼向目镜里观察，如标本片现出不清楚，可用细调节器调至标本片完全清楚为止；

（7）假如因调节器旋转太快，超过聚焦点，以至标本不出现时，不应在眼睛注视目镜的情况下向下旋转粗调节器，必须从第(5)步做起，以防物镜与载玻片接触，损坏物镜；

（8）在观察时最好练习两眼同时睁开，用左眼看显微镜，右眼看桌上的纸，便于一面看一面画出所观察的物象。 二 高倍镜的使用方法

(1) 使用高倍镜前，先用低倍镜观察，要把观察的标本放到视野中央；

(2) 拨动回转板使高倍镜和低倍两镜镜头互相对换，当高倍镜移向载玻片上方时必须

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注意是否因高倍镜靠近的缘故而使载玻片也随着移动，如有移动现象，应立即停止推动回转板，把高倍竟退回原处，按照使用低倍镜的方法，校正标本的位置，然后旋转调节器，使镜筒稍微向上，再把高倍镜推至镜筒下；

(3) 当高倍镜己被推到镜筒下面时，向镜内观察所显现的物象往往不清晰，这时可旋转细调节器至清楚为止。

三 油镜的使用方法

(1) 一般油镜头上有一白圈或红圈，有时标有“OI”（Oil Immersion）或(HI)字样。先用粗调节器将镜筒提起约2cm，在载波片上加一滴香柏油，拨动回转板使油镜在镜筒下方，然后小心的降下镜筒，使镜头尖端和油接触。注意镜头不能压在载玻片上，更不能用力过猛，否则会压碎载玻片或损坏镜头；

(2) 向目镜内观察，若图象不清晰，可稍微调节细调节器。若光线过暗，可调节反光镜。

(3) 油镜使用完毕，必须用指定的长纤维脱脂棉或擦镜纸将油镜及载玻片所粘着的油擦净。必要时可蘸少许乙醇—乙醚混合液擦拭镜头，最后用擦镜纸或软绸擦试干净。

四 显微镜的保养

（1）显微镜应避免直接在阳光下曝晒，因透镜与透镜之间，透镜与金属之间都是用树脂或亚麻仁油粘合起来的。金属和透镜的膨胀系数不同，透镜可能脱落或破裂。树脂受高热可能熔化，透镜也会脱落；

（2）显微镜应避免和挥发性药品或腐蚀性酸类放在一起，如碘片、酒精、醋酸、硫酸等。这些物品对显微镜的金属部分和光学部分都是有害的；

（3）显微镜镜头沾污后，要用擦镜纸或软绸擦试。用有机溶剂擦试油镜镜头，用量不宜过多，时间不宜过长，以免粘合透镜的树脂融化。切不可用手摸透镜。沾染有机物的镜头影响观察，日久还要长霉菌；

（4）显微镜不能随意拆卸，尤其是镜筒。因为拆卸后空气中的灰尘和有机物落入里面，容易生霉。机械部分要经常加润滑油，以减少磨损；

（5）显微镜用毕把目镜和物镜卸下放好，镜架应放入镜箱内，并加罩防尘。箱内应存放硅胶，以免受潮生霉。

1.3.1.4 目测微尺和物测微尺及其使用方法

一 目测微尺

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目测微尺是一圆形玻璃片，其中央刻有精确的刻度，刻度有尺形和网形两种。每个刻度所代表的距离随使用的目镜和物镜的放大倍数以及镜筒的长度改变而改变。使用前应先利用物测微尺进行标定。

二 物测微尺

物测微尺是一厚玻璃片，中央有一圆形盖玻片。盖玻片中央的小圆内有一百等分刻度，每等份的长度为1/100即10um（注意物测微尺的标记）。使用时，先将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下。把物测微尺放在载物台上按平常观察标本的方法，先找到物测微尺载玻片上的圆圈（如无圆圈就直接找刻度），然后就很容易找到物测微尺的刻度。移动物测微尺与目测微尺使两者的第一线相重合，然后计算物测微尺的每一格内包含目测微尺的小格数，算出目测微尺每小格长度。

1.3.2 欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜

OLYMPUS生物显微镜是由日本进口的一种双筒光学显微镜，它使用方便，分辨率高，并且有立体感。是目前研究微生物的良好工具。显微镜的结构见图（1-4）和（1-5）

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1.3.2.1 欧林巴斯（OLYMPUS）生物显微镜的使用方法

1. 接通电源。

2. 打开主开关。

3. 移动电压调整旋，使亮度适中。 4. 把标本固定在载物台上。 5. 放松粗调锁挡。

6. 用低倍物镜，旋转粗调和微控制钮来进行对焦。 7. 调节双目镜筒间距和视度差。

8. 再适当调节照明度。使焦点正确地对准标本。锁紧粗调锁挡。 11. 调节孔径光栏。

12. 依次用低、中、高倍镜观察。

13. 油镜观察：与普通光学显微镜方法一致。

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14. 观察完毕，复原：先将电压调节旋钮复原，关闭主开关，切断电源，放开粗调锁挡。

油镜的处理与普通光学显微镜方法一致。

1.4 微生物的形态观察

1.4.1．球菌与杆菌的观察

分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌标本片置于显微镜载物台上，用低倍镜、高倍镜和油镜观察(具体步骤见普通光学显微镜说明)，可看到细菌的杆状和球状形态，用铅笔绘出其形态图。

1.4.2．芽胞的观察

取枯草杆菌标本片用上述方法进行观察，可看到链状排列的菌提及芽胞。枯草杆菌是需氧芽胞杆菌，杆状，可单个存在或呈链状排列，培养12小时后出现芽孢。

1.4.3．鞭毛和荚膜的观察

取假单胞菌标本片置油镜下观察、可清晰地看到杆状细菌的鞭毛及其着生方式。取因氮菌标本片观察，可看到细菌的夹膜。

1.4.4．球衣菌的观察

球衣菌是一种丝状细菌，在显微镜下可看到由单个圆柱形细胞组成的丝状体，并能看到它典型的假分枝形态。

1.4.5．牙垢细菌的观察

口腔中常见的细菌有白色葡萄球菌、绿色链球菌、乳酸杆菌、梭性杆菌、卡他双球菌、螺旋体等。用牙签从牙缝中挑取牙垢少许，在载玻片一侧与水混匀，然后沾取浑浊。液至载玻片中央，用盖玻片轻轻盖上，在显微镜的低倍镜和高倍镜下观察，可以看到牙垢细菌的各种形态，有球状、杆状、弧状及螺旋体等。

思 考 题

1 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2 使用油镜时，为什么必须用镜头油？

3 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？

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实验二 细菌的单染色和革兰氏染色

2.1 实验目的

学习微生物涂片染色的基本技术，掌握细菌菌体单染色法和革兰氏染色法，以及无菌操作技术。

2.2 微生物染色的基本原理

细菌体积小，基本上是无色透明的，不经染色很不易观察，经染色可使菌体着色，与背景形成鲜明的对照，易在显微镜下观察。微生物染色的基本原理是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素如：正负离子之间的相互吸引等

细菌的单染色法是利用细菌与各种不同性质的染料(石炭酸复红，美蓝等)具有亲和力而被着色的原理，采用一种单色染料对涂片进行染色。因为细菌带负电，对碱性染料亲和力强，故染色时多用碱性染料。这种方法适于菌体一般的形态观察。

染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：

1. 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。

2. 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，

细菌易被碱性染料染色。

3. 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞

核染色）。

4. 单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂

肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料。

细菌的革兰氏染色法是细菌学中一个重要的鉴别方法，按照细菌对革兰氏染色法的反应不同，可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。细菌先用草酸铵结晶紫处理；经媒染液(碘液)作用后，用酒精脱色，在用沙黄复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被酒精脱色，则细菌呈紫色属革兰氏阳性菌(用?十”表示)；如果能被酒精脱色而被沙黄复染为红色的为革兰氏阴性菌(用“一”表示)。

微生物染色常用染料如表2-1：

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2.3 实验器材

1．显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、二甲苯、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、各种染色液、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。

2．吕氏美蓝染色液；无菌水、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液。 3．枯草杆菌，大肠杆菌斜面菌种、葡萄球菌菌种。

2.4 操作步骤 2.4.1 单染色法

染色技术的一般过程如下：

涂片 干燥 固定 染色 媒染 脱色 (复染)

水洗 干燥 镜检

1、涂片：取一块干净的载玻片，在其中央滴一滴无菌水，用无菌操作挑取少许枯草杆菌菌苔于载玻片上的水滴中(图2-1)，涂匀成膜，这时菌液不要过浓。按同样步骤可制成大肠杆菌涂片。

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2、干燥：可以在空气中自然干燥，也可以将载玻片置于酒精灯火焰高处稍稍加热干燥，但注意一定要将涂菌的一面朝上。

3、固定：将载玻片在酒精灯火焰中通过3～4次（以载玻片与手接触感到稍稍热为度），这样就使菌体固定于载玻片上不易脱落，同时也使菌体容易着色。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

4、染色：置标本与水平位置，滴加染色液于除片薄膜上，染色时间长短随不同染液而定。吕氏美蓝约2～3分钟，石炭酸复红约1～2分钟。

5、水洗：染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色为止。注意冲洗水流不宜过急、过大，水由载玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。

6、吸干：在空气中自然干燥，或用吸水纸吸干后观察。

7、镜检：将完全干燥后的染色片置于显微镜下，按实验一操作程序进行观察。

2.4.2 革兰氏染色法

1、涂片：将培养了24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（不可涂太厚）。然后干燥、固定。

2、染色

1）初染：加一滴草酸按结晶紫于涂面上，约1分钟，流水冲洗至无紫色。

2）媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 3）脱色：将载玻片上水洗净，用95%酒精洗至流出酒精刚刚不出现紫色为止（约20～30秒），立即用水冲净酒精。

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4）复染：用沙黄染液染1～2分钟，水洗后用吸水纸吸干。

5）镜检：干燥后置油镜下观察。阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。

2.5 注意事项

1、革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染成阳性菌。此外菌龄也影响染色效果，阳性菌培养时间过长或已死亡，常呈阴性反映。

2、在染色过程中，涂片也是很重要的一步。涂片越薄越好，过厚则细菌密集，假阳性。镜检时应以散开的细菌的革兰氏反应为准。

3、革兰氏染色成功与否很大程度上取决于经验。在染未知菌时，最好在同一载玻片上同时用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌做革兰氏阴性和阳性对照。

思 考 题

1、你认为制备染色标本时，应注意那些事项？

2、你所做染色片镜检结果如何？是革兰氏阴性还是阳性？ 3、革兰氏染色片为什么不能过厚？

4、对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确认你的染色技术操作结果可靠？ 5、涂片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？

6、简单染色法中各步骤的注意事项是什么？ 7、要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？

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实验三 藻类(或酵母菌)计数

3.1 实验目的

1、熟练掌握显微镜的使用方法： 2、认识小球藻及绿藻的形态； 3、学会血球计数板的使用和计算方法。

3.2 实验原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法是将藻悬浮液(或酵母菌悬浮液)放在血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于载玻片上的计数室盖上盖玻片后的容积是一定的，所以可以根据在服镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内的微生物总数。

血球计数板（图3-1）是一块特制的厚玻璃片，玻璃片上有四条槽构成三个平台，中央的平台又由—短的横槽厢成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网共分九个大格，其中间的一大格，称为计数室，常被用做微生物计数。

图3-1 血球计数板构造

a. 俯视图：中间平台分为两半，各刻有一个方格网； b. 侧面图：中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙。

计数室的刻度一般有两种：一种是一个大格分成25个中方格，每个中方格分成16个

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小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格分成25个小方格。无论那种规格的计数室，每个大方格都由16×25＝400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，其面积为1mm2。盖上盖玻片后，载坡片和盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的体积为0.1mm3。

1、25×16计数室藻数目的计算公式

藻数目（个/mL）=A/80×400×10×1000×稀释倍数

A为80个小格内的藻数目，为25个中格中选取5个中格，共计5×16=80个小格。 2、16×25计数室藻数目的计算公式

藻数目（个/mL）=A/100×400×10×1000×稀释倍数

A为100个小格内的藻数目，即16个中格中选取4个中格，共计4×25=100个小格。

图3-2 计数网的分区和分格 图3-3 显微镜下的中方格（25×16）

3.3 实验器材

显微镜、含藻水、试管、吸管、擦镜纸、滴管、血球计数板、盖玻片

3.4 实验内容

每人测定一份藻类细胞悬浮液（或酵母菌悬浮液）数目。

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3.5 实验步骤

3.5.1 样品的制备

1、取藻液一管摇匀，如藻液浓度高，要适当的稀释，稀释程度要求每小格内有5～10个藻细胞为宜，不浓则不用稀释。

2、用擦镜纸或软绸把计数板擦净，加上盖玻片。

3、用小滴管取一滴摇匀的藻液，置于盖玻片的边缘，使藻液自行渗入，多余的藻液用吸水吸去。计数室内不得有气泡。静止5分钟后，先在低倍镜下找到小方格网后，再转换成高倍镜观察并计数。

3.5.2 计数方法

1）若用25×16规格的计数室，则取左上、右上、左下、右下及中央5个中格（共80个小格）。

2）若用16×25规格的计数室，要按对角线方向取左上、右上、左下、右下4个中格（共100个小格）。 3）计数时对于线上的藻细胞只计线上方及左方的个数。

4）每个样品计数需要分三次取样计数，取平均值，然后按公式计算出每毫升藻液所含的藻数目。

5）使用完毕后，将计数板放在水龙头下冲洗，切勿用硬物洗刷，再用蒸馏水冲洗，凉干，镜检视察每小格内是否有残留藻细胞或其他沉淀物，直到冲洗干净为止。

6）计算结果并填写实验记录。 实

验 记 录

实验名称：

姓名： 班级： 学号：

表3-1 藻类细胞计数结果 年 月 日

序号 A (100/80个小格内的藻数目) / 个 稀释倍数 藻细胞数目 / 个·mL1 －备注 1 2 3 平均 思 考 题

1、血球计数板能否测定活性污泥中的微生物数量？

2、为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，结果应该是一样的？

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实验四 培养基的制备与细菌纯种分离及培养

4.1 培养基的制备和灭菌

4.1.1 实验目的

1、熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 2、了解培养基的制备与分装技术。

3、了解培养和消毒的基本原理，掌握实验室常用的灭菌和消毒方法，为菌种的纯种分离作准备。

4.1.2 基本原理

培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配置而成的，其中含有碳源、氮源、无机盐、生长素及水分等。同时微生物的正常生长繁殖还需要有适宜的酸碱度。因此，对不同种类的微生物应将培养基调到一定时pH范围。培养基的种类很多，不同微生物所要求的培养基不同，就其物理性质来分，可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加1.5～2％的琼脂，半固体培养基则是加入0.2～0.7％的琼脂。

灭菌和消毒是两个不同的概念，灭菌是指杀死或消灭指定环境中的所有微生物；而消毒是指消灭病原菌或有害微生物而言。灭菌和消毒的方法都很多（见附录三），但总的可以分为物理方法和互相方法两大类。物理方法包括加热灭菌(湿热灭菌、干热灭菌)，过滤除菌，紫外线灭菌等。化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。

4.1.3 实验器材

1、锥形瓶、试管、烧杯、量筒、玻璃棒、培养皿、移液管。 2、纱布、棉花、报纸、牛皮纸等。

3、pH试纸(或酸度计)、天平、水浴锅、电炉。 4、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。

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5、高压灭菌锅、酒精灯、无菌超净工作台、干燥箱、细菌过滤器。福尔马林、石炭酸、酒精、来苏水等。

4.1.4 实验内容

一、玻璃器皿的洗涤与包装

1. 洗涤

玻璃器皿在使用前必须清洗干净，洗净的玻璃器皿，内壁应能被水均匀润湿而无条纹及水珠。但实验目的不同，玻璃器皿洗净的程度也各不相同。不同的器皿有不同的洗涤方法。

（一）新的玻璃器皿的洗涤

新购玻璃器皿一般都含有游离碱，应先用2%盐酸或铬酸洗液浸泡，再用自来水和蒸馏水洗涤。

（二）一般玻璃器皿的洗涤

一般玻璃器皿 可用去污粉、洗衣粉或肥皂水等擦洗，然后用自来水冲洗干净。带油或凡士林、石蜡油等的玻璃器皿，在清洗之关须用滤纸或脱脂棉将其擦去，然后用去污粉、洗衣粉、肥皂水或清洗剂（飞碟牌）擦洗，必要时用5%苏打水煮两次，再用热水清洗，最后用自来水冲洗干净。

染菌或带菌的玻璃器皿，洗涤前先煮沸半小时，再用去污粉、洗依粉等清洗，最后用自来水冲洗干净，如有带染菌的玻璃器皿，应加压来菌后再清洗。

经过以上方法洗涤的玻璃器皿，以水在内壁均匀分布而不出现水珠时，为浊污除尽的标准。这样的器皿可以用于盛一般培养基和无菌水，但灭菌后使用。如果器皿用来盛化学试剂或作较精确的实验时，则应在以上方法的基础上再用蒸馏水（或去离子水）淋洗三次，备用。必要时须烘干。

洗干净的载玻片或盖玻片，用蒸馏水冲洗后，凉干，便于含水量浓盐酸的95%酒精酸槽中，使用前在火焰上烧去酒精即可。

2. 包装

用于细菌培养的玻璃器皿，洗干净后，必须包装后才可灭菌。 1）吸管和滴管的包装

包装方法有两种；一种是放在钢管中灭菌，适于较多吸管，滴管放在一起且集中使

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用的情况。另一种是单支包装；在吸管的吸端用细铁丝塞一段棉花（约1～1.5cm长），松紧要合适，其目的是既防止微生物吸入口中，又防止微生物吹入吸管中，起过滤作有。用4～5cm宽的长纸条（牛皮纸或废报纸均可），自吸管或滴管的尖端（尖端须两层纸），以螺旋式包扎起来，最后留有一段纸条打一个结，以防松脱，见图4-1。

图4-1 吸管与滴管的包装 2）.试管和锥形瓶的包装

（1）管口和瓶口先塞棉花塞。棉塞可过滤空气，防止杂菌进入并可减缓培养基的水分蒸发。做好的棉塞，四周应紧贴管壁和瓶口，不留空隙和皱折，以防空气中微生物会沿棉塞皱折浸入，棉塞的制作见图4-2。棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为准。棉塞的2/3应在管内或瓶口内，上端露出少许，以便拔塞，见图4-3。

图4-2 棉塞的制作过程

（2）为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞，待灭菌的试管和锥形瓶等塞好棉塞后要用牛皮纸或废报纸包裹并用线绳捆扎，以待灭菌。

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图4-3 试管的包装

3）培养皿由一底一盖组成一套，可按实验需要将培养皿若干套一起用牛皮纸或废报纸包裹，以待灭菌，培养皿的包装方法见图4-3。

图4-4 培养皿的包装方法

二、培养基的配制

1、牛肉膏蛋白陈培养基(供测定细菌总数或菌种分离用)配方：

牛肉膏 0.5％ 蛋白陈 1.0％

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氯化钠 0.5％ 琼 脂 2.5％ 蒸馏水 100毫升 pH值 7.2—7.6

2、配置方法

1) 称量：按培养基配方准确称取各种药品放入烧杯中。

2) 溶化：向300mL烧杯中加入150mL蒸馏水搅匀，然后加热使其溶解。

配置固体培养基时，可将琼脂剪成小块(或直接用琼脂粉)，这样有利溶化。在琼脂溶化过程中要不断搅拌，注意不要使培养基溢出或烧焦。待完全溶化后补足因蒸发所损失的水分。

3) 调节pH值：初配好的培养基往往不能符合所要求的pH值，故需用pH试纸或酸度计测拭，并用10%NaOH或1mol/LHCL调整pH至7.6。

4) 过滤：用纱布或棉花过滤均可。一殷无特殊要求的情况下，可省去该步。 5) 分装：根据不同要求可将制好的培养基分装入5支试管中，其余的倒入250mL三角瓶内，在瓶口塞上棉塞，注意不要将培养基沾在管口，以免浸湿棉塞引起污染或影响透气性。

一般液体培养基分装高度以试管高度的1／4左右为宜，固体培养基为试管高时1／5左右，灭菌后制成斜面。半固体培养基以试管高度的1／3为宜，灭菌后垂直放置凝成半固体深层琼脂。

6)包装：培养基分装好后塞上棉塞，外面再包；层牛皮纸便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。

三、无菌水的配置

在试管或三角瓶内先盛以适量的自来水，用棉塞塞住管口或瓶口，并用牛皮跃(或旧报纸)扎紧，灭菌。水的体积应在灭菌后恰为9毫升(试管)或99毫升(三角瓶)。这种适量的体积可在灭菌器内由经验求得，也可先将试管或三角瓶灭菌，用灭菌吸管吸取灭菌的自来水9毫升或99毫升加入试管或三角瓶中。无菌水常用来稀释菌液。

四、 灭菌

（1） 加水：立式灭菌锅是直接将水加至锅内底部隔板以下1/3 处。

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（2） 装锅：把需要灭菌的器皿包装后放入锅内（器皿不要装得太满，否则灭菌不彻底），关严锅盖（对角式均匀拧紧螺旋），打开排气阀。 （3） 点火：如果用电源则开启开关。

（4） 关闭排气阀：待锅内水沸腾时，蒸汽将锅内冷空气排净后，温度指针指向100℃，这时关闭排气阀。

（5） 升温、升压：关闭排气阀后，压力计和温度计的指针同时上升。当压力达到1.05kg/ cm2 (温度为121℃)时，灭菌开始。此时调节火力大小，使压力维持在1.05kg/ cm2 15～30min，含糖培养基压力为0.565kg/ cm2（过高的压力和温度会使营养成分破坏）。 （6） 中断热源：达到灭菌时间后停止加热，使其自然降温、降压，等指针回到0时，打开排气阀（切忌过早打开排气阀，否则培养基因压力突然下降，温度没下降而使培养基翻腾冲到瓶口污染棉塞）。

（7） 揭开锅盖，取出物品，排掉锅内剩余的水。

（8） 待培养基冷却后放入37℃恒温箱中培养24h，若没有细菌生长，放入冰箱或阴凉处保存备用。

4.2 细菌纯种分离及培养

4.2.1 实验目的

1 掌握从环境（土壤、水体、空气等）中分离培养细菌的方法，从而获得细菌纯培养技能。

2 掌握几种接种技术

4.2.2 实验器材

1 无菌培养皿（直径90毫米）10套、无菌移液管1mL 2支、10mL 1支。

2 营养琼脂培养基1瓶（已灭菌）、待分离样品1瓶、无菌稀释水90mL 1瓶、装有9mL无菌水的试管5管。

3 接种环、酒精灯、恒温培养箱。

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4.2.3 细菌纯种分离的操作方法

细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。 (一)稀释平板分离法 1．取样

用无菌锥形瓶到现场取一定量的活性污泥或土壤或湖水，迅速带回实验室。 2．稀释水样

将1瓶90mL和5管9mL的无菌水排列好，按l01、102、103、104、10

－

－

－

－

－5

及

10

－6

依次编号。在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL水样(或其他样品

10g)置于第一瓶90mL无菌水(内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌液。用1mL无菌移液管吸取1m1021浓度的菌液于一管9mL

－

－

无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10稀释过程如实验图4-5。

－2

浓度菌液。同样方法，依次稀释到106。

－

图4-5 稀释平板法分离细菌的过程 3．平板的制作

取10套无菌培养皿编号，104、105、10

－

－

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各3个，另1个为空气对照。取1支1mL

－

－4

无菌移液管从浓度小的10

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菌液开始，以106、105、10

－

为序分别吸取0.5mL，菌液

于相应编号的培养皿内(注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勾)加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以

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中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿．使培养基和茵液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～4Bh，然后观察结果。(注：若在无菌室内操作，倒平板按图4-5操作)

取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于30℃培养24—48h后观察结果。 (二)平板划线分离法 1平板的制作

将融化并冷至约50℃的肉膏蛋白陈琼脂培养基倒人无菌培养皿内，使凝固成平板。 2．操作

用接种环(图4-6)挑取一环活性污泥(或土壤悬液等)，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸人培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)，划线的方式可取图4-7中任何一种。划线完毕盖好皿盖，倒置，30℃培养24—48h后观察结果。

图4-5 接种技术

图4-6 平皿划线分离法

4.2.4几种接种技术操作

由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，按种方法也有多种，现简介如下；

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(一)接种用具

常用的接种用具有接种环、接种针、接种钓、玻璃刮刀、铲、移液管、滴管等。接种环和接种针等总长约25cm，环、针、钩的长为4.5cm，可用白金、电炉丝或镍丝制成。上述材料以白金丝最为理想，其优点是：在火焰上灼伤红得快，离火焰后冷很快，不易氧化且无毒。但价格昂贵，一般用电炉丝和镍丝。接种环的柄为金届的，其后端套上绝热材料套。柄也可用玻璃棒制作。 (二)接种环境

微生物的分离培养、接种等操作需在经紫外线灯灭菌的无菌操作室、无菌操作箱或生物超净台等环境下进行。教学实验由于人多，无菌室小，无法一次容纳所有实验者。所以．在一般实验室内进行时要特别注意无菌操作。也可多组分批进行。 (三)几种接种技术 1斜面接种技术

这是将长在斜面培养基(或平板培养基)上的微生物接到另一支斜面培养基上的方法。 (1)接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上。 (2)将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人、组别、姓名等。 (3)点燃煤气灯(或酒精灯)。

(4)将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两支试管，中指位于两支试管之间，斜面向上，管口齐平。

(5)右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红以达到灭菌(环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧)。

(6)在火焰夯，用右手小指、无名指和手掌夹住柿塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉。将烧过的接种环伸人菌种管内，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸入另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞并插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。 2．液体培养基中的菌种被接人液体培养基

接种用具是无菌移液管和无菌滴管。移液管和滴管是玻璃制的，不能在火焰上烧，以免碰到水时玻璃破裂，需预先灭菌。用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。 3．液体接种

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这是由斜面培养基接种到液体培养基中的方法。用接种环挑取斜面培养基上的菌种一环送入液体培养基中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入液体培养基中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在液体培养基中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。 4．穿刺接种

这是将斜面菌种接种到半固体深层培养基的方法。

(1)如前斜面接种操作，用接种针(必须很挺直)挑取少量菌种。

(2)将带菌种的接种针刺入固体或半固体深层培养基中直到接近管底．然后沿穿刺线缓慢地抽出，塞上棉塞，烧红接种针，则接种完毕。 5稀释平板涂布法

稀释平板涂布法与稀释平板法、平板划线法的作用一样，都是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。此法接种量不宜太多，只能在o．5ML以下．培养时起初不能倒置，先正摆一段时间等水分蒸发后倒置c此法步骤如下： (1)稀释样品：方法与稀释平板法中的稀释方法和步骤一样。

(2)倒平板：将融化的并冷至50℃左有的培养基倒入无菌培养皿中．冷凝后即成平板。 (3)用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在乎板上旋转涂布均匀。

(4)正摆在所需温度的恒温箱内培养，如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养。

(5)待长出菌落观察结果。

思 考 题

1、加压蒸汽灭菌开始之前，为什么要放尽容器内的冷空气?灭菌后，气压末降至0时，为什么不能开盖?

2、加压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌需求的温度低、时间短? 3、干热灭菌完毕后，在什么条件下开箱?为什么? 4、在教师的指导下，将实验所需物品进行灭菌。 5．分离活性污泥为什么要稀释?

6．用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时．应从哪个坡度开始?为什么？

7．你掌握了哪几种接种技术?

8．稀释平板法和平板划线法在实际应用中有何区别？

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