高效液相色谱分析实验讲义

高效液相色谱分析实验

一、实验目的

1． 了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作 2． 学习苯-甲苯混合物的定性分析方法 3． 评价色谱柱效

4． 了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点； 5． 学习未知样品的定量分析方法。 二、实验原理

不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。

色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等 1．色谱定性分析方法

（1）利用保留值与已知物对照定性

A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性） 2．色谱定量分析方法

⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。 ⑵常见的色谱定量分析方法主要有：

a 归一化法。特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。

b内标法。特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。

c 标准曲线法（外标法）。简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。

d 内标标准曲线法。 三、仪器与试剂

LC-1000型高效液相色谱仪 P3000A-UV3000型高效液相色谱仪 甲醇(色谱纯) 二次去离子水 苯 甲苯 苯－甲苯 四、高效液相色谱仪操作步骤 1. 流动相的预处理

用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。 2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备 3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作

a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；

b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；

c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。

d 关闭三通阀，设置最小压力(0.1)和最大压力(20)，并设置实验需要的流速(0.8~1.1ml/min)，启动高压泵。

e 点击采集基线图标（或者在操作中选择采集基线），查看基线运行情况，待运行平稳后，在控制面板窗口中，点击归零，使基线置于零；点击停止采集(此时高压泵正常运行) f 用平头微量注射器洗涤进样口后，取试液20 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时注入样品，转动阀柄至“Inject”位置，此时软件自动进入“采集数据”模式。

注意！平头微量注射器用甲醇清洗3次后，再用试液清洗3次，避免气泡。 h 待所有色谱峰流出完毕后，按“停止采集”键，保存数据在D盘/仪分实验。 i 点击谱图处理中的定量结果，记录组分的保留时间以及峰面积、峰高等色谱信息。 注意！注射器进不同样品前，使用专用清洗注射器在进样阀的“Load”和“Inject”位置，用流动相清洗几次。

4. LC-1000型高效液相色谱仪操作

a. 依次打开高压输液泵、紫外检测器电源开关；

b. 打开色谱N2000在线工作站，选择通道，建立运行方法；

c. 打开三通阀(逆时针半圈)，按“Purge”排除流路中的气泡。排气完毕后，按“Stop”键，停泵，关闭三通阀。按“Flow”设置流速1.0 mL/min，“Enter”确认。按“Pmax”和“Pmin”设定压力。

d. 按“设定”键，检测波长254 nm。按“↓”键，输入“1”，开启氘灯。 e. 按“Run”键，启动输液泵。

f. 检查基线，零点校正，基线稳定后，用平头微量注射器取试液20 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时注入样品，转动阀柄至“Inject”位置，同时点击软件“采集数据”。 注意！平头微量注射器用甲醇清洗3次后，再用试液清洗3次，避免气泡。 g. 待所有色谱峰流出完毕后，按“停止采集”键，保存数据在D盘/仪分实验。

h. 打开N2000离线工作站，调用数据文件(D/仪分实验)，不覆盖当前工作(No)。查看保留时间，峰面积，理论塔板数，分离度等参数。预览、打印图谱和分析结果。

注意！注射器进不同样品前，使用专用清洗注射器在进样阀的“Load”和“Inject”位置，用流动相清洗几次。 5. 结束工作

所有样品分析完毕后，流动相继续流动10～20 min，至基线稳定。关闭检测器，按“Stop”停泵。关闭泵电源。 五、实验内容

1. 分别进样苯、甲苯标样和苯-甲苯混合试样，保留时间定性，记录苯-甲苯混合试样色谱谱。

2. a. 分别采集系列甲苯溶液以及未知试样的色谱图，根据保留时间定性，确定甲苯组分峰的位置，并测定各自的峰面积。 b. 根据实验数据，利用外标法绘制标准工作曲线，并计算待测溶液中甲苯的含量。

3. (选做). 改变体系的流速(0.8、1.0、1.2ml/min)，进苯-甲苯混合溶液，记录两组分的保留时间、峰宽以及分离度与流速之间的关系，并结合色谱的原理，简要探讨其原因。 六、思考题：

（1）若进样之后，没有样品峰出现，有哪些可能的原因？ （2）与气相色谱柱相比，为何液相色谱柱一般都很短？ （3）为了提高液相色谱的分离效果，可采取哪些有效措施？

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