重组质粒的酶切和PCR验证-郑小煜

重组质粒的酶切和PCR验证

姓名：郑小煜

学号：201100140069 班级：11级生物技术班 同组者：赵莉、高瑞

【实验目的】

1、 检验重组质粒的插入片段的大小

2、 学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术。

【实验原理】

（一） 重组质粒酶切鉴定

将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。 （二） 引物设计

1、引物

体内，引物是一段与模板DNA互补的RNA单链

体外PCR反应中，引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，分别与靶DNA模板的两端互补，从而界定了产物的范围

引物能否与靶DNA特异结合，决定了PCR的特异性；引物能否被DNA聚合酶有效延伸，决定了PCR的灵敏性。

2、引物设计原则

长度：15-30nt，longPCR或某些特殊的PCR需使用较长的引物。 碱基分布：随机分布，同一碱基不应连续出现超过4次。 GC含量：一般40-60%。太低会导致引物Tm值较低，不利于PCR的特异性；太高则不利于引物结合，亦能引发非特异扩增。→Tm值(55℃-65℃)过低，PCR特异性低；过高，PCR效率低，特异性差。（引物设计软件和公司合成时都会直接给出Tm值。）

引物二聚体：尽可能避免两引物的3`端有较多碱基互补。 发夹结构：避免引物3`端产生发夹结构。

3`端：需与模板DNA严格配对，不能有任何修饰；最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对；最后1-2nt最好不要用T/A；→PCR灵敏性：引物二级结构的存在可能影响与其模板的特异、有效结合；3`端的错配则会影响DNA聚合酶的有效起始。

引物5`端：可引入与模板DNA不配对的碱基，如：限制性核酸内切酶识别序列，以方便克隆操作；加各种寡核苷酸接头（adaptor\\linker）；可改变某个碱基，从而在产出物中引入点突变；可利用放射性物质或非放射性物质（如生物素、地高辛等）进行标记，以方便后续分析、检测。→PCR的灵活性和多用途。 （三） PCR

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克

隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。 1. 聚合酶链式反应原理

PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+，4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。

PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高、特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。 2． PCR的反应动力学

PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 3． PCR扩增产物

可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即长产物片段）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的短产物片段。短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 4．PCR技术的发展

第一代——定性PCR技术：靶DNA扩增，电泳检测有无； 第二代——荧光定量PCR（real-time，qPCR）技术：借助标准曲线对起始DNA相对定量；

第三代——数字PCR（Digital PCR，d/Dig-PCR）技术：通过直接计数对靶分子进行绝对定量。

几种常用的特殊PCR技术： 逆转录PCR（Reverse transcription-PCR，RT-PCR）：RNA经逆转录后可作为PCR的模板，常用于基因表达研究（定量PCR）和逆病毒检测。设计RT-PCR引物时，应使引物分别位于不同的外显子中，以便区别cDNA和gDNA扩增产物。

多重PCR（Multiple PCR）：在同一PCR反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。例如用多重PCR进行DNA缺失筛选。

套式PCR（nested PCR）：用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。

非对称PCR（asymmetric PCR）：在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。

新型PCR技术——重叠延伸PCR：

用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES(internal ribosome entry site)的直接连接，为构建复制型腺病毒栽体作准备。

方法：以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板，通过引物设计，使E1A基因3’端与IRES基因5’端具有相互重叠的一段序列，用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因，再以这两种PcR产物的混合物作为模板．进行重叠延伸PCR扩增E1A—IRES基因片段。

意义：重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来，其在分子生物学领域中具有潜在应用价值。 （四） 重组质粒的PCR验证

引物名称 引物序列5’→3’ 引物长度（nt） 24 M13F（-47） CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 24 M13R（-48） AGCGGATAACAATTTCACACAGGA PCR产物长度预测：PCR产物（bp）=引物间载体序列+插入片段长度 pUC19上两引物间序列的长度是150bp

故本实验PCR产物长度预测：PCR产物（bp）=150+插入片段长度

【实验材料及仪器】

1、 实验材料：模板pUC19重组质粒，寡核苷酸引物（公司合成，上游引物M13F，下游引物M13R），Taq DNA聚合酶，dNTPs（，10×PCR反应缓冲液，无菌超纯水，10×M buffer，10×Loading buffer，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，HindⅢ，λ／HindⅢ，pUC19/HindⅢ，DL2000，10×Buffer，Lambda/HⅢ。

2、 实验仪器：PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，0.2ml薄壁PCR管，凝胶成像仪，高速离心机，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，记号笔。

【实验步骤】

1、 重组质粒的酶切

对于重组质粒，采用HindⅢ酶切进行验证。

表1 不同大小和不同得率质粒酶切的推荐反应体系 成分及加样顺序 大片段或高产量中片段或中产量小片段或低产量（小体系，μL） （中体系，μL） （大体系，μL） ddH2O 7.2 8 4.5 1.0 1.2 1.5 10×M Buffer Re-pUC19 1 2 8.0 0.8 1 HindⅢ（15U/μL） 0.8 Total 10 12 15 混合均匀后，4000rpm，1min，将液体集中于管底。37°C，1-2h，存放于-20°C冰箱备用。

2、 酶切产物的电泳检测 1） 电泳样品制备

取酶切反应液加入2μL 10×Loading buffer，混匀后全部点样。 取1-2μL质粒rpSJ（酶切前）加2-3μL ddH2O以及1μL 6/10×Loading buffer，混匀后取5μL点样。 2） 电泳上样顺序

表2 电泳上样顺序 2 3 4 5 6 泳道 1 ? pUC19/ rp1-1 rp1-1/ rp1-2 rp1-2/ DL2000 λ样品 λ/HindHindⅢ HindHind/HindⅢ Ⅲ Ⅲ Ⅲ 100ng 5.0 100ng 10 样量10 全部 5.0 全部 （μL） Marker M/对作用 M/对对照 对照 照 照 中胶板1（1%）：小体系反应液，包括：1组，2-2，4-2，6-2，7组，8组，9-2，共计10个样品。

中胶板2（1.5%）：大/中体系反应液，即14-17μL，包括：2-1，3组，4-1，5组，6-1，共7个样品。 中胶板3（1.5%）：包括：9-1，10-12组，共7个样品。 3、 PCR反应体系的建立

以桌为单位，即每四组配一个Master，分装后加入各自模板，每组2个外加一个阳性对照（老师提供模板）一个阴性对照（ddH2O），共10管。（若酶切结果显示插入片段大于2.3kb，则使用老师提供的564bp模板。

表3 PCR反应体系 编号 组分 每管加量（μL） 总量（μL） 1 ddH2O 13.6 140 2 2.0 20 10×Buffer 3 1.6 16 dNTP（2.5mM each） 4 M13F 0.8 8 5 M13R 0.8 8 6 1.0 模板（1-10ng/μL） 7 0.2 2 Taq酶 Total 20.0 190 在冰浴中，依序加入以上成分； 分装10管，19μL/PCR管；

分别加入1μL不同的模板（插入片段<2.3）； 轻弹/用枪吹吸混匀； 快速离心集液于管底。

4、 PCR反应程序

表4 PCR反应程序设定 项目 温度（°C） 时间 94 3min 预变性 94 30s 变性 58 30s 复性 72 60s 延伸 72 19min 终延伸 4 2h 保存 5、 PCR产物的电泳检测 1） 制备琼脂糖凝胶

参数：40mL制胶槽；1.5%浓度；18齿梳子*2 2） 电泳样品制备

向PCR产物中加入3μL 10×Loading buffer，吹吸混匀，取5μL电泳检测。 3） 电泳上样顺序

表5 PCR产物电泳检测上样顺序 1 10 18 泳道 ? ? DL2000 I-1 II-1 DL2000 样品 Lambda/HⅢ 5 5 6 5 5 样量（μL） Marker 作用 对照 对照

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