Southern杂交方法

分 子 植 物 病 理 学 实 验

--Southern杂交

（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）

核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等 ）

一、基因组DNA的提取（选择方法；提取要完全，CTAB\\SDS:去多糖的，冷却后再加好；去上清液要适度）

二、基因组DNA的酶切（注意：酶种类、浓度、酶切时间（少于16h）等因素） 三、电泳（胶要倒平（平衡！！），厚度一致；胶越浓，孔越小）

琼脂糖浓度0.8 %，4℃下低电压缓慢电泳，1V/cm。

四、转膜 （为毛细管法，也可电转移）

↓首先要在电泳盒中取出凝胶，修胶，切除无用的凝胶部分，将凝胶的左下角切去，以便于定位。然后将凝胶置于一搪瓷盆中。（注意：进样孔要切除，因其薄，易透液。留14cm；切左下角以示标记；用胶片托转）

↓将凝胶浸泡于0.25N HCl中10min使其脱嘌呤.

↓将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量的0.4N NaOH中变性20min。

↓在一塑料或玻璃平台上铺2-3层滤纸，将其置于一搪瓷盆或玻璃缸中，盛满0.4N NaOH，

滤纸的两端要完全浸泡在溶液中。（即搭桥：大小要精确，每层都要慢展开，不要有气泡）再在其上铺1-2层滤纸?（和凝胶一样大小）。 ↓将变性后的凝胶上下颠倒后（注意正反面），置于上述平台中央（注意两者之间不要有气

泡）。

↓在凝胶边的四周用Parafilm或废胶片封严，以防止在转移过程中产生短路。 ↓将尼龙膜（面积稍大于凝胶）小心覆盖在凝胶上，相应地将膜的一角剪去并标计好正反面。（注意膜一经与凝胶接触即不可移动）。

↓再将两张滤纸（和凝胶一样大小）覆盖在尼龙膜上，排除气泡。

↓裁剪一些与凝胶一样大小的吸水纸，置于上述滤纸之上。在吸水纸上置一玻璃板，其上压

一重约500g的物品。

↓静置8-24hr使其充分转移，其间注意更换吸水纸。

↓转移结束后，将膜置于2?SSC、0.1% SDS中浸泡5min，室温晾干。

五、烤膜(现用紫外交联仪， 倒记时，几秒—几分钟即可，粘液，然后在微波炉中烤一会)

80℃真空烤膜2hr，固定DNA（碱转移可不需此过程，已与膜共价结合了）。

六、预杂交（注：有的也可以不预杂交，直接杂交）

↓ 膜在3?SSC、0.1% SDS中预湿，放入杂交管，使其正面朝向管的内部。（当有多张膜需杂

交时，膜与膜之间需用mesh隔开）。

↓ 加入适量的3?SSC、0.1% SDS，65℃处理 15min。

↓ 弃上述溶液，加适量(about 10ml)预杂交液（Church buffer: 1%BSA, 1mMEDTA, 0.25M

Na2HPO4- NaH2PO4 pH7.2, 7%SDS），65℃预杂交至少2hr，封闭膜上非特异性结合位点。

七、杂交（杂交在杂交炉中进行）

1.探针标记（随机引物法）

基本原理：随机引物是含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片段的混合物，它可以与任意核酸序列杂交，起到聚合酶反应的引物的作用。通过热变性，使模板DNA变为单链DNA，随机引物与单链DNA退火后，利用Exo-free Klenow Fragment 合成互补链。此时，如果底物中dNTP的一种或几种被同位素标记，合成的互补链DNA也被标记。合成后的双链DNA通过热变性或碱变性变成单链后，即可用做杂交探针。 2.步骤

↓ 用做模板的DNA 片段的定量。

↓ 在EP管中加入下列反应液，95℃加热3min后迅速置于冰中冷却5min。 模板DNA 25ng Random Primer 2μl ddH2O up to 14μl

↓ 加入10?buffer、dNTP Mixture各2.5μl, Klenow 1μl,吸吐混匀。

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↓ 加入α-P标记的dCTP (50μCi)5μl,吸吐混匀。 ↓ 37℃反应20min。（此步之后，沸水3min，冰上5min。就可标记成功，用于杂交） ↓ 65℃加热5min, 或加入EDTA,终浓度为30mM, 使酶失活。 ↓ 加入175μl ddH2O。 ↓ 过G-50柱纯化探针。

↓ 依次加入9?200μl ddH2O进行洗脱。 ↓ 收集3-8管纯化的探针。（即探针不用纯化） ↓ （或者在上一步后，按下述步骤进行：）加入10N NaOH, 使终浓度为0.1N,静置5min (或

95℃加热3min后,迅速置冰中骤冷),使探针变性。 ↓ 将标记好的探针加入杂交管底(勿直接加到膜上)。

↓ 65℃杂交过夜。(注：杂交完后，将杂交液及探针混合物收集，保存，再用)

八、洗膜（仍在杂交炉中进行，置杂交炉管内，可直接用O.1?SSC、SDS洗2-3次即可）

↓ 少量2?SSC、O.1%SDS室温洗膜2-3次,废液倒入废液缸。 ↓ 2?SSC、O.1%SDS 65℃杂交炉中洗2?15min。 ↓ 1?SSC、O.1%SDS 65℃杂交炉中洗2?15min。 ↓ O.1?SSC、O.1%SDS 65℃水浴锅中洗2?15min。

九、压片

↓ 用保鲜膜包膜,必要时在用荧光标签标记，压入磷板或压X光片（使其正面朝向磷板面或增感屏面）。

↓ 室温下放置磷板或在-80℃下进行X光片放射自显影。 ↓ 扫磷板或洗X光片。 十、洗片

取出X光片，显影一定时间（信号不同，时间不同：3-5分钟或10分钟？）；冲洗；再定影一定时间（5-10分钟不等？）

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