西南大学分子生物学

分子生物学

添加时间：2008.10.29 | 作者：admin 实验一 仪器介绍和实验规范训练及实验准备

一、实验目的

1. 系统回顾分子生物学实验技术的发展。

2. 了解分子生物学——特别是关于分子克隆的实验方法和理论、了解分子生物学实验安全规则和注意事项。

3. 掌握分子生物学实验所用试剂的配制过程。 二、实验内容

1. 分子生物学实验的条件与设施 , 包括各种仪器设备、房屋设置等； 2. 分子克隆的常规实验方法和理论； 3. 分子生物学实验安全规则和注意事项； 4. 配制近期实验所需要的公共试剂。 三、实验所需仪器设备 1. 多媒体设备 2. 实验所需仪器

37℃ 培养箱、温控空气摇床、温控水浴摇床、超净工作台( 双人双面)、电子天平、双蒸水器、高压锅、磁力搅拌器、移液枪、振荡器、-20℃冰箱、制冰机、 -70℃冰箱、高温烘箱、离心管、枪头、烧杯、量筒等。 3. 实验药品

氯化钠、氢氧化钠、 Tris 碱、琼脂糖、盐酸、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、SDS 、 EDTA 、无水乙醇、 95% 乙醇、低熔点琼脂糖。 四、注意事项 1. 高压蒸气灭菌

（1）紧盖和开盖时，都应采用对角式均匀地转动紧固螺栓，并且双手同时

操作。切不可采用将紧固螺栓逐个拧紧或松开的方法。

（2）灭菌结束以后，切勿过早打开排气阀，否则，开盖时试管内的培养基 会由于内外压力不平衡而冲出管口，使棉塞上沾染培养基而发生污染。 2. 紫外线防护

在操作紫外装置时，注意自我防护，避免直接接触紫外线，以防灼伤皮肤或眼睛。

实验二 家蚕基因组DNA提取及检测

一、实验目的

1. 了解并掌握苯酚法提取动物基因组 DNA 的原理和步骤。 2. 了解DNA 浓度和质量测定的技术。 二、实验原理

酚、氯仿是蛋白质变性剂，能有效出去核蛋白，使核酸从核蛋白复合体中分离出来。氯仿还能加速有机相与液相的分层，少许异戊醇能稳定界面，减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。 三、实验材料、试剂和设备 1. 实验材料和试剂 材料：家蚕蛹

试剂：液氮、平衡酚（Tris饱和）、1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）、 TE（PH8.0）、10mol/L CH3COONH4 、70%乙醇、20mg/ml Proteinase K、10mg/ml RNA酶。 抽提缓冲液： 10 m mol/L Tris-Cl（pH8.0） 0.1 mol/L EDTA （pH 8.0） 0.5% SDS

加样缓冲液： 0.25%溴酚蓝；0.25%二甲苯青（FF）； 15%聚蔗糖水溶液 2. 实验仪器

冷冻离心机、常温离心机、电泳仪、核酸电泳槽、核酸蛋白定量仪、37℃培养箱、温控水浴摇床等。 四、操作步骤

1. 将家蚕蛹放入预冷的研钵中，加入液氮后快速研磨成粉末状；加入1mL的抽提缓冲液，轻轻摇匀，形成匀浆状，将匀浆液转至5mL无菌离心管中；再用1mL的抽提缓冲液清洗研钵，并将洗液转入同样的离心管中，然后加入蛋白酶K至终浓度100μg/mL，52℃水浴保温5h或过夜；

2. 加入等体积平衡酚，温和振荡，摇匀15 min（置-20℃，5-10 min）；4℃ 12000 rpm离心10 min，将粘稠的上清液转移到离心管中；

3. 再用酚﹕氯仿（1﹕1），氯仿各抽提一次10 min，然后4℃12000rpm离心10 min；

4. 移出上层水相，加入2-2.5体积冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀；4℃，7000 rpm离心10 min或用高压灭菌过的玻璃棒/消毒牙签将DNA沉淀从乙醇溶液中移出；

5. 用70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，晾干后，加入350 μL TE（pH8.0），并加入RNAase使终浓度为50 μg/mL，在37℃培育4h；

6. 将DNA转移到1.5mL的无菌离心管中，再加入TE（pH 8.0）350 μL到5mL无菌离心管中洗涤，并将洗液转入同样的1.5mL离心管中；

7. 再用等体积的酚，酚：氯仿（1﹕1），氯仿各抽提一次，然后加入2-2.5体积冰冻乙醇，转动离心管使溶液充分混合，DNA立即形成沉淀；

8. 用70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，后晾干，加入TE 200 μL溶解DNA；

9. 取DNA 4μL与2μL 含有0.3%Goldview染料的6×上样缓冲液混匀，放置5min后，点样到0.8%琼脂糖凝胶中，以 2.5--5 v/cm电泳； 10. 紫外灯下观察拍照；

11. 取2μL DNA溶液，用98μLTE稀释50倍，然后用分光度计检测DNA的浓度和纯度。 注：第9、10、11步将在实验三中详细讲解。

实验三 基因组DNA的检测

一、实验目的

1. 掌握基因组DNA检测方法。 2. 了解不同类型凝胶电泳的适用范围。 二、实验原理

1. 凝胶检测

一般来讲，应用凝胶电泳技术分离核酸比分离蛋白质要容易。核酸是带均匀负电荷的分子，对于双链DNA来说，基本不存在影响迁移率的复杂结构。影响核酸在凝胶上的迁移有多种重要的变量，这些变量包括：核酸的构象、凝胶孔径的大小、所用的电压的大小。在实际操作中，这意味着较大孔径的琼脂糖凝胶用于分离>500-10000bp的片段，而较小孔径的聚丙烯酰胺凝胶或筛分型琼脂糖凝胶则用于分离<1000bp的片段。

图4.1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱

2. 紫外分光法检测

DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700—7800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022—0.024。小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 三、实验材料、试剂和设备 1. 材料、试剂

上次实验提取的家蚕基因组DNA 电泳缓冲液

染色物质（溴化乙锭、GoldView染料等） 电泳级琼脂糖

加样缓冲液（6×或10×） DNA分子量标准（Marker） 2. 设备

水平凝胶电泳装置（恒流电源、凝胶样品梳、电泳槽、托胶板、灌胶平台） 紫外分光光度计 比色皿 微波炉 烧杯

四、实验步骤

（一）琼脂糖凝胶电泳检测

1. 制备凝胶，将电泳缓冲液和电泳级琼脂糖在微波炉中或经高压熔化，混匀，加入适量GoldView染料，冷却至55℃，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。

表4.1 分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖浓度 琼脂糖 线性DNA片段的有效分离范围（kb） 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 30-1 12-0.8 10-0.5 7-0.4 3-0.2 2. 待胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm。

3. 用适量的10×加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中。一定要包括合适的DNA分子量标准物。

4. 接通电极，使DNA向阳极移动，在1-10V/cm凝胶的电压降下进行电泳。

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