藻胆蛋白的生物合成及光谱分析 - 图文

藻胆蛋白的生物合成及光谱分析

作者：邱容 朱焱 谢雪林

作者单位：湖北师范学院生命科学学院0803班（邱容、朱焱） 湖北师范学院生命科学学院0801班（谢雪林） 摘要: 藻胆蛋白是红藻、蓝绿藻、隐藻中的捕光色素蛋白，主要成分为藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)，藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC),藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(Allophyxoxyanin,APC)。本实验只是进行藻蓝蛋白的生物合成及光谱分析，通过将载有藻蓝蛋白基因的质粒导入E.coli中，从而构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中通过亲和层析法提取所需的藻蓝蛋白。提取的藻蓝蛋白通过紫外可见光谱仪进行光谱分析。 关键词：藻蓝蛋白 生物合成 光谱分析

Abstract: Phycobilin , a kind of protein which can catch light ,exist in Red algae, blue-green algae, cryptomonad.It consists of Phycoerythrin(PE),Phycoerythrocyanin(PEC),Phycocyanin (PC) and Allophyxoxyanin (APC). This report presents the biosynthesis and spectral analysis of the PC, by sending the plasmids carrying the gene which can produce PC into E.coli, thus creating the engineering bacterium which can procuce PC.Through the expanding culture ,induction and the affinity chromatography，we can extract PC from the engeneering bacterium to obtain PC . Extraction of PC

can be spectral analysed by UV-visible spectrometer. Key words：Phycobilin biosynthesis spectral analysis

藻胆蛋白是一种水溶性色素蛋白，存在于红藻、蓝藻、隐藻和某些甲藻体内，是这些藻类特有的光合系统捕光色素，在光合作用中起捕集光能和传递能量的作用，根据结构和光谱特性可将藻胆蛋白分为藻红蛋白、藻蓝蛋白和别构藻蓝蛋白。藻胆蛋白具有性质稳定，荧光量子产量高，背景干扰小，易于同生物素、抗体和糖蛋白等大分子交联等特点，既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，又可制成荧光试剂，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等领域，还可以作为光动力治疗癌症。本实验只是进行藻蓝蛋白的生物合成及光谱分析，通过将载有藻蓝蛋白基因的质粒导入E.coli中，从而构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中通过亲和层析法提取所需的藻蓝蛋白。提取的藻蓝蛋白通过紫外可见光谱仪进行光谱分析。

1、材料与方法 1.1材料：

菌种（已导入藻蓝蛋白基因的工程菌） LB培养基 卡那霉素 氯霉素 异丙基硫代-?-D-半乳糖苷（isoprophyl thio-?-D-galactoside，简称IPTG） 超声缓冲液（ 0.5mol/L NaCl、20mmol/L磷酸钾缓冲液（KPP），pH7.2） 0.5mol/L 氯化镍 柱平衡液

洗脱液Ⅰ（0.5mol/L NaCl、20mmol/L磷酸钾缓冲液，pH7.2）， 洗脱液Ⅱ（50mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、50mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH7.2)），

透析液（50mmol/L KPP,0.5mol/L NaCl，pH7.2）

1.2方法：

1.2.1、菌种的活化

配臵LB培养基1L（蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，20min。）(7.20 、14:00)

取10ul的保存大肠杆菌接种于5ml的LB培养基中，添加抗生素（卡纳霉素12ul、氯霉素6ul），37℃摇床培养过夜。（7.20 、19:00）

将试管中活化的1 ml菌液接种到100 ml LB培养基，同时加入抗生素（卡纳霉素240ul、氯霉素120ul），培养基于37℃摇床振荡培养6小时。（7.21 、8：00） 1.2.2、诱导藻蓝蛋白的生物合成

扩大培养的10 ml菌液接种到250ml LB培养基，同时加入抗生素（卡纳霉素600ul、氯霉素300ul），培养基于37℃摇床振荡培养。 培养至OD600约为0.5-0.6，10℃水浴中放臵1 hr。（7.21 、14:00）

加入IPTG至终浓度为1mmol/L。

20℃低温、避光、过夜诱导，摇床转速为100r/min。（7.21 、19:00）

离心（4000rpm,5min）收集细胞，二次蒸馏水洗两次。（7.22 、

9:30）

1.2.3、藻蓝蛋白的提取与纯化

将洗好的细胞重悬于一定量的超声缓冲液中，用超声波细胞粉碎仪进行超声破碎细胞5 min，于12000×g离心15 min。（7.22 、11:00）

亲和层析法提纯蛋白质溶液：取上清加到用柱平衡液预平衡好的Ni＋亲和层析柱上，用柱平衡液洗柱三次，采用洗脱液Ⅰ洗脱杂蛋白，采用洗脱液Ⅱ收集色素蛋白。（7.22 、14:00）

洗脱产物装入透析袋中，用透析液透析三次，每4小时换一次析液以去除咪唑。

1.2.4、藻蓝蛋白的光谱分析

吸收光谱用紫外可见光谱仪，紫外可见光谱扫描范围300～800nm，扫描速度960nm/min，狭缝宽度1.0nm

2、实验结果

2.1、工程菌经诱导经两次离心后的照片如下，

第一次离心

第二次离心

由以上两张图片我们可以看到细胞沉淀物呈蓝绿色。

2.2、细胞沉淀物经破壁、过镍柱后收集的的藻蓝蛋白溶液呈如上所示的蓝色。（由于实验后期出现以外，我组的藻蓝蛋白溶液出现沉淀，图示为整个实验小组的成果。）

2.3藻蓝蛋白的紫外光谱分析图

紫外分光光度计光谱分析

由图可以看到藻蓝蛋白在600-700nm间有最大吸收峰。

3、讨论与展望

本组实验后期本已成功提取藻蓝蛋白，但由于量太少，不便于进行紫外光谱分析，我们商议后决定，结果溶液出现了白色絮状物，导致光谱分析未能进行。经分析我们认为可能是由于藻蓝蛋白变性，或者是咪唑与藻蓝蛋白发生反应后的结合物（这是受涂俊明老师做博士毕业论文时的启发），对此还有待进一步分析探究。

研究表明，藻胆蛋白吸收峰在600到700之间，而由光谱分析我们可以看到，此藻胆蛋白溶液有两个吸收高峰，则推想另一个吸收峰可能是由杂蛋白所致。因为本次实验只是粗提取的过程，所以属于正常现象，但也提示我们应该注意实验过程的规范性，同时进一步探索更为可行的、科学的方法。

本实验通过将藻胆蛋白基因导入大肠杆菌中，构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中分离纯化所需的藻蓝蛋白。实验过程比较简单，但是需要较长时间，这就要求实验者有比较强整体意识，统筹规划，合理分配时间，进可能提高实验效率，同时，由于是小组实验，也要求小组成员之间不断交流，及时沟通，协调意见，确保实验的顺利进行。但为确保实验成功进行，我们也必须注意一些问题，例如抗生素的添加，量不足会导致杂菌大量生长，但量过多又会引起目标菌的变异甚至死亡，无法大量生长。同时，为获得大量的目标菌，在培养时最好控制在它的最适生长温度，而培养的时间也要严格控制，以在稳定期为宜。此外，本实验涉及到多次离心操作，应该规范操作，避免离心时溶液洒出影响

后续实验。

关于实验后期工作，我们可以对提取的藻蓝蛋白进行进一步分析，以明确其具体结构，探究其性质、功能，以服务于社会生产实践。

4、致谢

感谢涂俊明老师对本实验的精心指导！

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/zrjr.html