《生物技术大实验》实验指导书-65pages

《生物技术大实验》实验指导书

前 言

《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。

分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。

学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。 虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。

由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，

恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。

编 者

2005年3月

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目 录

实验一 质粒的提取和纯化 ……………………………………………. 3 实验二 质粒DNA的电泳和纯度检测…………….……………………..6 实验三 PCR产物的TA克隆……………………………………………...9 实验四 感受态大肠杆菌细胞的制备…………………………………...12 实验五 重组DNA转化大肠杆菌…………………………………........12 实验六 PCR扩增基因特异片段………………………………………..15 实验七 DNA片段的回收及纯化………………………………………..19 实验八 PCR法快速鉴定重组载体……………………………………...22 实验九 限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24 实验十 外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28 实验十一 RNA的提取及其纯度检测……………………………………32 实验十二 逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段…………………..35 实验十三 DNA探针制备……………………………………………..…38 实验十四 Southern印迹杂交……………………………………………41 实验十五 Northern印迹杂交……………………………………………44 实验十六 荧光原位杂交（FISH）技术…………………………………47 实验十七 外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50 实验十八 生物芯片技术………………………………………………...53 实验十九 RNAi技术……………………………………………………56 实验二十 蛋白质组技术………………………………………………...58 附录 基因工程基本技术路线…………………………………………….60

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实验一 质粒的提取和纯化

实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。

实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟

的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。

1. 裂解细胞 裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有Triton X-100等。

2．分离 即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。

3．纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。

正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／异戊醇24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。

实验内容：

试剂

1.LB培养液(1L)

细菌培养用蛋白胨 10g 细菌培养用酵母粉 5g

3

NaCl 10g

用10mol／L NaOH调至pH7.0，高压蒸气灭菌, 4℃贮存.

2．溶液Ⅰ，可成批配臵，灭菌后4℃贮存。

葡萄糖 Tris-C1(pH8.0) EDTA

3．溶液Ⅱ(新鲜配制) NaOH 0.2mol／L SDS 1％ 4．溶液Ⅲ

5mol／L KAc 冰醋酸 水

60ml 11.5ml 28.5ml 50mmol／L 25mmol／L 10mmol／L

配制好的溶液Ⅲ含3mol／L钾盐，5mol／L 醋酸(pH4.8) 卡那霉素(Kana): 50mg/ml, 过滤除菌.

5．重蒸酚 市售苯酚蒸馏纯化(收集179～181℃之间的酚)后，用TE饱和，使水相的pH在7.5以上，4℃保存。

6．氯仿 异戊醇(24:1) 7．无水乙醇

8．RNaseA(10mg／ml) 9．3mol／L NaAc(pH5.2)

10．TE 10mmol／L Tris-C1(pH8.0) 1mmoI／L EDTA

材料

含有质粒(pNTE-EGFP, pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a.

操作步骤

1．挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP, pEGFPN3质粒的单菌落，接种至5ml LB培养液(含

Kana 50μg／m1)，37℃振荡培养过夜。

2．取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中，12 000r／min离心2min，弃上清。 3．将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中，强烈振荡混匀。 4．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖，轻轻颠倒混匀5次，冰浴5min。 5．加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10s，冰浴5min。

6．12 000r／min 室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5m1 Eppendorf管中。

7．加入等体积酚／氯仿(1:1)，振荡混匀，12 000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。【注意】酚具有腐蚀性，操作时小心。

8．加人等体积氯仿，振荡混匀，12 000r／min离心2min，上清转移至另一个Eppendorf管中。 10．加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀10min。

11．12 000r／min离心10min，去上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，空气中晾干。 12．加入20μl TE溶解质粒DNA，加入RNaseA，终浓度20μg／m1 37℃水浴0.5h。

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实验六 PCR扩增基因特异片段

实验目的：

学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则；了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；掌握

PCR的基本操作。

实验原理

PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。在分子生物

学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面，是分子生物学中一项极为常用的技术。

PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3＇端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。

(一)PCR引物设计

1．Tm值 Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数，是指引物与模板之间精确互补并且在模

板过量的情况下有50％的引物与模板配对，而另外50％的引物处于解离状态时的温度，Tm值一般高于55℃。合适的引物选择应需考虑到以下因素，如Taq酶的最适温度(TE)和Tm值等。最常用的Taq酶的最适温度(TE)范围为70～74℃，根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围(Ta)。这个温度范围应不高于酶的最适反应温度，也不能比TE－25℃更低。这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时，酶的合成反应会非常缓慢，但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增。所以Ta的选择应满足TE-25℃

2．引物的长度 引物长度一般在15～30个核苷酸之间比较合适。引物过短时造成Tm值过低，不能与模板很好地配对或是配对专一性很低。引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶的最适反应温度，还使合成引物的费用大大增加。当然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位点等碱基则可稍长。

3．引物的GC％含量 引物的GC比最好设计在40％～60％的范围内。GC比过高与过低都会直接造成Tm值的过高与过低。如上所述，Tm值的估计可简单地根据经验式Tm＝4×GC+2×AT+3.3℃获得。

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4．引物3′端起始碱基 Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的，延伸效率为T>G＝C>A。即当引物3′末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3′末端设计为A，以提高复制精确性。另一种理论是3′末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的3′末端不要考虑使用T。

5．引物无发卡结构 引物自身应无发卡结构。

6．二引物自身之间不能配对 二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3′末端。二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同，若发生这种情况会形成引物二聚体，造成扩增失败。一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3，两条引物间配对碱基数小于5个。

7．二引物的Tm值 引物设计时应注意使二引物的Tm值相近，否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。由于影响引物设计的因素比较多，所以常利用计算机来辅助设计，通常可用primer 5.0软件或其它PCR引物设计程序来帮助设计。

(二)PCR反应条件

1．PCR缓冲液 常用的1×PCR缓冲液为10mmol／L Tris-HCl pH8.3(常温)，50mmol／L KCl，

1.5mmol／L MgCl2。由试剂公司与Taq酶一起提供。

(1)Mg2+离子浓度：Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大，因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。Mg2+一般使用浓度为0.5～2.5mmol／L，必要时可以0.5mmol／L梯度间隔做Mg2+最适浓度试验。 (2)dNTP：常用dNTP浓度为20μmol／L(可用范围为20～200μmol／L)。dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关，dNTP量过少时合成的产物减少。可以被Taq酶接受的经过修饰的dNTP有以下几类：dig-11dUTP、5—bromo-dUTP、biotin-11—dUTP、biotin-16—dUTP、7—deaza-dGTP和次黄嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受经过修饰的dNTP。

(3)K+离子浓度：PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是50mmol／L，但当K+离子浓度高于50mmol／L时会抑制Taq酶活力。

(4)pH值：PCR反应中用的是Tris-HCL缓冲系统。Tris-HCL缓冲系统的特点是具有很高的温度系数(0.021pH／℃)，20℃时pH为8.3的缓冲液在72℃延伸反应时，实际pH值降低至7．2。而Tricine的温度系数较高，在扩增长片段时用Tricine系统。

(5)保护剂：由于PCR反应体系中蛋白的含量极低，所以加人的酶非常容易变性，通常需加入一定量的保护剂。如5mmol／L的二硫苏糖醇(DTT)，100μg／ml的小牛血清白蛋白(BSA)或0.01％的明胶。加入保护剂对PCR循环数较多的扩增反应效果尤其明显。

2．模板 PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反转录后再扩增。模板可以是基因组DNA或纯化的质粒DNA，当然两者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每个PCR反应中加入的模

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板数量可在102～105分子之间，必要时可低至50个分子，模板的量少时应酌情增加循环次数。小于100ng的哺乳动物细胞基因组DNA(相当于约104个细胞)，经30个循环，10％的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。使用较大量的模板时，循环数可减少；如果模板量很少，可能需要增加至45个循环反应。

3．引物浓度 常用引物浓度为0.1～0.5μmol／L。随着引物浓度的降低，PCR反应的特异性提高但产物得率降低；随着引物浓度的升高，情况正好相反。

4．PCR反应中的酶 Taq酶最早是从水生嗜热菌(thermus aquaticus)中分离得到的，该酶的最适温度是72℃，在94℃时相当稳定，半衰期长达38min。由于这种酶使用最早最广泛，文献中所列各项最适反应条件都是针对此酶优化的，使用其它的聚合酶时按试剂盒使用说明书操作。

实验内容

仪器和试剂

1．仪器 PCR仪，微型水平电泳槽，电泳仪等。 2．试剂

（1）50×TAE电泳缓冲液 （2）10×PCR缓冲液： （3）4种dNTP混和液 （4）Pfu DNA聚合酶 （5）引物（20μM） （6）10×溴酚蓝上样缓冲液

10mmol/L （5U/μl）

方法和步骤

1. 在PCR仪上设臵好程序。

2. 在两个灭菌的0.5ml离心管中，按下列顺序加样，建立20μl反应体系。

ddH20 10×PCR Buffer dNTP(10mM each) Primer l(20μM) Primer 2(20μM) 模板DNA (50ng)D16

15μl 2μl 0.5μl 0.5μl 0.5μl 1μl

Pfu DNA聚合酶（2.5U） 0.5 μl 总体积 20μl

对照水（空白对照）

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3．混匀，短暂离心．

4．放在PCR仪上进行PCR反应。94℃变性3min，94℃45秒，64℃ 1分钟，72℃3分钟，20

个循环。（用旧式的PCR仪进行基因扩增时还要求覆盖约50μl (一滴)液体石蜡油，改进后的PCR仪已经不用液体石蜡油覆盖。）

5 . 取5μl PCR反应液及1μl上样缓冲液混合，进行琼脂糖电泳(5V／cm)，选择适当大小的

DNA分子量标准（DL2000），检查扩增产物。紫外观察，必要时拍照。

注意事项

1.PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的，因此，在进行PCR前，模板的纯化和引物设计尤为重要。

2.Mg2+对Taq DNA聚合酶的活性影响很大，有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时，不妨适当增加Mg2+的浓。

【思考题】

1. PCR的原理是什么？

2. PCR中引物和TaqDNA聚合酶各有什么作用？ 3. PCR中怎样预防出现假阳性结果？ 4. 什么是Tm值？有何用途？如何计算？ 5. 引物设计应遵循什么原则？ 6. 你会使用哪种引物设计软件？

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实验七 DNA片段的回收及纯化

实验目的

了解琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的常用方法，掌握根据实际情况选用方法的原则，并用

试剂盒从琼脂糖凝胶中回收PCR产物DNA片段。

实验原理

DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，例如可收集特定酶切片段用于克

隆或是制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是产物的纯度与回收率：纯度未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；回收率不理想时往往会大大增加前期工作量。

1．低熔点胶法 低熔点胶是向普通琼脂糖的多糖链上引入羟乙基形成的，这一变化会使凝胶的熔化点与凝固点均降低。低熔点胶在30℃时凝结、65℃时熔化，这一温度尚不足以使DNA分子变性。操作时可先灌一块普通的胶，然后用低熔点胶取代其中的回收部分。割下的胶加入TE后于65℃保温促使凝胶熔化，再加入等体积的酚抽提去除凝胶。低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立即进行酶切连接、标记等酶反应，因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质，并且收集的胶条能在酶反应的合适温度(37℃)始终保持液体状态。

2．玻璃粉(乳)法 将胶条割下加入NaI溶液浸泡，剧烈振荡数分钟促使溶胶。向胶液中加入经酸净化处理的极细玻璃粉(乳)，室温反复倒转离心管使DNA吸附于其上。离心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保温，洗脱吸附于玻璃粉上DNA，再次离心收集含DNA的上清液即可。玻璃粉法适用于回收0.4～1kb的小分子片段，均有80％的回收率。

3．QIAgen胶回收试剂盒 由于凝胶溶于含NaI的溶胶液，DNA能专一地与离心柱中纤维素结合。结合后的DNA经洗涤除去杂质，最后在低盐缓冲液中经离心从纤维素上洗脱下来。

4 其他试剂盒，本实验采用的是北京塞百盛生物技术公司的PCR产物回收试剂盒。基本原理

是，在高盐状态下，纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。此法简便快捷，可在几分钟内从PCR反应液，或十几分钟内从普通琼脂糖凝胶中回收高纯度的PCR产物，用于DNA测序及其它酶促反应。其回收率分别为85%和70%左右。该系统不仅用于纯化PCR产物，还可以从反应液或普通琼脂糖凝胶中回收各种类型的DNA片段，适用范围从150bp到十几kb。

实验内容

试剂与器材

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试剂

(1)琼脂糖

(2)TAE电泳缓冲液

(3)10×DNA电泳样品缓冲液 (4)无菌水 (5)PCR产物

(6)溴化乙锭（EB） （7）试剂盒包装及组成

1、纯化树脂 （于GS结合液中） 2、离心纯化柱（空柱子） （8）80%异丙醇或80%乙醇 （9）超纯水或TE缓冲液 仪器

(1)台式高速离心机 (2)水浴锅 (3)电泳器材

20ml 50套

实验步骤

1. 将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液（50μl~100μl反应体系）在1%的普通琼脂糖凝胶上

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电泳，切下所需的DNA条带装入2ml离心管中。

尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶，这样可简化操作、提高回收量及DNA片段的质量。 2. 200mg~400mg琼脂糖凝胶中加入0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀），70℃保温5~10分钟，每两分钟颠倒混匀1次，使琼脂糖凝胶完全融化。

对于高浓度的琼脂糖凝胶（>2%），每200mg的琼脂糖凝胶中加入0.5ml纯化树脂，加热融胶的时间延长到15分钟。

3. 将混和液转移入离心纯化柱，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 4. 加入500μl 80%异丙醇（或乙醇），13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

重复第4步一次，此步骤13,000rpm离心2分钟，务必将异丙醇 （或乙醇）除尽。如果离心纯化柱上还残留有异丙醇（或乙醇），13,000rpm再离心1分钟。

5. 将离心纯化柱套入干净的1.5ml或2ml离心管中，开盖放臵2~3分钟，务必使乙醇充分挥发干净，加入40μl TE缓冲液（若用于测序，则加40μl超纯水）于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放臵2分钟后，13,000rpm离心30秒。

TE缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心纯化柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。

6. 离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取4μl电泳（0.8%琼脂糖，120V，10分钟）检测并目测定量。-20℃保存备用。

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注意事项

1 低熔点胶回收DNA时，切除不含样品的凝胶，保证样品凝胶尽可能地要小。

2 室温低于25℃时，纯化树脂 （于GS结合液中）可能出现结晶或盐析，此时请务必预热，使其完全溶解后使用。。

3 纯化树脂（于GS结合液中）为灰褐色粉状物质，静臵时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。

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实验八 PCR法快速鉴定重组载体

实验目的

掌握PCR法快速鉴定重组载体的基本操作。

实验原理

PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。在分子生物

学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面，也可以用来鉴定重组载体，是分子生物学中一项极为常用的技术。

PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3＇端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。PCR法快速鉴定重组载体的基本原理是直接取沸水浴裂解的重组质粒DNA为摸板，通过特异引物的特异扩增来鉴定外源片段是否重组。

实验内容

仪器和试剂

1．仪器 PCR仪，微型水平电泳槽，电泳仪，水浴锅，离心机等。 2．试剂

（1）50×TAE电泳缓冲液 （2）10×PCR缓冲液： （3）4种dNTP混和液 （4）Pfu DNA聚合酶 （5）引物（20μM） （6）10×溴酚蓝上样缓冲液

10mmol/L （5U/μl）

方法和步骤

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1 取培养过夜的转化菌液20μl，沸水浴3-5分钟。 2 12000rpm 离心2分钟。取上清液作为PCR的摸板 3在 PCR仪上设臵好程序。

4在1个灭菌的0.5ml离心管中，按下列顺序加样，建立20μl反应体系。

ddH20

12μl

10×PCR Buffer（无Mg离子） 2μl 25mM Mg离子 dNTP(10mM each) Primer l(20μM) Primer 2(20μM) 模板DNA

1.5 0.5μl 0.5μl 0.5μl 2μl

TaqDNA聚合酶（2.5U） 1 μl 总体积 20μl

5混匀，短暂离心．

6放在PCR仪上进行PCR反应。94℃变性3min，94℃45秒，64℃ 1分钟，72℃3分钟，20个循环。（用旧式的PCR仪进行基因扩增时还要求覆盖约50μl (一滴)液体石蜡油，改进后的PCR仪已经不用液体石蜡油覆盖。）

7 取10μl PCR反应液及1μl上样缓冲液混合，进行1% 琼脂糖电泳(5V／cm)，选择适当大小的DNA分子量标准（DL2000），检查扩增产物。紫外观察，必要时拍照。如果得到与插入片段大小一致的片段，说明已经成功重组。

注意事项

1.PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的，因此，在进行PCR前，菌液的充分裂解变性和引物设计尤为重要。

2.Mg2+对Taq DNA聚合酶的活性影响很大，有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时，不妨适当增加Mg2+的浓。

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实验九 限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒

实验目的

掌握单、双酶切的技术，理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。

实验原理

(一)酶切

各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序，例如，EcoRⅠ酶的识别顺序为：GAATTC；Scal I

酶的识别顺序为：AGTACT，用EcoR I和Scal I同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链DNA分子，就产生两条带有相应酶切位点的线性DNA分子。

当EcoR I和Scal I同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度，但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专门的缓冲液。如果盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变，例如当盐离子浓度低于50mmol／L时，EcoR I内切酶的专一性就降低，只能识别中间的4个核苷酸序列(称该酶为EcoR I*)。绝大多数酶的反应温度是在370C，酶切反应时间需30min、60min以至2h以上。一般来说，如酶的纯度不佳，酶切时间不能太长。终止酶切反应时，大多数可在65℃水浴中，保温10min，就可使大部分酶失活。EcoR I酶臵65℃水浴中，保温10min，丧失95％的酶活性。内切酶一般都保存在50％甘油的缓冲液中。当保存在10％甘油中时，酶活力丧失更快。少数较耐热的酶，在加热前先加pH7.5的EDTA，至终浓度为10mmol／L。EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子，就更便于终止酶切反应。

酶切要完全，酶解的数量也要适当。设计酶解DNA的数量时，除了根据连接与转化的要求外，还要按照DNA浓度的高低，酶液单位的高低等具体情况而定。同时还要考虑到DNA每经一步处理，就得重新纯化，这样DNA浓度的损失量几乎达到50％。并且每经一步操作后，都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。

至于酶的用量，一般的做法是控制在1U酶在15—20μl中酶解1μgDNA，但具体地分析应该对不同的DNA，酶的用量有所不同，如EcoR I酶对4．3kb的pBR322有一个切点，而对14.5kb的pXZ 6有两个切点，如果不考虑其他构型的影响，则每微克pBR322的酶用量与每微克pXZ6的用量之比应该为1.69：1(酶单位)。

酶解的体积，一般酶切0.2～1.0μg的DNA时，控制反应体积为15～20μl。根据酶解DNA的数量，按比例适当放大体积。如果酶切反应总体积太大，使DNA浓度与限制酶浓度稀释，分子之间难以接触，酶切效果就差，因而尽可能做到反应体积为最小。但是，酶切反应混合物中甘油的含量不能超过5％，否则将会抑制酶的活性(通常将酶量控制在反应总体积的1／10以下)。当使用的限制酶活性不高时，必须加大限制酶的用量。这时为了酶的用量体积不超过反应总体积的10％，其酶切

7 反应体积不可能保持到最小。另外，由于我们提取到的DNA，大多都是保存在TE缓冲液中。如果DNA浓度很稀，加入反应系统中的体积要增大，这时TE中的EDTA将会与酶的激活因子螯合，影响酶切效果。为此，也不得不放大反应体积或者将DNA重新浓缩。

24

双酶切时需要注意以下几点：（1）如果所用两种酶的反应条件完全相同（温度、盐离子浓度等）那么，可以将它们同时加到一个试管中进行酶切。（2）如果所用的两种酶对温度要求不同，那么要求低温的酶先消化，要求高温度的酶后消化，即在第一个反应结束后，加入第二个酶，升高温度后继续进行酶切。（3）如果两种酶对盐离子浓度要求不同，则要求低盐的酶先消化，要求高盐的酶后消化，具体方法是：在低盐缓冲液中加入第一个酶，反应结束后，补加1/10体积的高盐缓冲液，加入第二个酶再消化，或第一个反应结束后抽提DNA，再用高盐缓冲液酶切。目前，各试剂商都提供了双酶切缓冲液或通用缓冲液，可以根据说明书进行操作。 (二)酶切鉴定重组质粒

当空质粒载体的多克隆位点插入外源DNA片断后，可以利用插入两端的限制性内切酶进行酶切对外源片断的重组进行鉴定。如果插入外源片断，两种酶的单酶切将会产生比空质粒大的片段，在电泳上表现为滞后片断。进行双酶切后将得到2条片断，一条和空质粒大小一致的片断令一条与插入片断一样大。

实验内容

试剂与器材

试剂

(1)10×酶切缓冲液(购酶时随附) (2)EcoRⅠ酶；BamH I酶。 (3)无菌水。

(4)质粒pNTE-EGFP。 (5)琼脂糖。

(6)10mg／ml溴乙锭溶液。 (7)DNA分子量参照物（marker）。 (8)50×TAE电泳缓冲液。 (9)10×溴酚蓝上样缓冲液。 器材 (1)恒温水浴 (2)电泳槽 (3)电泳仪 (4)电炉 (5)紫外线检测仪

(6)移液器； 10-100μl,0.5-10μl

实验步骤 酶切

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(1)设计单酶切反应和双酶切反应。

(2)分别加入无菌水于0.5m1离心管中。

(3)分别加人10×酶切缓冲液(反应总体积的1／10)。 (4)分别加入pNTE-EGFP质粒DNA。

(5)分别加入EcoR I；BamH I酶和EcoR I+ BamH I酶。酶量的加入通常是其活力的5-10倍.同时做一个pEGFPN3质粒DNA的EcoR I单酶切。 例如: ddH2O 12μl 10×酶切缓冲液 2μl DNA(1μg) 5μl EcoR I（或）BamH I 1μl 20μl

ddH2O 11μl 10×酶切缓冲液 2μl DNA(1μg) 5μl EcoR I 1μl

BamH I 1μl

20μl (6)混匀，离心5s。 (7) 37℃，1h。

(8)加入3μl 10×溴酚蓝上样缓冲液混匀后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，成像观察。

电泳

（9）称取1.0 g琼脂糖，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中。 (10) 加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。

(11) 凝胶冷至60℃左右，加入溴乙锭至终浓度为0.5μg／m1。

(12) 将琼脂糖溶液倒人模具，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm，检查有无气泡。室温下15～30min后，琼

脂糖溶液完全凝固。

(13) 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色。 (14) 取掉模具两端的胶布，放入电泳槽，加样孔在负极端。

(15) 加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，液面高于胶面1mm，小心取出梳子。 (16) 在DNA样品中加入1／10的上样缓冲液并混匀。

(17) 用移液器将DNA样品加入梳孔中。电泳样品为：酶切样品；酶切前的对照样品；分子量参照物 (18)接通电源，DNA样品往正极移动。电压选择为3～5V／cm。注意：长度以两个电极之间的距离计算。

(19)根据指示剂迁移的位臵，判断是否终止电泳；切断电源后，含EB的凝胶可以直接于紫外线灯下观察结果或拍照记录。

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注意事项

1. 酶切反应的影响因素很多，操作时首先要保证质粒DNA的纯净，样品中过高的盐分和痕迹量的酚等都会使酶切反应无法正常进行。

2. 酶切反应在冰上进行.严格控制内切酶的用量在总反应体积的1/10，否则，甘油浓度过高会抑制酶活性。不同的酶使用不同的反应液,注意相符合.双酶切时选择两种酶活性均较高的反应液,不能选择合适的反应液时,先使用低盐反应液,加入相应的酶,然后补加一定的盐离子和对应的酶. 3. 尽可能地降低反应总体积，增大酶与底物间的碰撞机会，增加反应速度。

4. 倒胶时不能有气泡留在胶层中，电泳时注意去除模具两端的胶布和正负极的对接。

【思考题】

1． 2． 3． 4． 5．

【课外阅读】

大连宝生物公司限制性内切酶说明书.

美国New England biolabs公司说明书,网站:www.neb.com

什么是星号活性？

DNA的酶切实验要注意那些问题？

双酶切的缓冲液应满足什么条件？如何解决？ 使用EB时应注意什么问题？

在做琼脂糖凝胶电泳时应注意什么问题？

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实验十 外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测

实验目的

了解IPTG诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。

实验原理

将外源基因克隆在含有lac 启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。没有加入IPTG诱导剂的时候，lacI 产生的阻遏蛋白与lac 操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制；当加入IPTG后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS-PAGE进行初步鉴定。

不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂(如二巯基乙醇)共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDS结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合SDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS-PAGE电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。

聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用(即分子筛作用)，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。

实验内容

材料：含有重组表达载体pET-B1, 空表达载体pET28b的大肠杆菌BL21。 试剂：细菌培养用的LB液体培养基，（含50μg/ml的卡那霉素）

LB平板（含50μg/ml的卡那霉素），100mMIPTG， 10mg/ml的溶菌酶（10mM Tris-HCl，pH8.0配制）， SDS-PAGE用试剂及考马斯亮蓝R250

30％(W／V)凝胶贮存液（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口罩）

丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g, 加ddH2O溶至100ml，用新华3号滤纸过滤，棕色瓶中4℃保存，每隔几个月须重新配制。 Tris-HCl，pH8.8 1．5mol／L 0.5mol／L Tris—HCl，pH 6.8。 10％SDS。

10％过硫酸铵(AP，新鲜配制)。

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TEMED(四甲基乙二胺)。

Tris-甘氨酸电泳缓冲液，pH8.3，可配成5×贮存液备用，临用前稀释。

Tris碱 甘氨酸 SDS

工作液

25 mmol／L

Tris碱

5×贮存液 15.1g 94g 50ml 至1000ml

250mmol／L (pH 8.3) 甘氨酸 0.1％

1％SDS

加ddH2O

样品处理液

Deionized water 3.8 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.0 ml Glycerol 0.8 ml 10% (w/v) SDS 1.6 ml 2-mercaptoethanol 0.4 ml 1% (w/v) bromophenol blue 0.4 ml

染色液 0.4％考马斯亮蓝—R250染色液。

甲醇 冰乙酸

考马斯亮蓝R250 ddH2O加至

脱色液

甲醇 冰乙酸 ddH2O

400ml 100ml 500ml 400m1 100ml 1g 1000m1

操作步骤

1将冻存的含有组表达载体pET-B1, 空表达载体pET28b的大肠杆菌BL21画线接种在LB平板上，37度培养过夜，直至平板上长出单菌落。

2 挑取单菌落至5mlLB液体培养基中，培养至OD600=0.6左右。4度放臵过夜。 3 取2ml培养菌加入到48ml培养基中，继续培养至OD600=0.4-0.6之间。

4 表达载体和重组载体都分别设臵诱导组与不诱导组，诱导组加入终浓度为1mM的IPTG，不诱导组不加IPTG。25度诱导培养12h。

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5 取1.5ml培养菌至离心管中，5000rpm离心1分钟，收集细菌。

6 用1ml 10mM Tris-HCl（pH8.0）悬浮细菌，5000rpm离心1分钟，收集细菌。 7 加入30ul的 10mg/ml的溶菌酶，充分悬浮，4度放臵2小时以上。 8 制备4%浓缩胶，12%的分离胶的SDS-PAGE胶。 按下表制备浓缩胶

水

30%丙烯酰胺溶液

0.5mol／L Tris-HCl pH 6.8 10％SDS 10％AP TEMED

按下表制备分离胶

6.1 1.33 2.5 0.1 0.05 0.01

9 超声处理5分钟，每30秒间隔50秒，12000rpm离心10分钟，取上清作为蛋白样品。 10 渠5ul测定蛋白浓度。

11 取50ug蛋白上样，加入5ul上样缓冲液，沸水浴5分钟，瞬时离心后上样。 12 170V恒压电泳至溴酚蓝至凝胶前沿。 13 染色1小时

14 脱色至条带清晰，背景明亮为止。

结果： 诱导的pET-B1菌液样品在分子量61kDa处有一明显的深厚条带，而其他三种处理没有

此条带。

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影响蛋白质电泳分离效果的因素

1．蛋白质样品中的盐浓度 影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解

蛋白时最好用去离子水，再加等量2×SDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行Sephader G25过柱。

2．SDS的质量 由于变性蛋白是与SDS结合而带负电荷，蛋白结合SDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同迁移率的电泳图谱。 3．上样孔是否平齐，若上样孔不平齐，也影响蛋白电泳的迁移率。

4．为防止相邻泳道样品的扩散，而导致电泳条带的不整齐，如有空臵的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液。

电泳样品的准备

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1．浓度 单一成分1—10μg，若浓度太稀，应沉淀后再进行电泳；对于非单一成分的样品，如基因工程大肠杆菌的表达产物，其蛋白量50～100μg可取得较好的分离效果。

2．体积 样品体积尽可能小，以保证电泳条带的整齐，必要时可应用6×SDS加样缓冲液以增加蛋白质的加样量。

3．盐浓度应尽可能低，可用SephaderG25快速脱盐；钾离子(K+)要除去，因为钾离子沉淀SDS。 4．分离小分子肽时，分离胶的浓度可提高到20％～25％。

5. 对照孔加入蛋白质分子量标准样品，同样也须1000C处理 3～5min。

注意事项

1. 丙烯酰胺单体和交联剂N，N′—亚甲基双丙烯酰胺有神经毒性，在称量和配制时要带一次性手套，称量时最好也戴上口罩。

2. 凝固后一般不再有毒性，但考虑到存在没有完全交连的分子，实验结束后不宜直接用手拿取，要先用清水漂洗5-10分钟。

3. 室温较低时胶液不易凝固，可以在槽中加370C温水。

4. SDS很容易漂浮在空气中而吸入体内，称量时最好在通风橱中进行，或戴上口罩。 5. 在实际操作中，很容易将电极接反，请注意，负极永远接在加样孔的一端（即上负下正）。

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实验十一 RNA的提取及其纯度检测

实验目的： 了解Trizol提取总RNA的原理，掌握高质量完整总RNA提取的技术以及电泳变性

胶电泳检测和浓度及纯度鉴定方法。

实验原理

Trizol是一种酚与异硫氰胍的混合物，非常容易把组织和细胞中的总RNA提取出来。在加入氯

仿离心后，RNA保留在水相中，与DNA和蛋白质分离开来（保留在有机相中）。吸取水相，加入异丙醇成淀RNA，从而得到完整纯度高的总RNA。

实验内容

材料 小鼠新鲜肝 试剂

总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham)，无水乙醇，已丙醇；

电泳试剂：MOPS，甲酰胺，甲醛，上样缓冲液（50%甘油，10 mM EDTA，0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯青），琼脂糖。

操作步骤 总RNA的提取

1小鼠肝组织的匀浆裂解

断颈处死小鼠，立即解剖取出肝脏，取50-100mg到玻璃匀浆器中，假如1mlTrizol反复匀浆膜碎组织，使细胞完全裂解。按1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，震荡15秒，室温放臵3分钟，12000×g，4℃离心15分钟。 2 RNA的沉淀

将离心的上清转移到新的离心管中，按1 ml Trizol加入0.5ml异丙醇，震荡15秒，室温放臵10分钟，12000×g，4℃离心10分钟。 3 RNA的洗涤与溶解

吸掉上清，加入1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀，4℃，7500×g离心5分钟。吸掉上清，空气干燥RNA沉淀10分钟，加入适量的DEPC处理水溶解RNA，立即电泳和紫外浓度和纯度鉴定，剩余-20℃保存备用。

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在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳

甲醛蒸气有毒，含有甲醛的溶液应在化学通风橱内配制，装有甲醛溶液的电泳槽应尽可能盖严。 1、配制5×甲醛凝胶电泳缓冲液： 5×甲醛凝胶电泳缓冲液

0.1mol／L MOPS（pH7．O） 40mmol／L 乙酸钠 5mmol／L EDTA（pH 8.O)

将20．6g 3-(N-玛琳代）丙磺酸（MOPS)溶于800ml经用DEPC处理的50mmol/L乙酸钠溶液（用DEPC处理溶液的方法见344页）。用2mol/L氢氧化钠将溶液的pH值调至7.0,加10ml经用DEPC处理的0．5mol／L EDTA(pH 8.0），再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L.上述溶液经用 0.2um微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用，而深黄色缓冲液则不然。

小心：DEPC有致癌之嫌，须小心操作。

2、制备凝胶：将适量琼脂糖熔于水，冷却至60℃，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终浓度分别为1×和2．2mol／L（将12．3mol／L甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和5×甲醛凝胶电泳缓冲液按1：3．5：1.1比例混合即可）。在化学通凤橱内灌制凝胶。于室温放臵30分钟或更长时间，使凝胶凝固。

甲醛（分子量30.03）通常为37％的水溶液（12.3mol／L），应确证这一浓溶液的pH值大于4.0. 3、 在一灭菌的微量离心管内混合下列液体，以制备样品： RNA（多达30ug) 4ul 5x甲醛凝胶电泳缓冲液 21ul 甲醛 3.5ul 甲酰胺 10.0ul

于65 C温育15分钟，冰浴冷却，离心5秒钟使管内所有液体集中于管底。 4、 加2ul灭菌的并经用DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液。 甲醛凝胶加样缓冲液 50％ 甘油

1mmol／L EDTA（pH8．0） 0．25％ 溴酚蓝

0.25％ 二甲苯青FF

5、加样前，将凝胶预电泳5分钟，电压降为5V／cm，随后将样品加至凝胶加样孔。 6、将凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，3-4V／cm电压降进行电泳。

7、电泳结束后浸入溴化乙锭溶液（0．5ug／m1，用0．1mol／L乙酸铵配制）中染色30-45分钟。 与未变性的琼脂糖凝胶相比，含甲醛的凝胶较为脆弱，故应小心操作。

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结果

在凝胶上可以看到一般可以看到三条带，其中从上样孔开始对应的带的分别是28S,18S和5S，其中18S和28S的条带明显清晰，而5S的带比较弱，28S的带的亮度是18S带亮度的2背左右，说明RNA保持完整。

紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度

总RNA用10mM的Tris-HCl(pH8.0)稀释，利用紫外分光光度计测定A260和A280值，根据1OD=40ug定量,并计算A260/A280比值，每一样品重复3次。

如果A260/A280比值均在2.0以上（2.0－2.2之间），说明RNA的纯度很好。

注意事项

创造无Rnase的环境

注意以下几点，以防止Rnase污染样品，保证分离到全长mRNA：

1、 手和空气中的细菌霉菌是主要的Rnase污染源。为防止污染，应在超净台上无菌操作。这些试剂都要反复使用，所以开启和关闭试剂瓶一定防止污染。一直带塑料手套。

2、最好用一次性使用塑料制品提RNA，这些制品常是无RNase的，无须灭活RNase。

3、不是一次性使用的玻璃和塑料制品，用前应除RNase。玻璃制品应于200℃烘烤过夜，塑料制品用前用0.1N NaOH，1mM EDTA作彻底冲洗，再用无RNase水冲洗。

4、用户自备的溶液应用0.05TPC处理过夜，再高压灭菌30分钟以出去痕量DEPC。

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实验十二 逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段

实验目的 了解RT-PCR的原理，掌握 RT-PCR扩增基因的特异片段的技术。 实验原理

PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。

虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

编码蛋白质的基因在转录后形成mRNA，mRNA 翻译后编码产生蛋白质。真核生物的mRNA 的3端有多个腺苷酸，形成寡聚腺苷酸的尾巴，因此可以与Oligo dT结合，在反转录的作用下形成cDNA。再通过基因的特异引物PCR扩增得到基因的特异片段，此方法称为2步法。也可以根据已知基因的序列设计引物，以基因的特异引物进行逆转录，得到特异基因的cDNA，以此为摸板PCR扩增得到特异基因片段，由于此法转录和PCR扩增在同一反应管中进行，转录和扩增的引物相同，因此称为一步法。

One Step RT-PCR的原理

一步法的优点：

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实验内容

材料 小鼠新鲜肝

试剂 总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham) 无水乙醇，已丙醇；

RT-PCR试剂盒 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)（大连宝生物生物公司）

本试剂盒采用了一步反应法（One Step法）完成RT-PCR反应。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应中途不需添加任何试剂，就可以完成由AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶从RNA反转录为cDNA，再由AMV-Optimized Taq扩增cDNA的全部反应。本试剂盒中含有进行One Step法RT-PCR反应用的全部试剂，可以简便而有效地对RNA进行扩增分析。

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经

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体外转录而得到的。Control RNA（约1.4 kb）是带有30个A碱基的具有Poly(A)+尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。

操作步骤

1总RNA的提取根据上次实验总RNA的提取进行。

2 按下列组成配制RT-PCR反应液。

3 按以下条件进行RT-PCR反应。

当RNA为Positive Control RNA时，反应条件如下。

4反应结束后，取PCR反应液 (5 –10ul) 进行1%琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。 如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。 Control反应时扩增片段大小为462 bp。

思考题 一步法和两步法RT-PCR的有何差别，在实际应用上体现在哪些方面？

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实验十三 DNA探针制备

实验目的

了解双链DNA的缺口平移和随机引物标记法的原理以及掌握其技术。

实验原理

在基因分析的杂交方法中几乎都用到同位素或非同位素标记的探针。制备探针的方法有DNA缺口平移标记、随机引物标记、DNA末端标记、寡核苷酸末端标记、引物延伸法标记、RNA探针标记以及非同位素标记等。每一种标记方法有各自的特点和适用范围。

缺口平移标记法

原理 DNA酶I是一种核酸内切酶，它可在DNA两条链上随机酶切形成缺口，缺口的3＇端为3＇-OH。DNA聚合酶I具有5＇→3＇外切酶活性和依赖引物和模板的5＇→3＇聚合酶活性。在缺口上DNA聚合酶Ⅰ沿5＇→3＇将缺口端的5＇-单核苷酸切除，同时将游离的dNTP加在缺口的3＇-OH上，结果使缺口沿DNA平移(Nick translation)。如果添加的dNTP中含一种或几种[α-32P]dNTP，那么双链DNA就带上很高比活度的放射性(108cpm／μg)，掺入效率>65％。

随机引物标记法

原理 随机引物标记法DNA用量少(25ng)，同位素掺入较高(60％左右)，最高放射比活度超过1×109cpm／μg。随机引物结合于线性变性单链DNA模板的多个位点，在Klenow酶作用下进行5＇→3＇引物延伸反应，标记同位素的dATP就随此过程掺入，一般可合成250—300 bp的标记探针(模板大于500bp)。

实验内容

缺口平移标记法

材料 DNA酶(DNaseI)、DNA聚合酶I(Promega公司试剂盒提供按一定比例混合的混合物)。[α-32P]dATP、dGTP，dCTP，dTTP(各300μmol／L)；缺口平移缓冲液(10×)，待标记DNA 1μg，终止液(0．5mol／LEDTA)。

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方法

(1)混合下列试剂：

试剂

dCTP、dGTP、dTTP混合液各30μmol／L 缺口平移缓冲液 10× DNA

[α-32P]dATP(100mCi/ml)

DNA酶I和DNA聚合酶I混合液 ddH2O 总 计

(2)15℃反应60min。 (3)加5μl终止液终止反应。

(4)-20℃保存备用，如立即使用一般保存在4℃或0℃。

体积 10μl 5μl 1μg 5μl 5μl 24μl 50μl

随机引物标记法

材料 Klenow酶，[α-32P]dATP，dTTP，dGTP，dCTP，10 ×标记缓冲液(900mmol／L HEPES，MgCl2 100mmol／L，pH6.6)，待标记DNA 25ng。 20

方法

(1)DNA(25ng溶于TE或H2O)95～100℃变性2min，迅速臵冰浴中。 (2)加入下列试剂：

试剂

dCTP dGTP dTTP混合液各500μmol 标记10×6μg

[α-32P]dATP(100mCi/ml) Klenow酶 ddH2O 总 计

(3)室温反应60min。

(4)95～100℃加热2min并臵冰浴以终止反应。

体积 2μl 5μl 5μg 5μl 33μl 50μl

标记探针的纯化 1．沉淀法(适用于>18bp的探针)

(1)标记反应混合物(20μl)中加入40μl水。

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(2)加入240μ1NH4Ac(5mol／L)混匀。

(3)加入750μl冰预冷的无水乙醇，0℃臵30min。 (4)0℃12 000r／min离心20min沉淀标记探针，弃上清。

(5)加入500μl 75％乙醇，振荡后离心5min(12 000r／min)，弃上清，空气干燥。 (6)沉淀重溶于水中，备用。 2．柱层析法

(1)取5ml容积的玻璃或塑料吸管，管口用纤维填塞， (2)装SephadexG-50凝胶，3倍柱体积的STE洗脱。

(3)标记的DNA探针上样，样品进入凝胶后，加STE液洗脱。

(4)分管收集流出液，每管200μl，标记探针存在第一放射峰中，弃其余。 (5)合并第一峰数管洗脱液，体积过大可乙醇沉淀。

注意事项

1．缺口平移适用于双链DNA(超螺旋，开环，线性)的标记，反应时间不宜超过2h。随机引物

法适用于双链、单链DNA和RNA探针的标记，反应时间可长达16h。

2．一般杂交可不经纯化。

3．由于高比活放射性会造成DNA链的破坏，探针以马上使用为宜。

4．由于缺口平移法标记中DNA酶I和DNA聚合酶I的比例十分重要，许多购买的试剂盒都已

按比例混合，不必再自行探索条件。

【思考题】

1缺口平移的原理是什么？有什么用途？ 2.随机引物法适于哪种样品的标记？

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实验十四 Southern印迹杂交

实验目的

学习和掌握Southern印迹杂交技术，检测重组DNA分子中是否含有目的基因片段。

实验原理

具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程

是高度特异性的。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting)；二是固定于膜上的核酸同同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。这种技术是E．M．Southern l975年首创的，因此称Southern印迹杂交。

Southern印迹的印迹方法有毛细管法、电转法、真空转移法，滤膜有尼龙膜、化学活化膜(如ABM、APT纤维素膜)等。这里主要介绍目前常用的电转法。

电转法是利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，是近年来发展起来的一种简单、迅速、高效的DNA转移法。一般只需2～3h，对于用毛细管法不理想的大片段DNA的转移较为适宜。常用的电转仪有铂金丝电极和石墨电极。

实验内容

材料和试剂 印迹试剂

l．待测样品，适当的限制性内切酶、琼脂糖。

2．变性液 1.5mol／L NaCl，0.5mol／LNaOH，高压灭菌。

3．中和液 1mol／L Tris〃HC1(pH8.0)，1.5mol／L NaCl，高压灭菌。 4．电泳液和转移液 1×TBE或TAE。 5．尼龙膜、铂金丝电极电转仪。 杂交试剂

1．预杂交液 5×Denhardt试液，50mmol／L磷酸缓冲液(pH7.0)，0．2％SDS，500μg／m1变性的鲑精DNA片断，50％甲酰胺(也可不用)。

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2．20×SSC，3mol／L NaCl 0.3mol／L柠檬酸钠。 3．2×SSC，0.1％SDS 溶液。 4．0.1×SSC，0.1％SDS溶液。

5．0.1×SSC溶液。

6．10mg／ml小牛胸腺DNA溶液(或鲑鱼精DNA溶液)。 7．32P标记的DNA探针。

操作步骤 电转移

1．取一定量的待测DNA样品，适当限制性内切酶酶切后，琼脂糖凝胶电泳。

2．电泳后溴化乙锭(EB)染色，长波紫外线观察电泳结果。

3．切去无用的凝胶部分，将凝胶浸泡于适量变性液中，轻轻摇动1h。对于较大的DNA片断(>15kb)，可于变性前用0.2mol／L HCI预处理10min使脱嘌呤，再进行碱变性处理。

4．将疑胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量中和液30min，轻轻摇动，重复一次。将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。

5．裁剪4张同凝胶大小相同或稍大的Whatman 3MM滤纸，浸泡于1×TBE或TAE中，取2张臵于一海绵上。

6．裁剪一张同凝胶大小相同的尼龙膜，臵水中使其从底部向上浸润，然后臵于1×TBE或TAE中浸泡。

7．将充分湿润的尼龙膜覆盖于凝胶上，一端与加样孔对齐，注意排除二者间的气泡。 8．在尼龙膜上再覆盖两张润湿的Whatman 3MM滤纸，然后盖上另一张海绵。

9．海绵两侧夹上凝胶支持夹，臵于电转仪中，注意尼龙膜一侧臵于正极，凝胶一侧臵于负极。 10．300～600mA恒流电泳，4～8h，循环水冷却。

11．电转完毕，尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗，干燥滤纸吸干。 DNA固定

尼龙膜可用短波紫外线照射几分钟，或者真空下80℃烘烤2h，以使DNA固定于尼龙膜上。

放射性核素探针杂交

1．将上述固定了DNA的尼龙膜浸泡于6×SSC溶液5min，充分湿润。

2．尼龙膜臵于一塑料袋中，加入适量预杂交液(0.2ml／cm2膜面积)，尽量排除其中气泡，用塑料封口机封牢。

3．恒温水浴中保温2h，当预杂交液加入了50％甲酰胺时，恒温42℃，不加甲酰胺时，恒温68℃。

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4．从水浴中取出塑料袋，去除部分预杂交液，加入单链DNA探针，排除气泡后，重新封好口。 5．根据退火条件选择合适的温度保温。一般在45～68℃之间，视所用探针与待测核酸的同源性大小而定，保温16h左右。

6．杂交完毕，取出塑料袋，弃去所有的杂交液，取出滤膜，迅速浸泡于2×SSC和0.5％SDS溶液中，室温下不断振荡，10min，重复一次。

7．将滤膜转至2×SSC和0.1％SDS溶液的容器中，室温下漂洗15min。

8 滤膜转至0.1×SSC和0.1％SDS溶液中，65℃水浴振荡漂洗30min，直到用检测器检不出信号为止。

9．室温下，0.1×SSC漂洗5min，滤膜晾干后放射自显影。 放射自显影

1．将Southern膜臵于干净滤纸上，用含同位素的墨水在膜上作标记，以确定方位和检测放射自显影的效率。

2．用塑料薄膜把Southern膜包好，上压一张X线片，两边附增感屏，夹于暗盒中；-70℃曝光，24～48h后洗片，本操作须在暗室中进行。

注意事项

1．电转法不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物，因为硝酸纤维素膜结合DNA依赖于高浓度

盐溶液，而高盐溶液导电性强，会产生强大电流使转移体系温度急剧升高，破坏缓冲体系，从而使DNA受到破坏。

2．如果用寡核苷酸探针或同源性较低的探针，杂交温度可适当降低，届时洗膜温度也要视情况而定。

【思考题】

1． Southern印迹杂交技术的基本原理是什么？

2． 你知道Southern印迹杂交技术在医学领域有哪些应用价值？ 3． Southern印迹杂交实验应注意哪些问题？

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实验十五 Northern印迹杂交

实验目的

学习用标记探针杂交分析RNA样品中特定mRNA的大小及丰度。

实验原理

Northern印迹杂交是Southern印迹杂交的基础之上发展而来的一种技术。其基本原理是：将RNA

样品通过琼脂糖凝胶进行分离，再转移到固相支持载体上，用同位素或生物素标记的探针对固定于膜上的mRNA进行杂交，将具有阳性信号的位臵与标准分子量分子进行比较，可知此mRNA的分子量大小，根据杂交信号的强弱进行比较，可知基因表达的丰度，因此这一技术广泛应用于基因的表达调控、结构和功能研究。

Northern印迹基本原理与Southern印迹类似，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，否则会引起RNA的水解。本实验以毛细管虹吸印迹法为例介绍RNA的转移过程，此方法稍加修改后也可用于Southern印迹。RNA膜转移完成后，杂交方法和一般核酸分子杂交类似。

实验内容

材料与试剂

1．待测细胞总RNA或mRNA。 2．杂交探针 同位素32P或生物素标记。 3．5×甲醛凝胶缓冲液： 0.1 mol／L MOPS(pH 7.0) 40mmol／L 乙酸钠 5mmol／L EDTA(pH 8.0)

制备方法：20.6g MOPS溶于800ml用DEPC处理过的50mmol／L乙酸钠溶液中，用2mol／L NaOH调节pH至7.0，然后加入10ml 0.5mol／L EDTA，用DEPC预处理过的蒸馏水调节体积至1000ml，0.2μm微孔滤膜过滤，室温下避光保存。

4．甲醛凝胶上样缓冲液： 1mmol／I EDTA(pH 8.0) 0.25％ 溴酚蓝 0.25％ 二甲苯青

DEPC处理并高压灭菌，室温保存。

5. 100×Denhart's溶液，20×SSC，等预杂交、杂交所用试液与Southern印迹相同。

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