二恶英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

二恶英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

36 生理生化中国畜牧兽医　2009年第36卷第12期

二噁英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

彭洁1,高洪2

(1.云南农业职业技术学院,昆明　650212;2.云南农业大学,昆明　650201)

摘要:本试验研究了二噁英对大鼠肝脏芳香烃受体(arylhydrocarbon,AhR)(freeradical

scavenger,FRS)的保护效应。动物随机分为3组:对照组(Ⅰ组)、(Ⅱ)Ⅲ组)。3组动物

经相应处理后分别在4、8、12、16d采集血液和肝脏作为检测样本。)水平在4、8、12、16d测定时明显高于Ⅰ(P<0.01)、Ⅲ组(P>0.05),Ⅱ,SOD)水平在4、8、12、16d测定时明显高于Ⅰ(P<0.01)、Ⅲ组(P>0.AhR,极少量的存在于胞核中;Ⅱ组随着时间变化呈增加趋势,在4d明显低于Ⅰ(),dP>0.05)、12、16d(P<0.01);Ⅲ组在第4天AhR基因表达的变化类似于Ⅰ组,;Ⅰ,Ⅱ组随时间的增加明显增多(P<0.01),Ⅲ组也有所增加,AhR的表达,从而发挥各种毒性效应,最终导致机体的损伤;而FRS则能明显抑制二噁英对肝脏中AhR的影响,从而抑制各种毒性效应,对由二噁英诱导的肝损伤具有显著的保护效应。进一步说明了体内自由基水平的升高在二噁英中毒的发生、发展中发挥了重要作用。

关键词:二噁英;芳香烃受体;自由基;保护效应

中图分类号:S856.9　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:167127236(2009)1220036206

二噁英(Dioxin)是一类毒性极高的环境持续污染物,不具备环境相关性(吴文忠,2006)。在环境中累积,不仅破坏了生态环境,且经过生物链富集,严重危害动物和人类健康。其毒性极强,是氰化钾的100倍(Pirjo等,2001;Takko等,2004),巨大的毒

及AhR,但是由于Dioxin毒性效应的多样性及AhR分布的广泛性,AhR介导Dioxin各种不同毒

性效应的确切机制还不甚清楚,仍有待于进一步的研究。

目前Dioxin检测方法的研究主要集中于色谱法、免疫法和生物检测法三大类。色谱学方法处理复杂、要求高、费用高。免疫学方法与色谱学方法相比其优势在于所需时间短、操作简单、费用低、选择性好、灵敏度高,本研究用免疫组化的方法检测AhR,进一步探索Dioxin的毒性机制和检测方法。

本试验研究拟用Dioxin、Dioxin+FRS处理试验动物,采用电子显微照像和免疫组织化学等技术,从自由基的角度探讨Dioxin对肝脏AhR的影响及自由基清除剂对机体受损的保护作用,进一步深入认识与理解Dioxin的毒性机制,并为相关药物的设计和开发提供试验依据。1　材料与方法

1.1　主要试剂　PCB(纯度99%,德国Dr.Ehren2storfer公司)、二甲基亚砜(DMSO)、超氧化物歧化

性在沉淀积累之后无法排泄降解,是致癌的首号元凶,可引起人体部位的肿瘤,具有强烈的致癌、致畸、致突变的作用,且具有生殖毒性、免疫毒性、内分泌毒性(Catherine等,2005;Lanice等,2005)。由于Dioxin的特殊性质,人们经过二十多年的研究对Dioxin的机理有了一定的认识,但对Dioxin的毒性

机制并不完全清楚。目前许多学者认为Dioxin并不与蛋白质和核酸形成加合物,也不直接损害细胞DNA,它主要是通过与AhR相结合,两者形成的复

合物与胞内Dioxin反应增强子作用,诱导特异基因的表达,其又产生表达产物,可将前致癌物转化为致癌物,从而促进机体癌症的发生(Yugo等,2005)。研究结果发现,大部分Dioxin毒性效应的发挥都涉

收稿日期:2009206226

作者简介:彭洁(1981-),女,云南人,助教,硕士,研究方向:分

子病理与比较病理学。

通信作者:高洪。

基金项目:云南省中青年学术技术带头人培养专项(2004PY012

11)。

酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、免疫组化检测试剂盒、芳香烃受体单克隆抗体等。1.2　主要仪器设备　LEICA2RM2128转轮式切片

机、YXQ2SG462280压力蒸汽灭菌器、PHB23pH酸

二恶英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

中国畜牧兽医　2009年第36卷第12期生理生化 37

度计、UV755B紫外可见分光光度计、Olympus显微镜(日本)、MoticamBA400病理图像分析仪。1.3　动物分组与处理　清洁级SD大鼠72只,雌

2.1.2　血清抗氧化系统(T2SOD)各指标测定结果

　由图2可知。Ⅰ、Ⅲ组血清中T2SOD水平明显高

于Ⅱ组,差异极显著(P<0.01)

。

雄不限,体重(200±20)g,由昆明医学院实验动物科提供。临床确认健康后,单笼、颗粒饲料预饲养3d,自由饮水,编号并随机分成3组:Ⅰ组为正常对照

组(n=24),腹腔注射等量生理盐水;Ⅱ组为Dioxin

染毒组(n=24),染毒剂量为50μg/kg,质量浓度为25μg/mL,采用一次性腹腔注射给药;Ⅲ组为染毒Dioxin加自由基清除剂保护组(n=24),和给药方式同上组,FRS给药。

1.4　　34、8、12、166只大鼠采血后,采集肝脏,

分别放入2.5%戊二醛溶液、10%中性福尔马林,制备肝脏组织切片(方福德等,1995;季建平,2000)。1.5　血清MDA和SOD测定

1.5.1　血清MDA测定　按说明书配好工作液,采

集血液,3000r/min离心,所得上层血清用于MDA测定。剩余血清置于-20℃保存。加试剂和样品,离心、旋涡充分混匀,95℃恒温水浴40min,流水冷却,3500～4000r/min离心10min,波长旋扭调至532nm,测定待测样品(标准管、标准空白管、测定管),并记录所得光密度值。

1.5.2　血清SOD测定　按说明书配好工作液,采

2.2　肝脏中AhR表达的情况　①肝细胞胞浆中AhR表达的变化。对照组肝脏中AhR主要存在于

集血液,3000r/min离心,所得上层血清用于SOD测定。剩余血清置于-20℃保存。用羟胺法测定血清中SOD,波长为550nm。

1.6　肝脏中AhR的检测　用二步法(非生物素系

胞浆中,极少量存在于胞核内;细胞浆内Dioxin组

AhR的表达量随着时间变化呈增加的趋势,相对于对照组4d时数量明显减少,差异显著,8、12、16d时明显增加,第8天左右AhR的量恢复到正常水平,12、16d差异极显著;Dioxin+FRS组减少和增加的趋势较Dioxin组缓慢,除第8天其余差异显著,如图3所示

。

统)检测肝脏中的AhR。镜检免疫组化染色切片,阳性反应信号呈棕褐色或棕黄色着染。检测指标与方法:每个样品取5个视野,40倍物镜下观察免疫组化阳性物的分布,使用MoticMed6.0数码图像分析软件测定以上样品阳性物质所占的面密度,并利用SPSS软件进行均数运算和方差分析,分析试验组和对照组数据之间的差异显著性。1.7　统计与分析　利用SPSS软件对试验数据进行统计分析,组间差异采取显著性t检验分析。2　结果2.1　血清自由基测定结果

2.1.1　血清MDA测定结果　由图1可知,Ⅰ、Ⅲ组血清中MDA水平明显低于Ⅱ组,差异极显著(P<0.01)。

图3　肝细胞胞浆中AhR积分光密度(n=6)

②肝细胞胞核内AhR表达的变化。肝脏对照

组中胞核内有极少量存在,Dioxin组4、8、12、16d核内的表达量随着时间的变化明显增加,差异极显

二恶英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

38 生理生化中国畜牧兽医　2009年第36卷第12期

著;Dioxin+FRS组增加趋势较其缓慢,与Ⅱ组差异

显著,如图4所示

。

图4　n6)

2.3　肝脏中　免疫

,自身对照组中肝细胞胞浆内

有少量AhR存在,细胞核内有极少AhR存在(图5)。阴性对照组未见AhR的表达(图6)。Dioxin处理组第4天时肝细胞胞浆内AhR的表达明显减少,核内有少量表达(图7);第8天时肝细胞胞浆中AhR的表达增加,基本恢复到正常水平,核内表达较4dDioxin增多(图9);第12天时肝细胞胞浆AhR的表达急剧增加,核内有大量AhR表达(图11);第16天时肝细胞胞浆AhR的表达明显增加,

核内见更大量的表达(图13)。Dioxin+FRS处理组:第4天时肝细胞胞浆AhR的表达较Dioxin组多,核内较Dioxin组少(图8);第8天时肝细胞胞浆AhR的表达较Dioxin组少,核内表达较前组减少(图10);第12天时肝细胞胞浆AhR的表达较Dioxin组明显减少,核内表达较前组也明显减少(图12);第16天时肝细胞胞浆AhR的表达较Dioxin组明显减少,核内表达较前组也明显减少(图14)

。

)图5　自身对照组肝细胞中AhR的表达(400×　　注:肝细胞胞浆有棕色阳性物质,核内见少量存在。图中深色箭

头所指处为胞浆内的AhR,浅色箭头所指处为核内的AhR。

下同。

二恶英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

中国畜牧兽医　2009年第36卷第12期生理生化 39

)图1416的表达(400×

:16天Dioxin组有所16天Dioxin少。

讨论

研究结果发现,大部分Dioxin毒性效应的发挥都涉及AhR,主要是AhR介导相应基因的表达,从而激活酶活性和蛋白质的功能。从这个意义上说AhR调节着Dioxin的生物学效应。Dioxin的毒性

作用是通过AhR等一系列信号分子介导的。芳香烃受体也被称为二噁英受体,是一相对分子质量高的蛋白质聚合物,AhR是以多种芳香族化合物为配体的转录因子(ligandtranscriptionfactor,LTF),它是人和动物体内普遍存在的由配体结合激活的内源性转录因子,其与配体结合可诱导与毒物代谢有关的I相酶和Ⅱ相酶,I相酶主要是细胞色素P450超家族成员,包括CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1等,Ⅱ相酶主要是葡萄糖醛酸转移酶、GST等。Dioxin作为配体与AhR结合,形成配体—受体复合物,AhR上的2个热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)90脱落,结合Dioxin的活化AhR与胞浆中的ARNT结合形成异源性蛋白质二聚体,这一复合物

被转运到细胞核中,与DNA上的DRE序列结合,结合后,DNA的构象发生改变,与DRE相连的特定基因发生转录,造成细胞增生和分化发生改变,进而导致相应的毒效应,但AhR与相应的生物学效应之

间的复杂关系仍不清楚(Wan等,2005)。AhR既可以与ARNT在核内形成异二聚体,诱导许多I相和Ⅱ相外源化合物代谢酶的表达,还参与许多毒性反应和其他一些重要的生物学过程,如信号转导、细胞分化、细胞凋亡等(Godowsky等,2005)。所以,研究AhR对于阐明Dioxin的毒性机制乃至环境化学物质的致癌机制都有非常重要的意义。

试验结果显示,对照组肝脏中AhR主要存在于胞浆中,极少量存在于胞核内;细胞浆内Dioxin组AhR的表达量随着时间变化呈增加的趋势,相对于

二恶英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

40 生理生化中国畜牧兽医　2009年第36卷第12期

对照组第4天时数量明显减少,差异显著,8、12、16d时明显增加,第8天左右AhR的量恢复到正常水

AhR的量在数小时内就会减少,这种减少最长可持

续72h(Giannone等,1998)。体内试验结果发现,给动物急性染毒,AhR的量很快减少,最短的仅数小时,但经过10～14d,AhR的量又恢复到原来的水平,伴随着AhRmRNA表达的增加。亚慢性试验结果发现,持续低剂量的对大鼠肝脏内

AhR无明显的影响(Franc。根据AhR在及内的,AhR作为Dioxin的量及

平,12、16d差异极显著;Dioxin+FRS组减少和增加的趋势较Dioxin组缓慢,除第8天外其余差异显著。肝脏对照组中胞核内有极少量AhR存在,Dioxin组4、8、12、16d核内的表达量随着时间的变

化明显增加,差异极显著;Dioxin+FRS组增加趋势较其缓慢,与Ⅱ组差异显著。

免疫组织化学的结果显示,对照组中肝细胞胞浆内有少量AhR存在,细胞核内有极少Dioxin处理组第4,Dioxin组AhR的数量持续增长,而Dioxin+FRS组AhR的增长趋势明显弱于Dioxin组,说明FRS具有颉颃Dioxin毒性的作用,

明显减少,;AhR,核内表达

较4dDioxin;12天时肝细胞胞浆内AhR的表达急剧增加,核内有大量AhR表达;第16天时肝细胞胞浆内AhR的表达明显增加,核内见更大量的表达。Dioxin+FRS处理组:第4天时肝细胞胞浆内AhR的表达较Dioxin组多,核内较Dioxin组少;第8天时肝细胞胞浆内AhR的表达较Dioxin组少,核内表达较其减少;第12天时肝细胞胞浆内AhR的表达较Dioxin组明显减少,核内表达较其

从而保护机体。有研究结果表明,AhR核定位/DRE结合区域发生突变的小鼠,小鼠中还出现与AhR等位的肝脏发育异常,提示大多数AhR介导

的生物学效应发挥的前提是被转位入核(陈刚等,

2005)。4　结论

本研究结果表明,大鼠Dioxin中毒可引起AhR基因表达的变化,其随时间的变化呈增加的趋势,与对照组相比先减后增,且引起AhR从胞浆进入胞核,从而发挥各种毒性效应。根据这一毒性机制及AhR胞浆内及核内的变化,AhR作为Dioxin受体,AhR的变化即能反映Dioxin的量及生物学效应,

也明显减少;第16天时肝细胞胞浆内AhR的表达较Dioxin组明显减少,核内表达较其也明显减少。阴性对照组未见AhR的表达。

本研究免疫组化的研究结果说明AhR在Dioxin组第4天表达量下降,这可能有两方面的原

从而探索一种免疫学的检测方法。

参考文献

1　方福德,周吕,丁濂,等.现代医学实验技巧全书[M].北京:北京

因:①Dioxin的毒性致使AhR的活性下降;②Diox2in剂量比较低时,肝脏内现有的AhR与Dioxin结

合,结合量小,并经一系列过程把Dioxin转运到细

胞核内,而诱导相应的基因(如CYP1A1)表达,此时AhRmRNA不被诱导,导致细胞内的AhR少;第8

医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1995,466～469.

2　王伯沄,李玉松,黄高昇,等.病理学技术[M].北京:人民卫生出

版社,2000,32～98.

3　陈刚,丁慧,韩胜义.二噁英的危害及其防治[J].黑龙江环境通

天时恢复至正常水平,12、16d迅速增加,Dioxin剂量较高时,肝内现有的AhR不足以与Dioxin结合时,AhRmRNA被诱导,产生了更多的AhR与Dioxin结合,所以此时AhR表达增加。而Dioxin+FRS组AhR表达量随着时间的增加呈先减少后

报,2005,29(4):20～22.

4　季建平.实验方法学[M].南京:南京科学出版社,2000,1～6.5　CatherineSE,BarryD.MechanismsofDioxinformationfromthe

high2temperatureoxidationof22chlorophe2nolEnviron[J].SciTechnol,2005(39):122～127.

6　FrancMA,PohjanvirtaR,TuomistoJ,etal.Invivoup2regula2tionofarylhydrocarbonreceptorexpressionby2,3,7,82tetra2chlorodibenzo2p2dioxin(TCDD)inadioxin2resistantratmodel.BiochemPharmacol,2001,62:1565～1578.

7　GiannoneJ,ProbetM,eta1.ProlongeddepletionofAHreceptor

withoutalterationofreceptormRNAlevelsaftertreatmentofceilsinculturewith2,3,7,82tetrachlorodibenzo2p2Dioxins.Bio2

增加的趋势,但其趋势明显弱于Dioxin组,说明FRS具有颉颃Dioxin毒性的作用,从而保护机体。

但是由于Dioxin毒性效应的多样性及AhR分布的广泛性,AhR介导Dioxin的不同毒性效应的确切机制还不甚清楚,仍有待于进一步的研究。

有研究结果表明,在培养细胞中加入Dioxin,

二恶英中毒对AhR基因表达和自由基水平的影响

中国畜牧兽医　2009年第36卷第12期

chemPharmacol,1998,55:489～497.

8　GodowskyDL,YokeW.TypicalDioxinconcentrationsinagri2culturesoilsofWashingtonstateandpotentialsourcesEnviron[J].SciTechnol,2005(39):5170～5176.

9　LaniceKH,GeraldLL.Polychlorinateddioxins,furans,andbi2phenyls,andpolybrominateddiphenylethersinaUSmeatmar2ketbasketandestimatesofdietaryintake[J].EnvironSciTech2no1,2005(39):5606～5611.

10PirjoI,TuulaT,eofoliveoilforsoilextractionand

uhravioletdegradationofpolychlorinateddibenzo2p2DioxinsanddibenzofuransEnviron[J].SciTechnol,2001(35):1259～1265.

生理生化 41

11TakkoK,AkioY,TakayukiS.FormationofDioxinsfromincin2

erationoffoodsfoundindomesticgarbageEnviron[J].SciTech2nol,2004(38):1062～1065.

12WanY,HuJY,YangM,etal.CharacterizationoftroDhic

transferforpolychlorinateddibenzo2p2Dioxins,dibenzofurans,non2andmono2orthepolychlorinatedbiphenylsinthemarinefoodwebofBohaiBay,NorthChinaEnviron[J].SciTechnol,2005(39):2417～2425.

13YugoNNH.ofdegradationmech2

ofduringment[J].Environ()5176.

TheEffectofofGenesandtheFreeRadical

PENGJie1,GAOHong2

(YunnanAgriculturalOccupationTechnicalCollege,Kunming650212,China;

2.YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

Abstract:TheexperimentwasaimedattheeffectofDioxinonAhRandtheprotectiveeffectoffreeradicalscavenger　　

(FRS)intheliver.Seventy2tworatswererandomlydividedintothreegroups:thecontrolgroup(groupⅠ),Dioxintreatment)andGC+Dioxintreatmentgroup(groupⅢ).GCwasusedtostudytheantagonisticeffectsofDioxin.Aftergroup(groupⅡ

four,eight,paredwithcontrolgroup,theDioxingrouptheSODsignificantlydecrease(P<0.01),andtheMDAlevelssignificantlyincreased(P<0.01).Theresultoftheimmunohisto2chemicalexaminationwithAhRexhibitedthattheAhRdecreasemarkedly(P<0.05)at42dayageandincreaseobviouslyat8dayage(P>0.05)andatthe12,162dayage(P<0.01).Ontheotherhand,comparedwithDioxinsgroupsGCgroupscanin2hibitthedecreasingandincreasing(P<0.05).TheseresultsindicatedthatDioxincoulddown2regulatetheAhRatfirstandthanup2regulateitintheotherdays.Inthenuclear,theDioxinsgroupincreaseobviously(P<0.01)atthe4,8,12,162dayagecomparedwithcontrolgroup.ThencomparedwithDioxingroupsGCgroupscaninhibittheincreasing(P<0.05).There2sultsshowedthatratDioxinpoisoningcanimpactthequantityofAhR,andenducevariouskindspoisoningeffects.GChassig2nificantprotectiveeffectoninjuriesofDioxinintheliver.

Keywords:Dioxin;AhR;freeradical;protectiveeffect

饲喂高蛋白质酒糟对荷斯坦奶牛产奶量的影响

K.J.Hubbard等著　臧长江摘译　杨永新校

摘要:本试验旨在评价饲喂高蛋白质干酒糟(HPDDG)　　

对奶牛瘤胃降解率、干物质采食量、产奶量和乳成分的影响。选择16头泌乳荷斯坦奶牛(12头经产牛和4头初产牛),平均泌乳日龄80±14d,随机分配2种处理日粮,采用2×2交叉试验设计。用HPDDG(20%干物质)替换对照组日粮中的全部大豆蛋白和部分粗饲料。每期试验21d,在第19～

21天每天记录产奶量和干物质采食量;每期的第20～21天

kg/d±0.05kg/d);HPDDG的替换对乳脂率(平均3.95%

±0.20%)无显著影响,但乳脂肪产量增加(1.35和1.21±0.09kg/d)。交叉试验处理对奶牛干物质采食量(平均为

21.9kg±0.80kg)没有影响。HPDDG的替换,使奶牛产奶

量增加和饲喂消耗得到了改善。HPDDG替换组奶牛乳尿氮水平(14.5和12.8±0.67mg/dL)高于对照组。因此,本试验建议HPDDG可以有效地替换泌乳奶牛日粮中以大豆为基础的蛋白。

关键词:玉米加工副产品;高蛋白质酒糟;产奶量

(原载:JDairySci,2009,92:2911～2914.)

采集奶样。HPDDG的替换增加了奶牛产奶量(33.4和31.6±2.13kg/d),同时也增加了3.5%FCM(36.3和33.1±

2.24kg/d)。HPDDG替换对乳蛋白率(平均3.04%±0.08%)无影响,但乳蛋白产量增加(从0.95增加到1.00

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/zl34.html