农药生物测定一至三章

农药生物测定绪论 一、农药生物测定的含义

? 广义的生物测定为：来自物理、化学、生理或心理的刺激，对生物整体（living organism）和活体组织（tissue）产生效力大小的度量（如：机械刺激、电刺激、各种射线的照射等）。 ? 即：生物测定是研究作用物、靶标生物和反应强度三者关系的一项专门技术。

? 狭义的生物测定为：以生物的整体或离体的组织、细胞，对某些化合物的反应，作为评价这些化合物生物活性的量度，运用特定的实验设计，以生物统计为工具，测定供试对象在一定条件下效应，即为生物测定。

农药生物测定 ：运用特定的试验设计，利用生物整体或离体的组织、细胞对农药（或某些化合物）的反应并以生物统计为工具，分析供试对象在一定条件下的效应，来度量某种农药的生物活性。

二、农药生物测定的简史

第一时期： 19世纪末~1920至1923年间

? 事件：法国学者埃利希（R. C. Ehrlich）研究出测定白喉抗毒素含量的标准方法

– 特点：都是用单个动物体作直接的效力测定，将待测的药剂与标准药剂相比较来估计其相对药效。 – 缺点：由于生物个体从受药到中毒死亡需要一个过程，因而以生物中毒死亡为反应标准测出的致死剂量总比实际反应所需剂量大。

第二时期：20世纪30年代至20世纪70年代

? 事件：

– 1937年欧文（J.O.Irvin）首先提出了系统的生物测定方法报告； – 1947年芬尼（D.J.Finney）出版了系统的生物测定统计方法；

– 1950年芬尼及古德温（L.G.Goodwin）出版《生物测定标准化》一书； – 1957年布斯维纳（J.R.Busvine）出版《杀虫剂生物测定评述》；

– 1959年张宗炳在其《昆虫毒理学》一书中，以专章对杀虫剂生物测定 及统计分析作了系统的论述；

– 1963年张泽薄等出版《杀虫剂及杀菌剂的生物测定》；

? 特点：研究出以生物群体为反应基础的生物测定方法，提高了测定的准确度。

第三时期：20世纪70年代至今

? 特点：因具有各种特殊生理活性的化合物不断出现，生测方法也在发展。 ? 事例：

– 1.研究利用昆虫神经电生理法检测化合物对昆虫的拒食活性取得进展。

– 2.杀菌剂也由以传统的病原菌离体试验方法为主，转变为寄主植物上的活体试验为主。 – 3.20世纪80年代以来介于活体与离体之间的植物组织培养生物测定方法受到了广泛的重视，如适用于细菌性病害筛选的块根法；适用于大麦白粉病筛选的芽鞘表皮法等。

三、生物测定的内容

? 可以概括为活性筛选的常规测定、田间药效试验、残留分析。也可以归纳为：

– 1.比较农药对昆虫、病菌或植物的药效或药害；

– 2.比较农药不同方法、加工质量、物理性状对供试生物的药效； – 3.测定两种或两种以上农药混用的效力大小；

– 4.新研制化合物或农药对供试生物的药效、药害的筛选和评价； – 5.研究供试生物内在因素和环境因素对药剂效力的关系； – 6.鉴定生物体对农药的抗药性；

– 7.测定农药在生物体内外、土壤或环境中的残留量。

生物测定的发展趋势

? 植物细胞培养与生物测定相结合

? 从靶标的角度制定生物测定方法

? 生物测定向自动化、微型化方向发展

四、农药生物测定的作用和地位

? 生物测定是开发新农药的重要手段

一个新化合物从实验室合成到正式投入生产必须经过室内毒力测定、温室毒力测定和田间小区药效试验。因此生物测定是研制新农药、开展毒理学研究等方面的重要的先决条件。 ? 生物测定还是农药使用的重要先决条件

对表现活性高的化合物，除进行大田药效试验外还要做残留、对高等动物的毒性以及对有益生物和农业生态系统影响的生物测定研究，同时生产部门要对其剂型和加工技术进行研究。可见生物测定也是合理科学使用农药、提高防效等方面的先决条件。

另外发现新的试验方法等于发现新农药，新农药发现存在于生物测定过程的每个异常现象之中。基于以上所述，有人曾把生物测定与化学合成比喻为前进中的两个车轮，两者互相制约、互相促进。

五、生物测定的设计基本原则

? 1相对控制的实验条件

– 外界环境条件的变化，如温度、湿度、光照等对杀虫剂的理化性状和昆虫的生理状态都有直接或间接的影响。而杀虫剂理化性能的变化，能影响其对昆虫的毒效。

– 昆虫的生理状态，如发育阶段、龄期、性别等的不同对杀虫剂有不同的耐药力。 – 因此在毒力测定中应用标准目标昆虫和相对控制环境条件，尽可能将条件差异、人为因素及各种环境因素影响造成误差消除或减少，提高试验的精确度。 ? 2必须设对照

– 在试验期间往往有自然死亡情况，因此药剂处理组的死亡虫数也包括自然死亡数，显然这不完全是药剂的作用效果，故应设立对照加以校正，以消除自然因素所造成的死亡对药剂效果的干扰。

– 对照有三种：

? 一种是不作任何处理的空白对照；

? 二是标准药剂作对照，标准药剂是选择同类化合物防治某种病虫害最有效的药剂； ? 三是与药剂处理所用的溶剂或乳化剂等助剂完全一样，只是不含药剂的对照。

? 3各种处理必须设重复

– 在生物种群与个体之间对药剂的耐药力不同，反应有显著的差异，取样代表很重要，如果取样少了，既有可能由于取样不够全面或不是随机取样而造成结果的片面性。

– 因此每个处理要求一定的数量，重复次数越多，试验结果就越可靠。增加重复是减少误差的一种方法，但也不能或没必要太多，应根据试验目的与要求以及不同的生物材料而定。重复次数一般为3~5次。从生物统计理论上讲，增加重复次数减少每个重复的生物个体是减少试验误差的一种方法。

? 4运用生物统计分析试验结果

– 生物统计是生物测定的基本条件，是判断和评价试验结果的重要工具。是在生物学指导下用概率论为基础，描述偶然现象隐藏着必然规律的科学分析方法，它可以从错综复杂的实验数据中揭露农药与生物之间的内在联系。

– 各种处理之间的差异的显著程度，是不能凭主观去认定，必须通过客观评定，用数理方法，精密而合理地计算出来。

六、试验结果的统计与分析

一、毒力表示方法

1、试虫“死亡”的标准

? 试虫经处理一定时间后，其反应有三种情况：

– 存活：处理试虫和对照试虫同样正常，

中毒：和对照组试虫相比，处理试虫明显失常，如大量失水，不能正常爬行，翻倒，但对外界刺激仍有反应；

– 死亡：试虫完全停止活动，对外界刺激没有任何反应。 2、校正死亡率

? 一般认为，如果对照组的死亡率小于5％，则死亡率和校正死亡率相差不大，可以不予校正；如果对照组死亡率大于5％，则应校正，如果对照组死亡率20％以上，则在找出原因后，要重新进行毒力测定。

? 有些要求严格的毒力测定，甚至在对照组死亡率达10％以上时就应重做。校正死亡率的计算多采用阿勃氏（Abbott，1925年）提出的公式：

校正死亡率（％）=（X－Y）/ X×100

X——对照组生存率；Y——处理组生存率；X－Y=真正由于药剂处理的死亡率。 3.致死中量与致死中浓度

? 用来杀死群体中50%的个体所需要的剂量，用LD50表示，若用浓度表示就叫致死中浓度用LC50

表示。

4.有效中量与有效中浓度

? 指抑制50%病菌孢子萌发或菌丝生长所需要的剂量,用ED50来表示，若用浓度表示就叫有效中浓

度,用EC50来表示。 5.相对毒力指数

? 指几种农药在不同时间、条件下分批进行试验、每次都用一标准药剂来做对比，以该比值进

行毒力比较，这个比值就称相对毒力指数，用TI表示。

二、药效的表示单位

?TaC?杀虫剂防效??1??b??100 Ta=处理区防治后存活的个体数量 Tb=处理区防治前存活

?TbCa?–

的个体数量 Ca=对照区防治后存活的个体数量 Cb=对照区防治前存活的个体数量

杀菌剂 发病率=病苗（株、叶、杆）数 /检查总苗数（株、叶、杆）数×100 病情指数=∑（病级叶数×该病级）/检查总叶数×最高级值×100 病级值的划分标准，可根据病害种类及症状、危害特点而灵活决定

相对防治效果=对照区病情指数（%）-处理区病情指数（%）/对照区病情指数（%）× 100%

对照区草量-施药区草量?100% 除草剂防效?对照区草量三、结统计结果进行分析

1、剂量?a死亡率之间的关系 2、LD50与回归式y=a+bx的求法 ? A、作图法

– 以剂量对数值为横坐标(lgC)，校正死亡率机率值(P)为纵坐标，在坐标中相应的位置上标出各点，用目测法作一条平分各点的直线(应使线两例各点的垂直距离相加后相等)。此线即为毒力直线。

– 从机率值5处引出一条平行于横轴的直线，在与毒力直线的交点处，引出一条平行于纵轴的直线，与横轴的相交处为LD50的对数值(图1-1)，再查反对数即可得LD50。 用该直线可求出毒力回归式y = a+bx，取线上任意两点的座标（A:yl，xl，B：y2，x2），求b和a，将a和b代入y = a+bx,得回归方程。

? B、机率值分析法

– 该法必需将剂量转换成对数(x ＝ lgC ，为自变量）；死亡率经校正得校正死亡率，转换

为机率值（P = Y ，为依变量），经过统计分析进行计算。 （1）利用以下公式求出毒力回归线：y = a+bx

n为供试总虫数，r为实际观察的死亡虫数，p为理论死亡率。

按照y = a+bx，代入各x值求得各理论机率值y，由理论机率值y查机率表得理论死亡率。 ? （2）进行卡方检验：以上所得到的y = a+bx是否符合实际，须经卡方（χ2）进行适合性测定。只有χ2?达显著或极显著差异时，说明y=a+bx符合实际，用它来求LD50值是可行的。

? （3）求LD50值 求出回归方程并经卡方检测验后，即可将机率值5代入回归方程式，得LD50的对数值，再查反对数即可得LD50。

? （4）致死中量的标准差 由于试验设备，供试材料操作技术和环境条件的影响，有效中量必定有它的偏差，可用标准差（Sm）来表示。由机率值y查权重系数w表得出相应的权重系数。致死中量实际应为LD50±Sm。标准差的计算公式为：

? (5)致死中量的置信限 致死中量(有效中量)的置信限是表明致死中量可靠范围的限度，在统计上要求，100次测验中如果有95次能成功，就认为达到最低可靠标准。也就是95%的可靠性，当然也可以要求99％的可靠性。计算公式为：

11(m?x)2?) x?? Sm?2(b?nw?nw(x?x)2?nwx

nw?nw(x?x)??nwx22?(?nwx)2?nw

? 式中CL－置信限，m－致死中量，t－机率值查t分布表 ，Sm－致死中量的标准差。

第一章 杀菌剂生物测定技术

? 狭义的杀菌剂是指对真菌、细菌、病毒等病原菌有杀死或抑制作用的药剂。

? 广义的杀菌剂还包括对病原菌具有抑制作用的生防菌以及能诱导植物抗病性的化合物。 ? 杀菌剂的作用方式

– 抑菌、杀菌、改变致病过程、提高抗病性 ? 杀菌剂的使用方式

– 化学保护、化学治疗、化学免疫

一、杀菌剂生物测定技术概念

杀菌剂生物测定技术：是指将杀菌物质作用于病原菌或感病植物体，根据生物活性大小或植物病害发展情况来判断药剂效果的实验方法。

杀菌剂对植物的药害和对非靶标生物的毒性实验也属于生物测定技术的范围。

二、杀菌剂生物测定技术方法

? 目前杀菌剂应用最普遍的是离体( In vitro) 和活体( In vivo) 两大生物测定技术。

（一）、离体测定法

? 利用药剂和病原菌直接接触，来测定药剂杀菌毒力的方法。即病原菌脱离寄主(感病植物等) 在人工培养基或无培养基的条件下，直接和药剂接触，观察药剂生物活性大小和类型。

? 离体条件下反映的仅是供试药剂和病原菌的关系。所以观察的指标(菌丝生长速率、抑菌圈大小和孢子萌发率等) 是供试药剂对病原菌直接毒力的表现。 杀菌剂的离体生物测定主要实验方法

? 孢子萌发法；生长速率法；抑制菌圈法（又称为水平扩散法） ；抑制菌丝产生孢子囊及释放游动孢子试验 ；杀菌剂的对峙培养法 ；生物杀菌剂的拮抗作用测定；杀菌剂混用后的联合毒力测定

孢子萌发法

孢子萌发法是杀菌剂毒力测定中历史最悠久、应用最广泛的方法。早在1807年就开始应用。

? 孢子萌发法是：将不同药剂或相同药剂的不同浓度通过一定方法附着在玻片或其它平面上，当

药液水分挥发后形成一层药膜，在药膜上滴加供试菌种的孢子悬浮液，或将药剂与孢子悬浮液混合后，滴于载玻片上，保温保湿培养一定时间后，使用显微镜检查孢子的萌发情况。 – 玻片琼脂表面萌发法 （洋菜薄层法） – 悬滴法

生长速率法

? 将不同浓度的药剂与融化的培养基混合，制成带毒的培养基平面，在平面上接种病原菌，通过

菌落的生长速度来比较药剂对供试病菌毒力的大小。

抑制菌圈法

? 抑制菌圈法最先用于研究抗菌素对细菌的作用，对研究杀细菌剂具有特殊的意义。目前也用于其它杀菌剂的研究。

? 在已接种的培养基上，施加少量的抗菌性物质，使其接触培养基和病原菌，经过一定时间的培养后，接触部分的周围由于抗菌物质的扩散而产生抑菌圈（或抑菌带），其大小与药剂浓度在一定范围内呈一定函数关系。以此来比较杀菌剂毒力大小或进行生物测定。

抑制菌圈法主要实验方法 管碟法 滤纸片法 孔碟法 滴下法 洋菜柱法

抑制菌丝产生孢子囊及释放游动孢子试验

? 本试验方法仅限于测定能产生孢子囊和孢子囊能释放游动孢子的真菌，如疫霉菌，其原理是

在一定药剂浓度的培养液中培养病菌，一定时间后检查产生孢子囊和释放游动孢子情况，来比较毒力大小。

杀菌剂的对峙培养法

? 在天然物农药研究过程中，常规的筛选方法难以对微量的分离物进行抗菌活性跟踪。为了建立简便、快速的筛选方法，提出了查寻天然物抗菌活性物质的“对峙培养法”。

活体生物杀菌剂的拮抗作用测定

? 作用机理包括有：拮抗作用、竞争作用、重寄生、诱导植物系统抗性等。

?两种杀菌剂混用后对生物的联合作用有三种：

相加作用，即农药混用后对有害生物的毒力等于混用农药各单剂单独使用时毒力之和； 增效作用，即农药混用时对有害生物的毒力大于各单剂单用时毒力的总和； 拮抗作用，即农药混用时对有害生物的毒力低于各单剂单用时毒力的总和。

? 1、交叉滤纸条法

（平滑相接，表示相加作用；相接处凹出，表示增效作用；相接处凸入，表示拮抗作用） ? 2、共毒系数法

（二）、杀菌剂活体生物测定

? 在室内控制条件下，杀菌剂、病原菌和活体寄主共存体系中观察药剂生物活性大小和类型的方法。

? 它反映的是特定环境下病原菌、寄主和药剂三者关系，病原菌活性受药剂和寄主生物双重影响，所观察的指标(病斑大小、发病率等) 是病原菌、寄主和药剂的综合表现。

? 活体测定法按测试材料主要有离体组织、器官接种试验、种子杀菌剂药效试验、果实防腐剂生物测定等；按作用方式又可分为先接种后药剂处理的治疗作用测定和先药剂处理后接种的保护作用测定。温室的盆栽测定、大田的药效测定以及室内的一些方法都是该类测定方法。

? 活体生物测定优点：该法的测定结果与实际应用较为接近。

? 活体生物测定缺点：活体生物测定相对耗力、耗物、周期长，程序复杂。

杀菌剂的活体生物测定主要实验方法：

? 抗病毒剂的测定方法；蚕豆叶片法筛选水稻纹枯病杀菌剂 ；子叶筛选法（黄瓜子叶法）；萝

卜块根筛选法（滤纸片接种法）；防治香蕉炭疽病菌的组织筛选法

抗病毒剂的测定方法

测定方法：浸渍法 常用的接种方法：摩擦接种 病毒的定量培育 评判标准：病斑增值面积或病毒的增值率

三、杀菌剂生物测定方法发展趋势

1．离体试验向细胞水平发展

从宏观或微观的角度观察药剂对整个作用对象形态的影响。 2．活体试验向植株组织水平发展

从生理学的角度选用特异的分离的器官或细胞等观察药剂的作用。

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