酵母核糖核酸的提取及测定

酵母RNA的提取及测定

姓名：张弛 学号：201100140157 班级：生院2011级生物基地 时间：2013年3月18日

实验目的

1、掌握稀碱法提取酵母RNA

2、了解测量核酸浓度不同方法的原理

3、掌握紫外吸收法测核酸浓度的原理和技术

实验原理

酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。

核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260nm处有最大吸收，且在一定浓度范围内吸收值与浓度成正比（5-45μg/mL），符合朗伯-比尔定律。优点：样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。

试剂与仪器

材料：干酵母粉、0.2%氢氧化钠溶液、pH试纸（pH1-14）、标准核酸：200μg/mL 仪器：紫外分光光度计、精密电子天平、烧杯、量筒、离心机、移液枪、试管

实验步骤

1.提取： 称取4g酵母，研钵中研磨成粉末，倒入200mL三角瓶中，然后加入40ml 0.2%NaOH溶液，混匀，沸水浴30分钟。 2.分离： 4000转/分，15min，保留上清液。

3.沉淀RNA： 在上清液中加入40mL酸性乙醇，边加边搅拌，静置5min左右，再4000转/分离心，5min，保留沉淀。

4.洗涤纯化： 用20mL95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后3000转/分离心5min；再用20mL无水乙醇洗涤两次，每次洗后3000转/分离心5min；收集沉淀 5.含量测定（紫外分光光度法）：准确称取0.2-0.25g样品核酸，加2mL0.2%氢氧化钠溶液和1mL水浸泡，再加入50mL左右的水调成糊状，转移至100mL烧杯中，用0.2%氢氧化钠溶液调pH至7，定容至100mL。

测定步骤：

取11支试管，编号，按下表加入试剂： 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 / 3

标准0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0 0 0 RNA/mL 水/mL 7.8 7.6 0 7.4 0 7.2 0 7.0 0 6.8 0 6.6 0 6.4 0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 待测液 0 摇匀，测定吸光值

实验结果 编号 1 吸光0.00值 1 2 4 3 3 4 5 5 9 6 9 7 4 8 5 9 8 10 8 11 0.274 0.140.240.300.410.510.600.710.270.26

样品RNA平均吸光值=0.273

由图可知样品RNA浓度（所测）=18.7μg/mL 稀释前RNA浓度=18.7×2×50=1870μg/mL 100mL溶液中RNA=0.187g RNA含量=0.187/0.2411=77.6%

注意事项

1、沸水浴时，电炉下必须垫上大理石板，以防止桌面被烫坏。

2、第二次洗涤时，按理应当用无水乙醚来洗，但是乙醚极易挥发，过多吸入会产生危险，所以从安全考虑改用无水乙醇。

3、离心时液体必须对称放置，相对的两个离心管所盛物体必须质量相等，用天平校准。

4、测RNA含量时，溶解样品先加入一部分NaOH调成糊状，再加溶液定容。 5、测吸光度时，以5μg/mL的试管为参照。 6、计算时注意稀释度。

2 / 3

思考讨论

1、RNA的吸光值与溶液的pH有关系，标准曲线是在一定pH下测出的，所以RNA溶解后要将pH调至7.0。

2、实验中会有多次转移、离心、沉淀、洗涤，期间不可避免地有样品损失，肯定会造成RNA提取量降低。

3、核酸在260nm处有紫外吸光最大值，在RNA浓度为5-45μg/mL时，吸光值于浓度成正比，所以在溶解RNA后需要计算并稀释样品，使之浓度落在成正比的范围内，否则会使测量结果不准确。

4、在测定RNA样液时，要避免假重复，不是取第二次定容后的样品连续测量三次，而是取第一次定容后的样液取三次，分别再定容，分别测定，这样可以消除定容、移液时的误差，如果分别测定的结果相差较大，可以再取第一次定容后的溶液继续定容。

5、在测量吸光度时要选择好对比，用于校正。可以选用蒸馏水或是5μg/mL的标准RNA溶液来做对照。但考虑到吸光值与浓度成正比的范围是5-45μg/mL，而蒸馏水RNA的浓度不在这个范围内，所以最好选择5μg/mL的标准RNA溶液来最对照。

3 / 3

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/zg78.html