毛细管电泳技术及其在药物分析中的应用

毛细管电泳技术及其在药物分析中的应用

年级：11级 专业：药学 学号：11071 姓名：廖

毛细管电泳技术及其在药物分析中的应用

[论文摘要]毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）是近年来发展迅速的一种新型分析技术,具有高效、快速、分离模式多、应用范围广等特点。本文就CE的发展和工作原理做了有关介绍并对其在药物分析中的应用及相关发展做了综述。 [关键词]毛细管电泳 药物分析 应用

1引言

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管

分离法(CESM)是以高压直流电场为驱动力，内径为25一100娜的弹性石英熔融毛细管柱内荷电粒子按其淌度(mobility)或迁移速度 (migrationvelocity)的差异而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。它将分离柱效提高到上百万塔板数。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机，尤其是多通道集成芯片毛细管电泳技术的出现，极大提高了DNA测序的速度，使人类基因组草图的绘制工作提前三年完成。CE具有分离效能高、分析速度快、样品用量少、分析对象广，多模式化和环保等特点，已成为一种重要的分离分析手段，在生物、医药、化工、环保、食品等领域具有广阔的应用前景。

本文介绍了毛细管电泳法的发展和工作原理及在药物分析中的应用。包括药物分析的三大部分：一是原药的定量，原药中杂质的测定、药剂的分析以及对它们的稳定性的评价等以药品质量管理为目的的测试方法。这些方法要求有良好的选择性，适当的分析灵敏度和可靠的准确度等。二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排泄等体内动态的研究，即临床药物分析。三是手性药物的分离分析。

2 毛细管电泳技术

2.1 毛细管电泳的发展历史及发展方向

2.1.1 毛细管电泳的发展历史

1937年，诺贝尔奖获得者、瑞典化学家AmeTiselius教授利用电泳现象发明了最早期的界面电泳，用于蛋白质分离的研究，从而开创了电泳技术的新纪元，1967年Hjerten最先提出在直径为3mm内径的毛细管中做自由溶液的区带电泳 (capillary zone electrophoresis，CZE)，但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术(CE)是由Jorgenson和Luckacs在1981年首先提出，他们使用了75μm内径的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。l983年后，Hjerten等先后提出了毛细管凝胶电泳(capillary gel eleetrop horesis，CGE)和毛细管等电聚焦法(capillary isoelcetr icfocu sing，CIEF)。 1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支： 胶束电动毛细管色谱 (micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC或MEKC)。[1]近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了毛细管电色谱 (capillary

- 1 -

electrochromatography，CEC)，扩大了电泳的应用范围。美国加州大学伯克利分校的Richard A.M.教授更于20世纪90年代开始发展芯片电泳方法，发展出了世界上独具特色的碟形高密度集成毛细管电泳芯片，大大提高DNA分子的测序速度，一度成为DNA分子测序领域的主流技术，为人类基因组测序工程提前完成做出过重要贡献。在上个世纪的最后几年里，世界范围内的广泛研究，促成了一个研究分支—芯片毛细管电泳，即第一代微流控芯片的出现。今天，科学家们可以在芯片上对生命物质如基因、蛋白质和细胞等进行分离和分析。例如，Richard A.M.等正在开发用于探测火星氨基酸和可能微生物的新集成方法。

CE是一种迅速发展的分离技术，其最大优点之一是应用范围广泛。它能用于分离多种化合物，如氨基酸、手性药物、维生素、杀虫剂、无机离子、有机酸、染料、表面活性剂、肤和蛋白质、糖类、低聚核苷酸和DNA限制性内切片段甚至整个细胞和病毒颗粒。

2.1.2 毛细管电泳的发展方向

目前，毛细管电泳的发展方向有两个大方面。第一是毛细管电泳的应用研究,主要集中在蛋白质分离、DNA测序、手性分离、糖分析等。第二是毛细管电泳方法本身的完善和发展,这里以建立新的分离模式和联用技术为重点。现在对应用研究方面作一简单介绍。

(1)蛋白质分离

蛋白质是生物体内的一类重要活性物质,对生命过程起着重要的调节作用,是生命现象和分子生物学研究的最基本和最重要的对象之一。毛细管电泳是分离蛋白质的有效手段。但在分析方面也面临两个主要问题。一是蛋白——蛋白相互作用。二是吸附。

在任何蛋白质的输运过程中都要考虑蛋白质之间的相互作用。毛细管电泳也是如此。这种相互作用包括结合和解离,同一蛋白质的集聚,不同蛋白质或蛋白质与其它大分子(如脂、寡核苷酸等)之间的结合或集聚,以及其它键合作用。无论是对毛细管电泳的实验设计或是对分析结果的解释,都必须考虑蛋白质的这种相互作用。

第二个问题是吸附。吸附过程至少与三个因素有关,一是硅胶毛细管表面(包括净电荷、离子强度、电荷密度等)；二是蛋白质的物理性质(如等电点、稳定性、电荷分布等)；三是样品与缓冲液体系的性质(如离子强度、缓冲液类型、盐的性质等)。其中最主要的是要考虑净电荷和被分析物质的性质对吸附的影响。吸附不仅降低柱效,而且

- 2 -

影响峰形，使分辨率下降甚至不出峰。为解决这一问题,人们采用极端pH值、添加剂、涂层柱以及径向电场调制等方法。 (2)DNA测序

核酸是4种核苷酸的聚集体,每个核苷酸由三个部分组成，一是五元糖，二是含有嘌呤或嘧啶的杂环，三是磷酸基团。核酸重要的特征是它们的带电性和疏水性。核酸有两种形式最为重要,一是脱氧核糖核酸DNA,另一个是核糖核酸RNA。生物的遗传信息都密码于DNA的核苷酸序列之中,而这种信息对于蛋白质合成,核酸的复制,基因的表达和控制都是不可缺少的。

DNA测序是非常重要的。所谓人体基因组工程就是以人体基因的DNA图表示和测序为重要目的的国际性项目。基因组是指细胞或生物体中的一套完整单个遗传物质,配子中的整套基团。DNA测序过程包括如下几步：(1) 将DNA切成一段段的小片段(可采用水解、酶解、化学裂解及复制法)。(2) 对小的片段作序列反应。(3)用毛细管电泳对反应产物进行分离检测。(4)将一段段的序列数据编辑成完整的序列。

(3)手性分离

手性化合物的分离分析在药物、临床以及生命科学中具有十分重要的意义。在已知的1327种合成药物中，有528种是手性药物,而天然药物中手性药物所占比例更是惊人。目前毛细管电泳在手性分离方面比较活跃。毛细管电泳手性分离一般有两种手段。一是构建手性分离环境;二是手性消除。手性消除一般采用柱前反应法,需要昂贵的手性反应试剂，而且手性衍生试剂又十分难以寻找。构建手性环境可以使用手性添加剂、使用手性填充毛细管或使用手性涂层毛细管。其中手性填充或手性涂层毛细管需要特别的制作技术，推广有一定难度。添加剂法只需向电泳缓冲液中加入合适的手性试剂，经过一定的分离条件优化即能实现手性分离，是一种简单实用的方法。常用的手性选择剂有金属络合物、冠醚、蛋白质、糖(特别是环糊精及其衍生物)等。当前手性毛细管电泳的发展趋势主要有两个方面。一是开发新的手性构建方法,特别是发现新的高效手性添加剂；二是开展理论研究。

(4)糖类

糖是生物体内普遍存在的一类化学物质,是动植物的能量来源。它在很多生命过程中起着重要作用,糖类的毛细管电泳分析主要存在两个问题。一是多数糖类解离程度十分微弱,且具有较强的亲水性,给分离造成困难。二是多数糖类不具有很强的紫外或荧光生色基团,使分离以后的检测有一定困难。糖类的不带电性可以采用一些化学措

- 3 -

施得以解决。如采用络合(可用硼酸根、某些金属离子)、解离(强碱作用)、衍生等方法使糖带电。糖的检测问题可以采用衍生方法,所用衍生试剂应该既能吸光(或发光)又能电离。

2.2 毛细管电泳的基本原理

CE指以高压电场力为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分毛细管之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其仪器装置简图如图1-1所示，其结构包括高压电源、毛细管、检测器各一及两个缓冲液贮瓶。CE所用的石英毛细管柱，在pH>3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。在高电压电场作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗。粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（EOF）两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。以上便是就是毛细管区带电泳(CZE)的分离原理的简要介绍。

图1-1毛细管电泳基本仪器结构示意图

HV.高压电源(0-30KV);C.毛细管;E.电极槽;Pt.铂电极;D.在柱检测器;

理论基础：

带电离子在电场中运动除了受到电场力的作用外，还会受到溶剂阻力的作用。一定时间后，两种力的作用就会达到平衡，此时离子作匀速运动，电泳进入稳态。根据物理学定律可以导出:

- 4 -

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/zg0f.html