合成多肽药物有关物质研究的几点考虑

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20071127

化药药物评价>>非临床安全性和有效性评价

合成多肽药物有关物质研究的几点考虑

审评五部

审评五部

有关物质研究是合成多肽药物药学研究的一项重要内容，由于合成多肽本身结构、合成工艺以及稳定性方面的特殊性，这类药物的有关物质研究较为复杂、存在一定的难度。国家食品药品监督管理局颁布的《合成多肽药物药学研究技术指导原则》已经就该类产品的有关物质研究提出了原则性的要求，本文主要是根据审评中遇到的一些共性问题就合成多肽药物有关物质研究需重点关注的几个问题做进一步的说明。

（一）合成多肽药物有关物质的特点和研究的难点。

合成多肽的有关物质主要为源于合成过程带来的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等。

工艺杂质 尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工

艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质（如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等）与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。而且，不同的多肽合成方法也在很大程度上决定了终产品中杂质的性质，例如液相合成和固相合成所引入的工艺杂质就会明显不同，固相合成中Boc合成法与Fmoc合成法所产生的杂质也会有所差异，甚至不同的保护/脱保护策略都会带来不同的工艺杂质。因此，在进行合成多肽的有关物质研究时，研究者必须结合自身的工艺特点对可能由此引入的杂质有充分认识，从而才能够建立有针对性的有关物质研究方法。同时，这也意味着，对于仿制产品而言不能盲目照搬国家标准、已上市产品的有关物质检查方法，必须充分考虑到产品本身的工艺特点。

降解产物及聚合物 多肽的化学稳定性和物理稳定性一般较差，因此降解产物、聚合物等是合成多肽有关物质研究的主要对象之一。影响合成多肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、β-消除、聚集等，研究显示合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺易于发生脱酰胺反应（尤其是在pH值升高和高温条件下）；甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸最易氧化，对光照也较为敏感；天冬氨酸参与形成的肽链较易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。由于一个多肽分子中通常

会含有多种不稳定性的氨基酸残基或肽键，因此合成多肽可能的降解机制和降解产物较为复杂。而多肽的聚集主要是由于疏水作用引发的，尽管目前还很难准确预测哪些多肽易发生聚集，但至少对于一些中长肽而言需对可能存在聚合物进行研究。

综上，由于结构、合成工艺和稳定性方面的特殊性，合成多肽中可能存在着大量性质各不相同的工艺杂质、降解产物、聚合物，这就给合成多肽药物的有关物质研究带来了很大的挑战。除了合成多肽中杂质不易定性、定量外，由于合成多肽中有些杂质的性质与终产品非常接近，有些杂质的性质又相差较大，建立适宜的方法充分检出这些杂质是合成多肽药物有关物质研究中的最大困难。 （二）合成多肽药物有关物质研究中几个需关注的问题 1、同时采用不同原理的方法进行合成多肽的有关物质研究 由于合成多肽中有关物质的复杂性，且某一特定研究方法总会存在一定的局限性，因此对于合成多肽药物、尤其是新合成多肽的有关物质研究而言，通常需同时结合使用不同原理的方法进行有关物质研究。一般认为，对合成多肽杂质认知的程度与研究中使用的独立技术的数量成正比。常见的合成多肽的有关物质研究方法包括基于各种不同原理的高效液相色谱法（如反相HPLC法、离子交换HPLC法、分子排阻HPLC法）、毛细管电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）以及激光散射等。其中，反相HPLC法基于疏水性的分离机制，离子交换HPLC法依据多肽分子所带电荷的差异，毛细

管电泳的分离基础是荷质比。分子排阻HPLC法的分辨能力虽然较反相HPLC法低，但相对于其他HPLC方法而言较适用于聚合物的检查。此外，激光散射法是目前测定多肽中聚合物的有效方法。 2、反相HPLC法应尽量采用梯度洗脱方法

目前，反相HPLC法是最常用的合成多肽有关物质研究方法。但是由于合成多肽中存在的有关物质的性质相差较大，采用简单的等度洗脱的方法往往很难充分检出产品中存在的各种有机杂质。以生长抑素为例，研究显示采用梯度洗脱方法无论是检出的杂质个数还是检出杂质的含量均明显高于等度洗脱方法，如图1、2。目前，国外上市的合成多肽产品（醋酸丙氨瑞林、醋酸奥曲肽、特利加压素、鲑降钙素、生长抑素等）的有关物质检查方法多采用梯度洗脱方法。因此，采用反相HPLC法进行合成多肽有关物质研究时应尽量采用梯度洗脱方法，当然梯度程序的选择应以尽可能多得检出杂质为前提。

图1：生长抑素等度洗脱色谱图

图2：生长抑素梯度洗脱色谱图

3、专属性的验证

专属性是衡量杂质研究方法的重要指标。目前，国内很多研究者在对合成多肽有关物质检查方法的专属性进行验证的时候通常仅进行强制降解试验。然而，由于杂质来源的不同，合成多肽通常存在的工艺杂质的检查专属性很难通过强制降解试验进行验证。因此除进行强制降解试验外，研究者还应采用精制纯化前含有典型工艺杂质的多肽粗品进行有关物质研究方法的专属性考察。采用多肽粗品进行研究除了能够更加全面地验证杂质研究方法的专属性外，还有助于考察多肽合成过程中精制纯化工艺的可行性。

近年来，随着越来越多的合成多肽药物进入临床使用，合成多肽药物已日益成为药品研发的热点领域。本文只是根据合成多肽药物自身的特点并结合审评过程中发现的一些共性问题就这类药物有关物质研究中需要重点关注的几个问题进行了探讨，需要强调的是合成多肽的有关物质研究并不只限于本文所述内容，更全面、更详细的内容请参见《合成多肽药物药学研究技术指导原则》。 参考文献

1、《合成多肽药物药学研究技术指导原则》 2、彭师奇. 多肽药物化学. 科学出版社. 3、S.L.Nail, Michael J.Akers. 蛋白质药物

开发与生产. 化学工

业出版社.

4、王军志主编. 生物技术药物研究开发和质量控制. 科学出版社. 5、高恒莹、周立春、高春、纪宏.注射用生长抑素中相关肽测定的研究.首都医药，2000，7（10）.

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