药物定量分析与分析方法验证

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第四章 药物定量分析与分析方法验证

第一节 定量分析方法特点

定量分析方法：重量分析法、容量分析法、光谱分析法、色谱分析法 一、重量分析法

用适当的方法将被测组分与试样中其他组分分离后，转化成一定的称量形势（使药物生成沉淀），称重，从而求得该组分含量的方法。

生成沉淀 → 过滤 → 洗涤 → 灼烧 → 恒重。 特点：结果准确，但操作繁琐。 二、容量分析法

为经典方法，原料药分析常采用。

指示剂和灵敏度是影响结果的原因之一，常产生滴定误差； 特点：

1、快速，准确，灵敏度高

2、适合于中、高含量组分分析（1%） 3、仪器简单，操作方便，适用范围广

三、光谱分析法——UV、IR、MS、NMR和荧光分析 1、紫外可见分光光度法

灵敏度和准确度高；

价格低、适用范围广，一般适用于纯组分的分析，如原料药或单组分制剂（无辅料干扰）， 计算分光光度法可测定多组分制剂的含量，现已基本不用。 2、红外分光光度法和核磁共振波谱法

IR——分析官能团的存在。

NMR——分析氢分布、碳骨架及分子间相互耦合情况等； 适用于定性，定量应用较少。 3、质谱法

在联用技术中用于定性和定量，灵敏度高(ng)，在生物样品分析中应用广泛。 4、荧光分析法

灵敏度高（pg），但适用范围有限，应用衍生化方法较多，在生物大分子分析中应用较多。 四、色谱分析法

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HPLC —— 适用范围广

GC —— 使用有限制，多用于具有挥发性药物的分析 TLC——很少用于定量，多用于定性。 1、系统适用性试验：

理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子

2、定量方法：面积归一化法，内标法、标准曲线法、外标法等。 3、色谱法特点：

（1）条件选择范围宽：包括色谱柱、流动相、检测器等。 （2）应用范围宽：以HPLC为最广泛。 （3）灵敏度高，准确度好，重现性好。 （4）操作繁琐，实验消耗大。

（5）多组分的分离分析，与光谱等联用，可进行定性和定量分析。

第二节 定量分析的计算

一、滴定度

1、定义：指每1ml某摩尔的滴定液所相当的被测药物的质量，CHP用mg来表示。 2、计算：

aA（滴定液）＋bB（待测物）→ cC＋dD ?T?ba?C?B(mg/mL)

二、百分含量计算 (一) 直接滴定法：

%?V?T?FW?100%

(二) 回滴定法（剩余滴定法）

先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应，待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A。 1、不做空白试验的含量计算方法

% = (VA?FA?TA/C - VB?FB?TB/C)W?100%

2、做空白试验的含量计算：

% = (V0- V)?T?FW?100%

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第三节 药品质量标准分析方法验证

一、验证分析项目 1、鉴别试验

2、杂质定量或限度检查； 3、有效成分含量测定；

4、制剂中其它成分(降解产物、防腐剂等)的测定； 5、 溶出度、释放度等功能检查中，溶出量的测定方法。 二、验证内容

1 专属性；2 检测限；3 定量限；4 精密度；5 线性及其范围；6 准确度；7 耐用性 (一) 专属性

1、定义：指在其他成分（杂质和制剂辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测出被测物

的能力。

2、意义：分析复杂样品时衡量其是否受到干扰程度的一种方法。 3、测定法：

如测定定坤丸中人参皂苷Re和Rb1的含量：

阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除人参以外的其余药味，按制备工艺制成，按“供试品溶液制备”项下方法制得缺人参的阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取20 ?L进样，观察样品峰的保留时间处是否有杂质峰。测得结果表明：样品峰保留时间处无杂质峰干扰（见附图4-1）。

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二、检测限 (limit of detection, LOD)

1、定义：试样中被测物能被测出的最低浓度或量。

2、意义：LOD 是一种限度检验的效能指标，它反映方法与仪器的灵敏度和噪音大小，也

表明样品经处理后空白值的高低。

3、测定法：

(1) 非仪器分析——目视法

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。 (2) 仪器分析

一般以信噪比（S/N= 3或2）时的相应浓度或注入仪器的量确定为检测限。 4、数据要求

附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。 三、定量限（1imit of quantitation，LOQ）

1、定义：样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。 2、测定法：

(1) 以信噪比（S/N）为10时相应的注入仪器的药物浓度或量进行确定。 (2) 以仪器所测空白背景响应标准差(SD)的10倍为估计值，再经试验确定。 四、精密度

1、定义：在规定的测试条件下，同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。 2、表示方法：

? 偏差（d）：d?xix

标准偏差(SD)：S???xi?x?2n?1Sx

相对标准偏差(RSD)：RSD?4、表达形式：

?100%

(1) 重复性：相同条件下，同一个分析人员测定所得结果的精密度。 测定法：

① 至少用9次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度三样本分析。 ② 被测物浓度当作100%，至少6样本分析。 例：方法重复性试验

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取同一批号定坤胶囊样品6份，按“供试品溶液制备”项下方法操作，平行制备6份样品，在上述色谱条件下进行分析，测定，按人参皂苷Rb1的含量计算：RSD = 1.8 %(n = 6)。 (2) 中间精密度：同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。

目的：考察随机变动因素的影响日期、分析人员、设备 (3) 重现性: 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。

当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。 五、线性及其范围 1、定义

线性：在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。

范围：达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 2、测定法：设计具有一定梯度的5~8个浓度点，用作图法或计算回归方程建立. Y = ax + b r ≥ 0.999 (相关系数）

3、要求：线性范围要涵盖待测物的所有浓度范围。

应列出回归方程、相关系数和线性图。

例如：标准曲线绘制

取人参皂苷Rb1对照品10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为103.0 ?g · mL-1的对照品储备液。依次精密量取对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成人参皂苷Rb1系列标准溶液。分别精密吸取20 ?L，按上述色谱条件下测定。以对照品浓度X（?g · mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得：

回归方程为：Y = 2.146?10 3X + 2.236?103（r = 0.9998，n = 6）

结果表明人参皂苷Rb1在10.3~103.0 ?g · mL-1浓度范围内，Y与X之间具有良好线性关系。 六、准确度

1、定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。 2、测定法：

用百分回收率（R）表示，测定回收率的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。 (1) 回收试验法：

空白溶剂（或基质）+ 已知量的对照品（或标准品）A，按“供试品溶液的制备”项下

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操作，制备供试液，测定。 (2) 加样回收试验

已准确测定药物含量的样品 + 已知量的对照品（或标准品）A，按“供试品溶液的制备”项下操作，测定。 (3) 计算和要求

R?发现量加入量?100%?测定量?原有量加入量?100%

规定的范围内，至少用9次测定结果评价，制备三个不同浓度样品，每一浓度测定三次。 ① 原料药、制剂

UV、 HPLC：R = 98 ? 102%，RSD≤2%

容量法：R = 99.7 ~ 100.3%，RSD≤2% ② 中药及其制剂

R = 90～110% ，RSD≤5% R = 95~105% ，RSD≤3% 4. 判断含量测定方法准确度的方法

(1) 回收率试验——“回收试验法”和“加样回收试验法” (2) 与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。 5、例如：

采用加样回收法，称取已知含量的同一批号定坤胶囊样品9份（20041025），每份0.2 g，精密称定。按低、中、高浓度分别精密加入人参皂苷Rb1对照品溶液，每一浓度3份，按“供试品溶液制备”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。测得方法平均回收率为99.7 %（RSD = 1.7%，n = 9），数据见Tab. 4-1。

Tab. 4-1 Recovery of ginsenoside Rb1 in Dingkun capsule

Original/mg0.7240.7250.7150.7170.7220.7180.7240.7250.726Added/mg0.3580.3580.3580.7150.7150.7151.0731.0731.073Detected/mg1.0811.0811.0641.4311.4581.4261.7981.8121.770Recovery /?.799.497.599.9102.999.0100.1101.397.399.71.7Mean Recovery/ %RSD/%

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七、 耐用性

1、定义：指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度。

2、意义：为常规检验提供依据，是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现

性的尺度。

八、小结

1、效能指标的选择

精密度鉴别试验：杂质限度检查：杂质含量测定：原料药主要成分含量测定：制剂中主要成分含量测定：?准确度检测限定量限专属性???????线性范围耐用性??????????????????溶出度和药物释放度：?生物样品含量测定：???????????

2、目的

证明所用的分析方法适合于相应的检测要求。

药品质量标准起草时，药物生产工艺方法变更、制剂组成改变、对原分析方法进行修订时，需进行方法学验证试验，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。

第三节 生物样品分析方法的基本要求

一、概论

(一) 体内药物分析的性质与意义

药物进入体内后，经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程（1）化学结构和存在状态都可能发生变化；（2）在不同个体中存在差异（个体差异），进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效应和毒副作用。因此，需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析。

体内药物分析是药物分析的重要分支，是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学，又被称为“生物医药分析”。 (二) 体内药物分析的对象和任务

1、研究对象：血液是体内药物分析的主要对象。除血液外，尚有尿液、唾液、毛发和脏器

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等较为常用的生物体液和组织。 2、体内药物分析的任务

① 分析方法学的研究和完善——提供灵敏、专属、准确可靠的分析方法与最佳的分析条件 ② 体内药物的测定和研究——提供药物在动物和人体内的药物动力学参数、生物利用度及

血浆蛋白结合率等基本数据，为新药研究、老药再评价、TDM、药物滥用、司法鉴定等提供准确的体内药物浓度数据和合理解释。

③ 内源性物质的测定和研究——为某些疾病的诊断及治疗提供重要信息 ④ 对药物的体内外代谢产物进行定性定量研究 ⑤ 对参与药物代谢的酶系进行研究

3、体内药物分析的特点——由分析对象的特点所决定：

(1) 干扰物质多：内源性物、代谢物和结合物等——样品多均需经过分离、净化后才能分析 (2) 样品量少、重复取样困难——在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求 (3) 被测成分浓度低——对分析方法的灵敏度及专属性要求较高 (4) 药物浓度监测和药物滥用——简便、快速 4、体内药物分析对分析方法的要求 (1) 检测方法的高灵敏度

——最低检测量10-9~10-7 g或10-15~10-12 g (2) 分离方法的高选择性、高专属性

最常用的分析方法有 ① 色谱法——GC、HPLC、HPCE ② 免疫分析法——RIA、EIA ③ 联用技术——GC-MS、LC-MS 5、学科热点问题

? 游离型血药浓度测定方法研究

? 血中游离型药物浓度(F)与总浓度(T)的比率(F/T) 及唾液与血液游离浓度的比率(S/P)以

及它们之间的相关性的研究 ? 代谢物的监测与研究 ? 对映体的监测与研究 ? 体内微量元素的测定与研究

? 方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究

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? 分析新方法、新技术的联用研究 ? 体内药物分析方法的质量控制研究 二、生物样品的种类、采集、制备和贮藏 (一) 种类：

生物样品器官、组织血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、体液精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等

1、血液（血浆、血清）——体现药物浓度和治疗作用之间的关系，最常用的生物样本。 2、尿液——用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型

及代谢物等的研究测定。

3、唾液——用于某些S/P较为恒定的药物的测定。 4、毛发——可用于药物滥用监测及微量元素测定

5、脏器组织——动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡 (二) 生物样品的采集和制备

1、血液（blood）——血浆、血清和全血 (1) 血样的采集：

注射器直接采集静脉血（人、兔子）

毛细管眼眶采血、静脉插管手术或断头取血（大鼠、小鼠） 滞留针股静脉取血（狗） (2) 血样的制备：

测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。 ① 血浆(plasma )的制备

静脉血置含抗凝剂试管中2500~3000r/min离心5~10min血浆

抗凝剂：肝素（最常用）、EDTA、椐橼酸盐、草酸钙、氟化钠。 ② 血清(serum )的制备

置无抗凝剂试管中37?C或室温放置拨去血饼2500~3000r/min静脉血???????????????????????????????????血清30~60min离心5~10min 血浆比血清的分离快，而且制取的量约为全血的50%~60%，血清只为全血的20%~40%，多数研究者用血浆进行分析测定。

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③ 全血（ whole blood）的制备

置无抗凝剂试管中静脉血???????????????全血保持血浆和血细胞的匀相状态

血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测。 2、唾液（saliva）

一些药物的唾液药浓(S）与血浆游离药浓（P）密切相关。因此，TDM中利用对S的测定代替对P的监测——药代动力学的研究 (1) 唾样的采集：

在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液； 也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。 (2) 唾样的制备：

唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存。 3、尿液（urine）

体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代谢物等多种形式排出。 (1) 尿样的采集：

测定方式——测定一定时间内排入尿中的药物总量

样本采集——时间尿（在规定时间区间内采集），并测量每次收集的尿液体积。 (三) 生物样品的贮藏

最常用的方法——冷藏或冷冻——冷藏或冷冻的时限：经稳定性考察后确定 冷藏：冰箱(4℃)中——短期保存(1~2d)

冷冻：冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)中——长期保存 1、血样的贮藏

采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再贮存。

2、唾液样品的贮藏

测定唾液pH时应在取样的当时测定。 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4℃以下保存 3、尿样的贮藏

采集后应立即测定（≤24h），若不能立即测定，加入防腐剂后保存，保存时间为24~36h(4℃)

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或长期(-20℃)。

三、生物样品分析的前处理技术 (一) 生物样品分析前处理的目的

在测定体内药物及其代谢物时，首先需对复杂的生物样品实施分离、净化、浓集、化学衍生化等样品预处理过程——为药物的最终测定创造良好条件，具体表现在四个方面： 1、使药物从缀合物及结合物中释放——测定药物的总浓度 2、使样品纯化——消除生物基质中内源性物质的干扰 3、提高检测灵敏度——适应和符合测定方法要求的灵敏度

4、防止分析仪器的污染和劣化——提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果 (二) 生物样品分析前处理时应考虑的问题 1、生物样品种类

血浆、血清——常需去除蛋白质(去蛋白——提取) 唾液——主要采用离心沉淀除去粘蛋白

尿液(缀合物)——常需采用酸或酶法使缀合物水解 2、药物的结构、理化性质、存在形式、浓度范围 酸碱性(pKa)、未电离分子的亲脂性——提取性质 挥发性——挥发损失及气相色谱法分析法的应用 光谱特性——分析仪器的选择

官能团性质——化学衍生化和特殊检测器的应用 化学稳定性——处理条件的选择

体内存在形式及血浆蛋白结合率——预处理方法 药物的浓度范围 浓度大——预处理要求稍低

浓度低——样品制备的要求高

3、测定方法 4、样品的化学组成 5、药物的蛋白结合率

6、被测组分在预处理过程中的稳定性

7、样品在收集、储存和预处理过程中容器的污染

8、保证必要的专属性、灵敏度、精密度和准确度的前提下预处理过程尽量简单

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(三) 生物样品分析前处理的技术 1、去除蛋白质

(1) 目的：结合型药物释放；减少乳化的产生；保护仪器去除蛋白质的方法； (2) 方法：

① 加入与水混溶的有机溶剂——蛋白质脱水沉淀

常用的有机溶剂——乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等 血样与溶剂的体积比——1∶(1-3)——除去90%以上蛋白质

离心分离——高速(>10000r/min)离心1~2min →上清液（pH8.5~9.5） ② 加入中性盐——“盐析”沉淀蛋白质

常用中性盐——饱和(NH4)2 SO4、Na2SO4、Mg2+、PO43-及枸橼酸盐等

试剂用量——血样与饱和(NH4)2SO4的比例为1∶2时除去90%以上的蛋白质 离心分离——高速(>10000r/min)离心1~2min → 上清液（pH7.0~7.7） ③ 加入强酸——与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀 常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等

试剂用量——血清与强酸的比例为1∶0.6时除去90%以上的蛋白质 离心分离——高速(>10000r/min)离心1~2min → 上清液（pH 0~4） ④ 加入重金属盐——与蛋白质阴离子(羧基)形成盐沉淀

当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀。

常用的沉淀剂—— CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等

试剂用量——血清与沉淀剂的比例1∶(1~3)，除去90%以上的蛋白质

离心分离——高速(>10000r/min)离心1~2min → 上清液（pH分别为5.7~7.3和6.5~7.5） ⑤ 酶水解法——蛋白分解酶分解蛋白质

加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用。 最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.0~11.0)内使蛋白的肽键降解，在50~60℃具有最大活力 ⑥ 超滤法

半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋白质)；

以多孔性半透膜(超滤膜)作为分离介质的一种膜分离技术；

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特点——无相变化；无破坏性

操作——血液中游离药物的测定：分子量截留值在5万左右的超滤膜加压（2kg/cm2） 过滤法或高速离心法

应用——游离药物首选方法，尤其适合TDM ⑦ 加热法—蛋白质变性凝固

测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀。

加热温度——视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90℃；

蛋白去除——蛋白沉淀后可用离心或过滤除去

特点——优点：方法最简单；缺点：只能除去热变性蛋白 2、缀合物的水解

(1) 酸水解——优点：简便、快速

缺点：专一性较差、药物分解 (2) 酶水解——优点：专一性较强、药物无分解； 缺点： 时间长、费用大

① 酶水解常用酶： 葡糖苷酸酶（Glucuronidase）；硫酸酯酶（Sulfatase）；混合酶 ② 水解条件：溶液pH值4.5~5.5；温度37℃培育数小时

应用——对酸及热不稳定的药物。

(3) 溶剂解

缀合物（主要是硫酸酯）往往在萃取过程中可被加入的溶剂分解，称作溶剂解

目前对缀合物的分析，逐渐趋向直接测定缀合物的含量，体内以缀合物形式存在的药物

的量，排出体外时，缀合物占所有排出药物总量的比率

应用示例——血、尿中三唑仑代谢物的GC测定法

3、分离、纯化与浓集 (1)目的：

① 消除内源性物质、代谢物及其他共存物质的干扰； ② 提取浓缩待测物质，使其易于检测 (2)方法：

① 液—液萃取法(传统的方法)

ⅰ：液-液萃取时应考虑选用的有机溶剂的特性、体积及水相的pH值等因素

溶剂的选择——试验成功的主要条件

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——相似相溶的原则

——对药物的未电离分子可溶、电离形式分子不溶 ——沸点低、易挥散，毒性小 ——与水不相混溶

——具有较高的化学稳定性和惰性 ⅱ：萃取方法

萃取次数——通常为1次(萃取R在70%以上)

——必要时2~3次(萃取R在50%以下)

每次用量——和水相的体积比通常为1:1或2~5:1 萃取方式——分液漏斗或涡流混合 ⅲ：水相pH值

水相pH值——由药物的pKa确定——90%以上的非电离形式 碱性药物最佳pH值：高于pKa值1~2个 pH单位 酸性药物最佳pH值：低于pKa值1~2个pH单位

一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值介质中提取；

生物样品宜在碱性或近中性条件下提取——生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取。

ⅳ：其他方法

A：离子对提取法（ion-pair extraction）——种有机溶剂提取离子性药物的方法

原理——Q- + X+ → QX； Q+ + X- → QX 反离子的选择

碱性药物——用烷基磺酸盐(RSO3ˉ) 作为反离子。

如：戊~辛烷磺酸钠、月桂磺酸钠等。

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体液中能离解成阳离子的药物主要是有机胺类，尤其是季铵类药物

酸性药物——用烷基季铵类化合物（R4N+·Xˉ）作为反离子。 如：氢氧化四乙基铵、四丁基铵、四辛基铵等

体液中呈阴离子状态的药物主要有磺酸类、羧酸类等。

常用的提取溶剂——氯仿、二氯甲烷等

B：提取烷基化法——适用于离子化倾向较大，难以用溶剂直接提取的极性药物。 ② 固相萃取法（Solid-phase extraction, SPE）

ⅰ：SPE原理——将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，

由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。 ⅱ：洗脱方式——

A：药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱 B：杂质与固定相亲和力比药物强，药物被直接洗脱

通常为a模式，目前应用最广泛的微型柱——Bond Elut（美国Analytichem International公司）和Sep-pak微型柱（美国Waters公司） C：固相的选择

a：原则——固相与被测组分应具有相似的极性 b：SPE的填料种类

——亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶）

应用最广，亲脂性键合相硅胶容易吸附水中的非极性药物。

亲脂性键合相硅胶——烷基、苯基、氰基键合相硅胶，其中十八烷基键合相硅胶（简称C18）最常用；

——亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维） ——离子交换型 D：试验步骤——五步

a：用甲醇活化填料——固相表面可被水性溶液润湿 b：用水或适当的缓冲液冲洗小柱——除去残留的甲醇 c：加样——使样品经过小柱，弃去废液

d：用水或适当的缓冲液冲洗小柱——除去残留的干扰物 e：选择适当的洗脱溶剂冲洗小柱——洗脱被分析物，收集

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洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析 E：方法特点

优点：1）引入杂质少；2）完全避免乳化的形成；3）较高萃取率、重现性较好

4）使用溶剂多数与水混溶，易于自动化 缺点：1）价格昂贵；2）技术要求高；3）批间有差异 F：SPE与LLE及沉淀蛋白法的比较

SPE：萃取剂与样品接触面大，可在短时间内达到有效萃取；

可以采用动态柱操作——自动化；

LLE：两相间的分配平衡时间较长，需通过振摇等加快传质的进行；

萃取回收率及选择性随药物及萃取条件而变化。 沉淀蛋白法：快速简便、回收率高；待测物含量低时不适用。 SPE与LLE及沉淀蛋白法一样，得到的是药物的总量 ③ 自动化SPE技术 优点：节约时间

平行操作系统确保了较高的工作效率 减少了操作误差，提高准确度和精密度

安全性好，可避免人对有毒样品的接触

缺点：残留物对测定的影响

连续测定时，要考虑样品物化性质的稳定性对测定的影响 ④ 固相微萃取法（Solid-Phase Microextraction）

ⅰ：SPME装置简单，类似于气相色谱微量注射器，其基本装置如图。

ⅱ：SPME操作方法

SPME方法分为萃取过程和解吸过程两步

A：萃取过程—具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中进行萃取。

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1．压杆 2．简体 3．压杆卡持螺钉 4．Z形槽 5．简体视窗 6．调节针头长度的定位器7．拉伸弹簧 8．密封隔膜 9．注射针管 10．熔融石英纤维 11．熔融石英纤维

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B：解吸过程—将已完成萃取过程的萃取器针头插入气相色谱进样装置的气化室内，使萃取纤维暴露在高温载气中，并使萃取物不断地被解吸下来，进入后序的气相色谱分析。

ⅲ：SPME的特点

A：集采样、萃取、浓集、进样于一体，避免引入多步操作误差。 B：无需萃取溶剂，样品量小、空白值小 C：萃取选择性高

D：纤维涂层（萃取头）可重复用上百次 E：适用于分析挥发性和非挥发性物质 F：与GC及HPLC、MS等联用，自动化分析

G：目前SPME使用的固相涂层种类限制了它的应用，但该法极具前途 ⑤ 微透析技术（Microdialysis, MD）——膜分离技术

ⅰ：原理：利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品

制备技术，用与细胞间液非常接近的生理溶液以慢速度(0.5~5?L/min)灌注由膜制成的微透析探针(植于需要取样的部位)，膜内外待测组分的浓度梯度使其由膜外(生物体内)进入膜内(探针内)，随灌注液(透析液)流出体外、进入仪器分析系统—如毛细管电泳、微柱HPLC

ⅱ：微透析系统组成如图3-9所示

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ⅲ：MD的特点

A：时间分辨性——可连续跟踪体内多种化合物量随时间的变化。 B：空间分辨性——取样真实代表取样位点目标化合物的浓度。

不同部位同时植入探针可研究目标化合物的体内分布

C：目标分辨性——提供不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物，对药物研究

具有重要意义 D：不需处理

ⅳ：MD的应用——研究生物体在活动时体液组成的一些变化 A：药物分布研究——勿需处死动物，可获得完整的浓度-时间资料。 B：药物代谢研究——获得药物代谢中间过程的信息

C：药代动力学研究——勿需采血，避免因血容量减少 对药物分布及消除的影响，药动

学资料更准确。

E：方法——微透析与色谱、HPCE、GC-MS、LC-MS联用等技术。 ⑥ 化学衍生化 ⅰ：光谱分析法

A：紫外分光光度法——衍生化试剂同HPLC法的应用 B：荧光分析法——衍生化试剂同HPLC法应用

ⅱ：色谱分析法——药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化——如R-COOH、R-OH、

R-NH2、R-NH-R’ A：GC法中的化学衍生化

a：目的：使极性药物变成非极性、易挥发药物；使具有被分离特性

增加药物的稳定性

提高对光学异构体的分离能力 b：主要衍生化反应：

烷基化（Alkylations） 酰化（Acylations）

硅烷化（Silylations）——应用最广泛 非对映体衍生化（to produce diastereomers B：HPLC法中的化学衍生化

a：目的：提高对样品的检则灵敏度；改善样品混合物的分离度；进一步结构鉴定

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b：化学衍生反应的要求：

反应条件不苛刻、能迅速定量进行；

生成单一衍生物，反应副产物、包括过量的衍生试剂不干扰被测样品的分离和检测； 衍生试剂方便易得、通用性好；

c：HPLC衍生化可分为柱前衍生法与柱后衍生法两种：

柱前衍生法——色谱分离之前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。

优点：衍生试剂、反应条件和时间的选择不受色谱系统的限制；

衍生产物易进一步纯化； 不需要附加的仪器设备

缺点：操作过程较繁琐；容易影响定量的准确性

柱后衍生法——色谱分离(出柱)后，色谱流出组分直接在系统中与衍生试剂及辅助反

应液进行反应，在线检测衍生化产物。

优点：操作简便，可连续反应以实现自动化分析； 缺点：反应对衍生试剂、反应条件和时间有限制；

需附加仪器设备(如输液泵、混合室和加热器等)；导致色谱峰展宽 d：柱前衍生和柱后衍生的主要差别：

柱前衍生——根据衍生物的性质不同而进行色谱分离的 柱后衍生——根据待测物的性质分离后再衍生

——为保持较高的反应产率和重现性结果，一般要求加过量的衍生试剂，对柱后衍

生的方式不利

——对大量样品做常规分析，柱后衍生更适合于连续的自动化操作 e：根据衍生化目的和试剂不同，衍生化反应分四种

HPLC——紫外衍生化反应 HPLC——荧光衍生化反应 HPLC——电化学衍生化反应 HPLC——手性衍生化反应

⑦ 有机破坏法

ⅰ：应用——微量元素测定 ⅱ：方法： A：湿法破坏

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常用试剂—硝酸或硝酸-高氯酸

特点—破坏能力强、反应激烈，无机金属离子为高价态 应用—适用于血、尿、组织等生物样品的破坏 缺点—含氮杂环药物的破坏不够完全 注意—切勿蒸干、以免爆炸

样品用量—金属元素量10~100?g，血样10~15ml、尿样50ml26 B：干法破坏

高温炉高温破坏

应用——适合人发样品的破坏 C：氧瓶燃烧法

特点——操作简单、快速、设备简单。 仪器装置——附图二

应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等 。

血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上→60℃烘干→按规定折叠后固定。 人发：洗净、干燥（60℃ ~ 80℃）→剪碎→称取0.1 ~ 0.3g置无灰滤纸中心→按

规定折叠固定。

四、生物样品定量分析方法的验证与要求 验证内容

1．特异性——避免干扰

2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围 3．准确度——与实际状况相符 4．精密度——结果可重现

5．定量限——达到峰浓度的1/10~1/20 6．稳定性——确保所有样品准确测定 7．提取回收率——确保准确度 (一) 方法特异性（专属性或选择性）

1、定义：系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力，表示所检测的信号

（响应）系属于待测药物所特有

2、操作：比较空白血浆、模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号。 3、作用：

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COOHIIICOOHICOOHIINHICO(CH2)4CONHICH3CONHCONHCH3I

IIH2NICH2CHCOOHC2H5

胆影酸 碘他拉酸 碘番酸

OFCOOHI

CH3CH(CH2)8COOCH2CH3NNC2H5

OFCOOHHN

NHNNC2H5

CH2OCOCH3CCH3HHOOOCCH3CH3碘苯酯 诺氟沙星 诺氟沙星

HOICOICH2CH2CH2CHOCH2CH2N(C2H5)2HClCH3FO3

OF

盐酸胺碘酮 醋酸氟轻松

一、卤原子的活泼性

1. 卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系： （1）乙烯型卤和芳卤 不活泼

CH2CHXX （2）烯丙型卤和苄卤 活泼

CH2CHCH2XCH2X （3）卤代烷型 介于两者之间

CH2

CH(CH2)nX n≥2不牢固。 26

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2. 分子中所含卤原子的个数

分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显。 3. 卤素的种类

结合牢固程度：I＞Br＞Cl＞F 二、含卤素有机药物的分析

适当的处理-C-X???????X

(一) 直接回流后测定法

1、原理：本法是将含卤素有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，加入NaOH溶液（或定过量的AgNO滴定液）后，加热回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，

3然后采用间接银量法（Volhard法）测定。

2、适用范围：卤素原子结合不牢固的药物（如卤原子和脂肪碳原子相连者）。 3、例 三氯叔丁醇的测定 ChP（2005）

CH3CH3COHCCl3 测定方法 取本品约0.1g，精密称定，加乙醇5ml溶解后，加20%氢氧化钠溶液5ml，加热回流15min，放冷，加水20ml与硝酸5ml，精密加硝酸银滴定液(0.1mol/L) 30ml，再加邻苯二甲酸二丁酯5ml，密塞，强力振摇后，加硫酸铁胺指示液2ml，用硫氰酸胺滴定液(0.1mol/L)滴定，滴定终点时消耗硫氰酸胺滴定液20.0 mL，并将滴定的结果用空白试验校正。问：每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于CHClO·1/2HO(M=186.47) 的滴定度是多少？

4732三氯叔丁醇的百分含量？

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CCl3?C(CH3)2?OH + 4NaOH回流△(CH3)2?CO + 3NaCl+ HCOONa+ 2H2ONaCl+ AgNO3AgNO3+ NH4SCNAgCl↓+ NaNO3(Ksp=1.56×10–10 )AgSCN↓+ NH4NO3(Ksp=1.0×10?12 )（白色）Fe3+ + SCNˉ(K=138)反应摩尔比为1∶3

T??13ba?M?BFe (SCN) 2+（淡棕红色） ?0.1?186.47 ?6.216mg/mL%?T?V?F/W?100%??6.216?(VA?VB)?1W6.216?(30?20)?1100?100% ?100%?62.2%(二) 碱性或酸性还原后测定法

1、原理：本法是将含卤素有机药物在碱性或酸性下，加还原剂（如锌粉）加热回流，药物产生还原裂解反应，使有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Fajans法）测定。

2、适用范围：适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。 (1) 碱性还原后测定法 例 泛影酸的测定

取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9I3N2O4。

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ChP(2005)收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。 (2) 酸性还原后测定法 例 碘番酸的测定

IIH2NICH2CHCOOHC2H5 (三) 氧瓶燃烧法 1、原理

将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。

2、适用范围：适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析 3、特点：简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析 4、仪器与材料 （1）仪器装置

燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状。 （铂丝燃烧时起催化作用）

（2）称样用材料及称样

A. 固体样品 无灰滤纸 B. 液体样品 纸袋

C. 软膏类样品：将适量样品置不含被测成分的蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤包

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裹

（3）氧气 （4）吸收液

A. 作用：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。

B. 吸收液的选择

氟 水 氯 NaOH溶液

溴 HO-NaOH， NaOH-硫酸肼饱和溶液

22碘 NaOH－硫酸肼饱和溶液 硫 NaOH或HO

22硒 硝酸溶液

5、操作方法 （1）样品的准备

取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。 （2）燃烧瓶燃烧前的准备

用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，将瓶口用水湿润，小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。 （3）样品的燃烧

点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，俟燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水

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