猪脑心肌炎病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(Encephalom-yocarditis virus,EMCV)所致猪的一种急性病毒性疾病,以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征。仔猪感染EMCV可引起急性致死性心肌炎,造成猪只急性死亡;怀孕母猪感染会造成流产,产死胎、弱胎、木乃伊胎。该病在美国、法国、德国、意大利等多个国家均有发生,并在某些地区呈地方性流行。

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中同兽医杂忐 20 0 6年 ( 4第 2卷 ) 1第 1期

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猪 l,肌炎病毒结构蛋白 V 因的 lb￣ P 1基克隆与原核表达盖新娜，杨汉春，郭鑫，陈艳红，查振林(国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室，京海淀 1 0 9 中北 0 0 4)中图分类号： 8 Q7文献标识码： B文章编号：5 96 0 (0 6 1 0 0— 3 0 2—0 5 2 0 ) 1 0 90

猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒 ( n e h lm— E cp ao

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1材料与方法

个国家均有发生，并在某些地区呈地方性流行。 E MC是微 RNA病毒科、病毒属的惟一成 V心员，基因组为单股正链 R其 NA,长约 7 8 k。全 . b EMC的农壳蛋白由 4种结构蛋白 VP、 2 VP V 1 VP、 3

l l毒株、,菌种及各种载体 E V毒株 ( MC美国明尼苏达州立大学惠赠 ) E.oi ) a表达载体 p X、 cl IHS、 GE 6一 P 1及 E cl B 1( E )由本实验室保存； . oi I 2 D均 p M——ayv co购自北京天为时代有限公司。 GE T es e tr 1 2试剂 RNA提取试剂盒 TR Z )￣ e g n . I (L I R a e t S购自GI C公司； BO AMV反转录酶、 qD Ta NA聚合酶及T4 DNA Lg s iae等购 I rme a公司； NA快速回￣ o g 1 P D收试剂盒购自北京博大泰克公司； o 和 Xh l等 EcR I oI 限制性内切酶购自Sg ima公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗猪 IG由本试验窀制备。 g 1 3病毒繁殖将保存的病毒接种于牛长良好的 . B HK一 1细胞上， 2观察细胞病变 ( P。当 8的细 C E) O胞出现C E时将细胞液反复冻融。 0/ n离心 P 30 0rmi 1 n去除细胞碎片， 8存备

用。 0mi 0 C保

和VP 4组成。这4种结构蛋白外，除还含有非结构蛋白2 2 2 2 3 3 A、B、C、D、A、 B以及蛋白酶 3 C和RNA依赖性聚合酶3 2 VP DL。 l蛋白由3 3个氨基酸组成，] 2位于病毒粒子的最表面_, E V结构蛋白中免疫 3是 MC]

原性最强的抗原蛋白，]针对 VP1的抗体具有一定的中和活性。目前我国规模化猪场尚未确证猪脑]心肌炎的存在，研究旨在利用原核表达系统表达本E MC的 VP蛋白， V 1以期为建立猪脑心肌炎的血清

1 4猪 E V阳性血清的制备 I用毒价为 l。 . MC O TC D。ml I/的病毒液经肌肉注射和鼻内接种两种途径接种4 0日龄健康猪 1。头免疫程序为： 1次接种第 2ml第 2次接种 3ml第 3次接种 1 , , , Om1每次间隔5 天； 4次接种 5ml 5天后采血，离血清， 0 第 ,分一2 C保存。 1 5 VP . 1基因的 RT— C扩增与克隆及测序 l P R _ 7 参考 Ge B n n a k上 E MC毒株的 VP V 1序列，选择保守区域设计并合成包括完整VP1因的特异性引物：基

学诊断与检测方法和我国猪群 E V感染的血清 MC学调查奠定物质基础。收稿日期：0 50— 2 0— 41 9

作者简介：盖新娜 (9 4)讲师， 17一， 博士，究力向为动物分子病研。毒学与免疫！辈

通讯作者：汉春， i:a g a c u l CU e u c杨 E ma y n h nh n@ l d . n l t

省区，且近几年呈上升趋势，稳居我国法定报告传染病

发病总数和死亡总数之第二位，死率和死亡率则位病

居各传染病之首位，犬是最主要的储存宿主和传播宿主。因此研制安全有效的疫苗和建立特异敏感的快速诊断方法对于防制狂犬病是非常必要的。我们对 R V

E RA株进行了详细的分子生物学研究，对该毒株 N、G、 L 3种主要结构蛋白基因进行了克隆和序列分析

(关于G和 L基因的克隆与序列分析另文发表 )并进，行了原核和真核表达，目的为进一步研制快速诊断其试剂和安全有效的基因T程疫苗，奠定良好的基础。

参考文献：[]殷震，刘景华 .动物病

毒学 ( 2版 ) M] 1第 r .北京：学出版社，科l 9 . 7 7 7 5 9 7 7 9 .

[]俞永新. _病和秆大病疫苗[ .北京： 2狂犬 M]巾国医药科技出版

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