苜蓿生物技术中研究（已发表）

苜蓿生物技术研究

俞金蓉 玉永雄

（西南大学牧草与草食家畜重点实验室，重庆 北碚 400716）

摘要：苜蓿是世界上重要的豆科牧草，它具有品质优良易于栽培等特点在生态环境保护方面也发挥着积极作用，随着分子生物学和植物基因工程的发展，在分子水平上对苜蓿进行遗传改良的研究已取得了部分成果。本文简单介绍了苜蓿组织培养的种类及影响因素，综述了近年来遗传转化和分子标记等生物技术在苜蓿研究领域的应用，并展望了苜蓿基因工程在今后研究工作中的重要地位和发展前景。 关键词：苜蓿；生物技术；研究进展

Application of biological techniques in alfalfa

YU Jin-rong, YU Yong-xiong

(Southwest University, Forage & Herbivore Key Lab., Beibei Chongqing 400716)

Abstract: As an important legume forage plant in the word, alfalfa possesses quite a fine quality of nutrition, easily to be planted ,and playing a positive role in improving natural environment. With the development of molecular biology and genetic engineering of the plant some achievements about genetic improve of alfalfa have been obtained on the molecular level .In this paper, some types and influence factors of alfalfa tissue culture were introduced briefly, application in the research field of the alfalfa, such as genetic transformation and molecular marking was summarized .Finally, we also looked forward to the important position and prospect of alfalfa genetic engineering in the research wok in the future.. Keywords: Alfalfa; Biotechnology; Progress

苜蓿（Medicago sativa），英文名Alfalfa或Lucerne，为豆科，苜蓿属。是世界上栽培最早，分布面积最广的优质豆科牧草之一。全世界种植面积约3500万hm。苜蓿在我国已有两千多年的栽培历史，全国各地都有种植，主要分布在西北和华北地区，种植面积约499万hm。苜蓿中蛋白质含量约占总干物质量的17％－20％，与其它豆科牧草相比，其营养价值被列为各种牧草之首，又由于其高产、稳产、易栽培等特点，素有“牧草之王”的美誉，是一种极好的饲料作物。尽管苜蓿优点甚多，但也存在种子细小、硬实率较高、产量低、花叶病危害大及反刍动物大量采食易得膨胀病等，这就给苜蓿产业化生产带来了许多不便，人们已充分认识到针对上述缺点对苜蓿加以改良的必要性。 因此以常规育种为基础，借助于生物技术改良品质，培育优质、高产的新品种，不失为一种直接、有效的方式。

1972年，美国率先开始了对苜蓿花药和组织培养技术的研究。与此同时，前苏联也进行了类似的研究，并进行百脉根、红三叶、红豆草的花药培养、组织培养和细胞培养技术的研究。加拿大等国还研究了紫花苜蓿原生质体培养技术。70年代末到80年代初，美国等又开始了牧草基因工程的研究，并取得了突破，1991年转基因苜蓿植株已移至田间种植。我国牧草生物技术的研究是在70年代末开始起步的，一个重要标志是1979－1980年黑龙江畜牧研究所和中国农业科学院草原研究所分别运用花药培养获得了紫花苜蓿再生植株。在发达国家，基因工程中的许多先进技

22

术已被广泛应用于苜蓿研究的各项领域，并在苜蓿抗性育种、减少膨胀病危害、提高干物质消化率、品质改良等方面取得了进展和突破。国内在上述方面的研究则起步较晚，与国外相比尚存在一定的差距。 1.苜蓿组织培养

1972年,美国学者Saunders 和Bingham[1]从未成熟的苜蓿花药、子房、子叶愈伤组织分化再生植株成功，标志着苜蓿组织培养研究的开始，自此大量有关苜蓿组织培养的研究工作得以开展。到目前为止，苜蓿的组织培养已经发展到许多种方法，并已建立起了成熟的再生体系。常用的组培途径有愈伤组织培养、原生质体培养、细胞悬浮培养、茎尖分生组织培养、花药培养、合子胚培养等。

影响苜蓿组织培养效果的因素很多,据国内外关于苜蓿组织培养的报道,大致可分为如下几种: （1）品种基因型

基因型在植株再生中的重要作用已得到许多学者的肯定。已经证实，不同的苜蓿品种再生能力存在着遗传差异, 即使是再生能力较强的品种，在不同的再生体系中也会显示不同的结果。 苜蓿愈伤组织的植株再生能力是高度遗传的，并可通过轮回选择的方法进一步提高再生能力。 邓百万等认为，基因型杂合程度越高的品种，其胚胎形成能力越强，再生能力也越高。 （2）外植体型

苜蓿组织培养开展近30年来， 国内外研究报告中所采用的外植体种类繁多，几乎苜蓿所有的器官或组织都可作为外植体，如茎尖、叶片、茎段、幼芽、子叶、下胚轴、上胚轴、花药、花粉、子房、胚珠、叶柄等。一般形成脱毒苗时常以茎尖作为外植体，可高度保持种性；形成胚性愈伤组织时可选用叶柄、子叶、上胚轴、下胚轴、幼芽等作为外植体，优点是：污染较小、材料易得、操作方便；快繁时可选用茎段、花茎、叶片、花序等作为外植体，操作简单、取材容易；单倍体选择则应选花药、花粉、胚珠、子房等作为外植体，但组织培养的难度较大。 （3）培养基种类、激素浓度及配置组合

苜蓿组织培养中最常用的培养基有如下4种：B5、N6、MS和SH。多数报道为：以它们其中一种或两种为基本培养基，再辅加一些细胞生长调节物质，如NAA、IAA、2,4-D、6-BA、KT、ZT等，其中NAA、IAA、2,4-D属于植物细胞生长素类，在离体培养中主要诱导愈伤组织的形成和根的发育。而6-BA、KT、ZT则属于细胞分裂素类，在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。

危晓薇等的研究发现，用SH 培养基的无机盐与MS培养基的有机成分对诱导苜蓿愈伤组织较合适。另外在培养基中加入适量水解酪蛋白（CH）、肌醇对愈伤组织的健康生长和芽丛分化也都有促进作用。肖荷霞等 报道。不同外植体来源的愈伤组织生长以及降低褐化所需的激素种类和浓度不同。对于下胚轴形成的愈伤组织

2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L是一个较为理想的组合，茎的愈伤组织在1.0mg/L的2,4-D与1.5-2.0mg/L的KT 配合使用时，生长量与KT呈正相关，而在0.5mg/L的2,4-D条件下，3.0mg/L的KT 反不如1.0mg/L 的KT效果好。 2 苜蓿遗传工程

[5]

[4]

[3]

[2]

由于苜蓿在畜牧生产上占有极其重要的地位。与其它牧草相比，生物技术在苜蓿中的研究进行得较为深入。各种研究手段，转化方法如原生质体融合、诱导变异、利用农杆菌介导、电击法、显微注射、基因枪直接导入外源DNA等均有成功报道。另外，转化的内容也极为广泛，包括品质改良，抗除草剂，抗病虫害，抗逆性等。 2.1 突变体细胞筛选

苜蓿经过脱分化或原生质体形成的再生植株，会产生变异，实验证明这些变异有些是可遗传的，而培养基中加入有毒物质或实验材料经过处理，产生变异机会更大。这是利用体细胞无性系变异选育新品系的基本原理。 在抗寒突变体的筛选方面：由继红等报道，以紫花苜蓿叶片诱导产生的愈伤组织（诱导时间在一个月左右，继代次数不超过三代）为诱变供试材料，以EMS为诱变剂，进行低温筛选，成功地获得了抗寒性突变体。另外，已有许多的研究表明，生物胁迫和非生物胁迫都与活性氧有关。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）能消除活性氧对细胞膜的伤害。Mckersie等1993年将烟草的Mn-SODcDNA 导入苜蓿后,转基因苜蓿的抗寒性得到了提高，并保持有较高的生活力。

在抗旱方面：张志胜和赵世绪1995年以PEG为诱导剂和筛选剂，通过三种途径获得了抗旱性稳定的，抗20％PEG和抗25％PEG的愈伤组织以及抗20％PEG 的带芽愈伤组织，并从抗20％PEG 的愈伤组织和带芽愈伤组织获得了再生植株。

在抗盐性选择方面：Croughan 等选择的紫花苜蓿耐盐细胞系可忍耐1％NaCl，中国农科院北京畜牧所也筛选出了在含盐量为0.3％的土壤中生长良好的苜蓿再生植株。 2.2 体细胞杂交

尽管苜蓿是优良的豆科牧草，但反刍动物采食新鲜茎叶后易得膨胀病，而红豆草、驴喜豆等植物中的凝缩单宁物质可以防止反刍家畜膨胀病的发生。为此人们大胆设想，若能将红豆草、驴喜豆中不致膨胀病的基因转入苜蓿中去，苜蓿就可产生适量单宁，从而有效避免膨胀病的发生。因此，体细胞杂交不失为一种有效的方法。 Teoule[9]最早在苜蓿的育种中利用了体细胞杂交技术，他把杂交可育的紫花苜蓿 M.sativ(2n=4x=32)和F.alcata(2n=4x=32)的原生质体融合，获得了第一株体细胞杂交植株。在我国，徐子勤和贾敬芬

[10]

[8][7]

[6]

[6]

报道，通过原生

质体融合和培养，成功地获得了苜蓿红豆草属间体细胞杂种植株。另外，由苜蓿和驴喜豆细胞融合也已得到杂种植株。然而，种属间体细胞杂交所得到的杂种，一般DNA 倾向于苜蓿，我们所期望导入的优良基因等遗传物质通常是被排斥的，所以，通过体细胞融合来改良紫花苜蓿的工作尚需进一步研究。2.3 外源DNA导入 2.3.1 品质改良基因工程

牧草品质包括很多内容，最主要的有营养品质和可消化性。提高牧草饲料中蛋白质的含量，特别是含硫氨基酸（SAA）如甲硫氨酸和半胱氨酸的含量，可显著增加羊的生长速度及羊毛产量。早在1991年，Schroeder等

[11]

首次

将鸡卵清蛋白基因转人苜蓿，并在转基因植株中检测到了鸡卵清蛋白的增加。澳大利亚针对紫花苜蓿叶中半胱氨酸含量低这一缺点，将能编码富集半胱氨酸的清蛋白的豌豆基因通过农杆菌导入苜蓿细胞，以这种转基因苜蓿喂羊，可提高羊毛产量5％。在我国，吕德扬等

[12]

（2000b）通过农杆菌介导法已将高含硫氨基酸蛋白基因（HNP）导入苜

蓿，并成功地诱导出再生转基因植株。对转基因植株进行氨基酸分析，发现含硫氨基酸的含量有明显提高。同时吕德扬等

[13]

（2000a）又报道了由发根农杆菌介导的高含硫氨基酸蛋白基因（HNP）和发根基因（rol）植株的再生。

改良牧草营养品质的另一方面是提高牧草或饲料的消化率。人们发现牧草或饲料的消化率一定程度上决定于牧草中木质素的含量，通过降低木质素含量可大大提高牧草和饲料的可利用率和饲料的可消化性。肉桂醇（酸）脱氢酶（CAD）是催化木质素单体合成的最后一步关键酶，牧草中木质素的生物合成受该酶调控。1999年，Baucher 等

[14]

用反转录RNA技术成功地降低了苜蓿植株中CAD 酶的活性。转基因植株中的木质素组成发生很大变化（虽然没有改变含量），从而提高了木质素的溶解性和消化率，减少了苜蓿茎干物质在细胞壁中的残留，大大增加了牧草的消化率和利用率。

2.3.2 抗病、虫基因工程

病毒是以裸露的形式在植物细胞中繁殖和扩增的，研究人员发现，病毒的外壳蛋白（Coat Protein, CP）可以通过重新包装病毒或抑制病毒脱壳来抵制病毒对植物细胞的破坏。因此，向目标植物中导入病毒外壳蛋白基因，是目前植物抗病毒基因工程中最有效的技术路线之一。1986年，Oliver等

[15]

首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因转

[16]

入烟草当中，培育出了抗TMV的烟草植株，成功地开创了抗病毒基因工程的新纪元。1999年Hill等将编码苜蓿花

叶病毒（AWV）外壳蛋白基因转入5个不同的苜蓿品种，AWV病毒接种试验证明，对照植物在10mg/ml时已感病，而转基因植物在50mg/ml浓度下仍对AEV具较强的抗性。

目前，在抗虫基因工程中使用的抗虫基因有三大类： 一是从微生物苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, B.T.）分离出的杀虫结晶蛋白基因（Insecticidal crystal protein），简称Bt基因；二是从植物中分离出的蛋白酶抑制剂基因；三是植物外源凝集素基因（Lectin gene）。Bt能使昆虫神经中毒死亡，而对脊椎动物无毒性。蛋白酶抑制剂（PI）则主要通过抑制昆虫消化系统中的蛋白酶，抑制蛋白质降解，从而使昆虫消化不良而影响昆虫正常生长发育，直至死亡。1987年，人们首次获得了转Bt基因的烟草。1996年Strizhov等

[17]

将Bt基因转入苜蓿，转基因苜蓿对海灰翅叶蛾

[18]

（Spodotera lit-toralis）和甜菜叶蛾（S. exigua）均表现出较高的抗性。Javie等蓿。转基因植株对鳞翅目昆虫具有良好的抗性。2.3.3 抗除草剂基因工程

人将番茄蛋白酶抑制剂基因转入苜

随着转基因技术的发展，研究人员正在通过三个途径创造除草剂耐受性作物：提高对付特殊除草剂的酶的表达水平，表达一种突变体酶，这种酶不受除草剂的影响；表达能解除除草剂毒性的酶。1984 年, Donn等苜蓿的一种变异型比野生型对除草剂PPT的抗性强100 ～200 倍。D’Halluin等

[ 20 ]

[19]

就发现了

建立了农杆菌介导的抗除草剂基

因的转化体系，比较了三个选择性标记基因的特性，并导入了一个广谱性的抗除草剂基因。同时,田间试验结果表明，转基因苜蓿目的基因表达受花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制的植株，对除草剂的抗性最强，而在T - DNA TR’2 启动子的控制下的植株对除草剂的抗性表现较弱3.苜蓿分子标记技术

3.1 分子标记辅助育种和种质渐渗研究

[20]

。

利用基因组特异性分子标记可以检测和促进有利基因从苜蓿野生种向栽培种的渐渗。McCoy(1985)

[21]

曾利用胚

珠一胚组织培养方法试图将Medicago dzhawakhetica中的抗病和抗寒基因引进到优良栽培品种中。另外，McCoy和Bingham 曾利用二倍体M.sativa和四倍体M.dzhawakhetica杂交产生F1代，尔后用不同的四倍体M.sativa杂交至产生BC3代，他们利用RAPD和RFLP对F1、BC1、BC2、BC3代的植株进行分析，从中发现了M.Hzhawakhetica特异的70个RAPD标记和l5个RFLP标记。利用这些特异性标记进行辅助育种选择，将有利于促进M.dzhawakhetica中的优良基因向栽培种中的转移。

[22]

3.2 遗传连锁图谱的绘制

利用分子标记可绘制遗传连锁图谱，用于重要农艺性状基因在染色体上的定位。Brummer、Echt、Kiss等个研究小组分别利用不同的二倍体群体和不同的标记构建了苜蓿的连锁图。Eclat等着控制叶子和菜花状花序突变体基因，Kiss等

[25]

[24]

[23]

三

的图谱中第四连锁群上分布

[26]

的图谱中则含有控制花色、矮壮和叶片绒毛的基因。Yu和Pauls

报道了在四倍体苜蓿F1 群体中32个RAPD标记的分离结果，他们发现在四倍体F1 群体中，控制体胚再生的基因与一些RAPD标记连锁，最大重组距离为36％，并且报道了构建四倍体苜蓿遗传图谱的策略。3.3 种质鉴定

利用RFLP和RAPD两项技术研究苜蓿品种资源表明，苜蓿品种的杂合性强，来自不同谱系和具有不同表型的品种可用分子标记来加以区分。Yu和Pauls

[26]

利用RAPD技术采用混合样品，分析了几个不同的苜蓿品种，并认为此法应

作为鉴定品种、系统学研究和选择具有杂交优势亲本的首选方法.

Pupilli等

[27]

曾利用RFLP标记来研究四倍体紫花苜蓿(M. sativa)和二倍体蓝花苜蓿(M.coerulea)体细胞杂交

产物的指纹图谱，研究表明，在体细胞杂交中存在着染色体重排和缺失等现象。曾利用RAPD技术对中国苜蓿审定品种进行了鉴定分析；魏臻武

[28]

利用RAPD标记，检测苜蓿品种(系)的系有DNA多态性，并构建了55个苜蓿品种(系)的

指纹图谱，可用于苜蓿品种鉴定。

3.4 杂种优势预测和遗传多样性研究

Kidwell

[29]

根据61个多态DNA标记计算出的遗传距离和单交种后代的产量，发现在四倍体苜蓿的产量和预测的杂

[30]

合度之间有正相关，这就提示我们，亲本之间的遗传多样性能用于预测后代的产量。Bingham等人显性位点互补基因互作可以解释苜蓿的渐进杂种优势和近交衰退。李拥军和苏加楷

[31]

认为，连锁的

曾利用种子蛋白DNA的RAPD技

术分析了我国l8个地方品种和美国9个代表品种的遗传多样性，认为我国苜蓿品种的杂合性较高，品种间遗传差异较小，相对来讲遗传差异主要存在于品种内。另外还得出了苜蓿的遗传结构不仅与其异交繁育体关，还与品种来源有关的结论。 4.前景展望

豆科植物不仅是人类自身蛋白质和脂肪的重要来源之一,也是牲畜的优质饲料。苜蓿作为一种重要的豆科饲料作物, 已成为植物分子研究水平上典型的模式植物之一。其主要原因在于：苜蓿的基因组较小，与其它豆科植物有一定的同源性，在倍性水平上可以随意操作，再生体系建立得比较成熟，组织培养技术完善。以上这些优点，均为

苜蓿作为平常研究的首选试材打下了坚实的基础。通过基因工程技术对其进行遗传操作，不仅可以对苜蓿本身加以改良和创新, 还可以为其它豆科植物在细胞水平上的遗传操作提供可靠的理论依据和有效途径。综上所述，随着生物技术在苜蓿研究领域的不断发展与应用，人们经过数十年不懈的努力，在提高牧草种子及饲草产量、改良饲草品种、增强品种抗性及适应性等方面已取得了丰硕的成果。但与其它重要农作物玉米、水稻、小麦等研究工作相比，苜蓿基因工程仍属于一个新生事物。我们应该广泛借鉴其它植物研究中的生物技术手段，加强研究力度，深入研究程度，使生物技术为苜蓿的遗传改良及产业化生产开辟更为广阔的途径，也使苜蓿基因工程自身的研究成果为其它植物的遗传转化研究积累经验。 参考文献：

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基金项目：重庆市重点基金项目“CSTX，2006BA1008”

作者简介：俞金蓉（1980-），女，甘肃省武威市人，西南大学在读硕士研究生，主要从事牧草分子遗传育种研究。

TEL:023 68251080 E-MAIL:rr_angel@163.com TEL：13647683092

通讯作者：TEL:023 68251096 E-MAIL: yuyongxi@swau.cq.cn

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