产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

南 阳 理 工 学 院

本科生毕业论文

学 院： 生化学院 专 业： 生物工程 学 生： 范振前 指导教师： 李入林

完成日期 2009 年 6 月

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

南阳理工学院本科生毕业论文

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

Amylase Production By Bacillus Subtilis Culture Medium Optimization

总 计： 18 页 表 格： 4 个 插 图 ： 6 幅

1

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

南阳理工学院本科生毕业论文

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

Amylase Production By Bacillus Subtilis Culture Medium Optimization

总 计： 18 页 表 格： 5 个 插 图 ： 5 幅

学 院（系）： 生化学院 专 业： 生物工程 学 生 姓 名： 范振前 学 号： 15407017 指 导 教 师（职称）： 李入林（副教授） 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 2009-05-30

南阳理工学院

Nanyang Institute of Technology

2

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

生物工程专业 范振前

[摘 要] 本课题以产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌为出发菌株，研究其摇瓶分批发

酵的最优液体发酵培养基，通过单因素实验确定发酵培养基中最佳碳、氮源分别为蔗糖和蛋白胨，其浓度分别为3%和6%。利用旋转回归法研究枯草芽孢杆菌发酵生产α-淀粉酶的2个重要因素：蔗糖、蛋白胨对α-淀粉酶活力的影响，并拟合出回归方程。经回归分析表明，蔗糖、蛋白胨的含量及其配比对α-淀粉酶活力有显著影响。

由响应面优化实验设计得出最优液体发酵培养基组成为：蔗糖3%、蛋白胨6%、磷酸氢二钾0.8%、硫酸铵0.4%、无水氯化钙0.2%。条件：pH值7.0，温度37℃；此条件下α-淀粉酶活性显著提高并可达到391.66u/L。

[关键词] 枯草芽孢杆菌 SAS 优化 α-淀粉酶

Amylase Production By Bacillus Subtilis Culture Medium Optimization

Biological Engineering Major FAN Zhen-qian

Abstract: subject to the production of α-amylase from Bacillus subtilis strain for the study of its shake-flask batch fermentation liquid of the optimal fermentation medium, Single factor experiments to determine the best fermentation medium carbon and nitrogen sources were sucrose and peptone, and its concentration was 3% and 6%. Study on the use of rotational regression fermentation of Bacillus subtilis α-amylase production of two important factors: sucrose, peptone of α-amylase activity, and fitting a regression equation. By regression analysis showed that sucrose, peptone content and the ratio of α-amylase activity has a significant influence.

From the experiment of response surface optimization design include the optimum composition of the liquid fermentation medium: sucrose 3%, 6% peptone, 2 potassium hydrogen phosphate 0.8%, 0.4% ammonium sulfate, anhydrous calcium chloride 0.2%. Conditions: pH value of 7.0, temperature 37 ℃; these conditions α-amylase activity significantly increased and reached 391.66u / L.

Key words: Bacillus subtilis SAS optimization α-amylase

3

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

目 录

1 引言 .................................................................... 1

1.1 枯草芽孢杆菌简介及应用 ............................................ 1

1.1.1 枯草芽孢杆菌简介 ............................................. 1 1.2.2 枯草芽孢杆菌应用 ............................................. 1 1.2 α-淀粉酶简介及应用 ............................................... 2

1.2.1 α-淀粉酶简介 ................................................ 2 1.2.2 α-淀粉酶在工业上的应用 ...................................... 3 1.3 课题背景 .......................................................... 4 1.4 国内外研究现状及发展动态 .......................................... 4 1.5 本课题的研究方法及目的 ............................................ 5

1.5.1 本课题研究方法 ............................................... 5 1.5.2 研究目的 ..................................................... 5

2 研究内容 ................................................................ 6

2.1 材料与方法 ........................................................ 6

2.1.1 菌种 ......................................................... 6 2.1.2 培养基 ....................................................... 6 2.1.3 主要试剂 ..................................................... 6 2.1.4 主要仪器 ..................................................... 6 2.1.5 分析测定方法 ................................................. 7 2.2 结果与分析 ........................................................ 8

2.2.1 菌种对数生长期的确定 ......................................... 8 2.2.2 菌种最佳发酵周期的确定 ....................................... 9 2.2.3 单因素实验结果 .............................................. 10 2.2.4 预备试验设计及结果 .......................................... 11 2.2.5 响应面法实验设计结果 ........................................ 12 2.2.6 数据分析 .................................................... 12 2.2.7 采用岭脊分析寻求蔗糖与蛋白胨的最佳配比 ...................... 13 2.2.8 验证试验 .................................................... 14

3 结 论 .................................................................. 15 参考文献 ................................................................. 16 致谢 ..................................................................... 17 附录 ..................................................................... 18

4

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

1 引言

1.1 枯草芽孢杆菌简介及应用

1.1.1 枯草芽孢杆菌简介

枯草芽孢杆菌（Bacillaceae）编号为Strain Number ACCC 11060，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]。早在1835 年，Ehrenberg 所描述的“Vibrio subtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae) 的模式菌株[2]，芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。 1.2.2 枯草芽孢杆菌应用[3]

枯草杆菌(B acillus Subtilis) 是一种重要的α-淀粉酶生产菌。同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐。

① 枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用

工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

② 枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用

枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平， 现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。

③ 枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料

枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200 种原核和真核生物来源的蛋白

5

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。

④ 枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用

枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。

⑤ 枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用

研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。

⑥ 枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用

枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体及有害气体(氨、硫化氢等) ，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等) ，后分解为更小分子的有机物 ，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD ，使水体中氨基氮(NH3-N) 、亚硝基氮(NO2-N) 和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质，同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。越来越多研究发现，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用。

1.2 α-淀粉酶简介及应用

1.2.1 α-淀粉酶简介

α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。其国际酶学分类编号为EC.3.2.1.1。作用于淀粉时可从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖，由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称之为α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子的内部随机切开α-1，4 糖苷键，起液化作用的一类酶。 1.2.2 α-淀粉酶在工业上的应用

α-淀粉酶在淀粉加工、食品、医药、发酵及酿造、制糖和纺织等工业上应用广泛，

6

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

它是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一，工厂上都以微生物发酵法为主进行大规模生产。目前，利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵生产α-淀酶，对于人类的生产、生活具有十分重大的现实意义。

① 面包焙烤工业，作为保鲜剂

酶应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史。最近几十年，麦芽α-淀粉酶和微生物α-淀粉酶被广泛用于焙烤工业。这些酶用于面包工业，可以使产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软。

直到今天，焙烤工业中的α-淀粉酶一直是从大麦麦芽和细菌、真菌中提取的。从1955年以及1963年在英国经过GRAS等级验证后，真菌淀粉酶一直作为面包的添加剂。现在，它们应用于不同领域。现代化连续焙烤过程中，在面粉中添加α-淀粉酶不仅可以增加发酵率，降低生面团粘度，增加生面团中糖的含量，改良面包的口感、外皮颜色和焙烤质量，还可以延长焙烤食品的保鲜时间。 淀粉的液化作用和糖化作用

α-淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖、果糖等。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆(HFCS)，由于它们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂，这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α-淀粉酶。α-淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟。

② 纤维脱浆

现代纤维制造工艺在编织过程中会在纱线中产生大量的细菌，为防止这些纱线断裂，往往会在纱线的表面加一层可去除的保护层。这些表面保护层的材料有很多种，淀粉是非常好的一个选择，因为它便宜，容易获取，并且可以很容易去除。淀粉脱浆可以利用α-淀粉酶，它能够选择性的去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机的使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉。

③ 造纸工业

淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉，纸张上的浆糊主要是保护纸张在处理过程中免于机械损伤，它同样也改良了成品纸的质量，浆糊提高了纸张的硬度和强度，增强了纸张的可擦除性，是一种很好的纸张涂料。自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高，可以利用α-淀粉酶部分降解。

④ 除垢剂中的应用

淀粉调节酶是现代高效除垢剂的成分之一。酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。早期的自动洗碗机的除垢剂非常粗糙，容易在进食时对人体造成伤害，而且对陶瓷、木质餐具也会造成损害。α-淀粉酶从1975年就被应用于洗衣粉，现在90%的液体除垢剂都含有α-淀粉酶而且自动洗碗机的除垢剂对α-淀粉酶的需求也在不断增长。

7

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

⑤ 制药和临床化学分析

随着生物工程的不断发展，淀粉酶的应用涉及到许多其他领域，如临床、制药和分析化学。有报道，于α-淀粉酶的液体稳定试剂已应用于全自动生化分析仪Ciba Corning Express 临床化学系统。已经建立起一种利用淀粉酶探测更高低聚糖含量的方法[4]。

1.3 课题背景

α-淀粉酶一般可由微生物发酵生产，也可由动物和植物提取。目前，工厂都以微生物发酵法为主进行大规模生产α-淀粉酶。我国从1965年开始应用枯草芽孢杆菌BF-7658生产α-淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产。现在国内生产酶制剂的厂家已发展到上千家，其中约有40%-50%的工厂生产α-淀粉酶，总产量上万吨[5]。

近年来，国外生产耐热α-淀粉酶发展较快，已从嗜热真菌、高温放线菌、特别是嗜热细菌中分离得到了耐高温的α-淀粉酶菌种。但就国内而言，虽已开展了耐高温α-淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草芽孢杆菌菌种生产α-淀粉酶。

1.4 国内外研究现状及发展动态

芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一，它是由Cohn 1872年正式命名的，现在作为芽孢杆菌科的模式菌株。国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史，早期大部分的工作主要集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。随着人们对枯草芽孢杆菌研环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶等十几种酶[6]。其生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，仅二者就占到了整个工业酶市场的50%。其中，淀粉酶的生产和应用处于整个酶制剂的首位，其最早是在20世纪初，由德国的Boiden和E ffront先后从枯草芽孢杆菌培养液中分离出的[7]。

1965年，我国开始应用淀粉芽孢杆菌BF-7658生产α-淀粉酶。1967年杭州怡糖厂实现了应用α-淀粉酶粉酶生产饴糖的新工艺，可以节约麦芽7%，提高出糖率10%左右。1984年我国开始了酶法水解淀粉生产葡萄糖工艺的研究。1989年9月通过了酶法注射葡萄糖新工艺的鉴定，并先后在华北制药厂、河北东风制药厂、郑州嵩山制药厂等单位得到应用，取得了良好的经济效益。另外我国以酶法进行柠檬酸生产、谷氨酸发酵、糖化制啤酒、酒精发酵、黄酒酿造、酱油制造、醋生产等方面也已经成功投入生产。虽然我国酶制剂工业近年来取得了长足的发展，但仍无法跟上世界同行业发展的步伐，科研

8

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

乏力已成为制约中国酶工业发展的瓶颈因素。

1.5 本课题的研究方法及目的

1.5.1 本课题研究方法

利用微生物发酵生产各种有用代谢产物，其培养基成分种类繁多，各成分间的相互作用也错综复杂。因而，微生物培养基的优化工作就显得尤为重要，数学统计中的多种优化方法已开始广泛地应用于微生物发酵培养基的优化工作中，其中以响应面方法的效果最为显著。

通常优化发酵培养基的方法是单次单因子法，预先不知道哪些是重要因素，可以通过极差试验或和正交试验设计法。采用单次单因子法时，只是讨论一种因素的影响，由于考察因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件[8] 。正交试验设计则注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平组合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。因此，人们期望找到一种试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用的回归分析方法，响应面分析方法则在很大程度上满足了这些要求[9]。

响应面方法(ResponseSur-faceMethodology，简称RSM)是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。RSM在优化研究中应用频繁[10]，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法，它已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域[11] 。本试验通过响应面方法优化枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，以求降低生产成本，提高发酵产物α-淀粉酶活力。 1.5.2 研究目的

α-淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。它占了整个酶制剂市场份额的25%左右。本课题的研究工作目的是探讨在液体培养条件下培养基组成对发酵产物α-淀粉酶活性的影响，力求寻找实验室内保存的枯草芽孢杆菌菌种的最优液体发酵培养基，以提高α-淀粉酶活力，从而为工业大规模生产中降低生产成本，提高产量，获得较高的经济效益提供有力的实验依据[12]。

9

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

2 研究内容

2.1 材料与方法

2.1.1 菌种

产α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），实验室内保存。 2.1.2 培养基

(1) 固体斜面培养基：牛肉膏1g、蛋白胨1g、NaCl 0.5g、可溶性淀粉0.5g、琼脂2g，加水到100mL，调节pH至7.0。

(2) 液体种子培养基：牛肉膏1g、蛋白胨1g、NaCl 0.5g、可溶性淀粉0.5g，加水到100mL，调节pH至7.0。

(3) 初始液体发酵培养基：玉米粉5g、豆饼粉4g、磷酸氢二钠0.8g、硫酸铵0.4g、无水氯化钙0.2g，加水到100mL，调节pH至7.0。

(4) 最优液体发酵培养基：蔗糖3%、蛋白胨6%、磷酸氢二钾0.8%、硫酸铵0.4%、无水氯化钙0.2%，pH 7.0。 2.1.3 主要试剂

无水磷酸氢二钠（分析纯，广州鑫镁化工公司）；氯化钠（分析纯，天津化学试剂厂）；苯酸钾（分析纯， 天津化学试剂厂）；碘酸钾（分析纯，天津化学试剂厂）；碘化钾（分析纯，天津化学试剂厂）；硫酸（分析纯，天津化学试剂厂）；结晶紫（分析纯，北京华美生科生物技术有限公司）；95%乙醇（化学纯，天津化学试剂厂）

(1) 基质缓冲液：取无水磷酸氢二钠26.6g、氯化钠1.75g、苯酸钾8.6g、蒸馏水500ml置2000ml烧杯中，加热至沸。先将可溶性淀粉0.4g和冷蒸馏水10ml搅成混悬液，然后将其缓缓倾入已加热的试剂中，边搅边加。再加热至沸1min。待冷却至室温，加蒸馏水1000ml，调节pH至7.0。

(2) 5mol/L碘液：取碘酸钾0.3567g、碘化钾4.5g，蒸馏水800ml搅拌均匀后，缓缓滴加，边搅边加入12mol/L浓硫酸0.9ml。混匀后加蒸馏水至1000ml。配置好的溶液保存在琥珀色瓶中。

(3) 结晶紫染色液：结晶紫1g、95%乙醇20ml、1%草酸铵水溶液80ml，将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 2.1.4 主要仪器

LDZX-75KBS立式电热压力蒸汽灭菌锅（四川省新德医疗器械有限公司） SHJ系列洁净工作台（上海民仪电子有限公司） LRH系列控温生化培养箱（杭州中拓仪器有限公司）

10

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

FA1004B电子天平（西安超杰生物科技有限公司） KDC-16H高速离心机（广州倍玛特科学仪器有限公司） HZS-H水浴振荡锅（郑州杜甫仪器厂）

台式M295356低速离心机（北京市中西远大科技有限公司） T6新世界紫外可见分光光度计（北京华洋仪器厂） 电子显微镜（成都启跃光电仪器有限公司） 2.1.5 分析测定方法

（一）试验方法

(1) 菌种浓度的确定：选取培养至一定时期的菌液，采用光电比浊计数法，测定菌液的吸光度，以吸光度的大小判断菌种的浓度。

(2) 菌种最佳发酵周期的确定：选取培养至一定时期的发酵液测定发酵产物α-淀粉酶的活力。

(3) 菌种活化培养：斜面试管接种后，将其置于控温生化培养箱内，37℃下培养24小时。

(4) 种子培养：摇床转数为120r/min，种子液摇床培养温度为37℃，装液量为种子液50mL/100mL。

(5) 发酵培养：摇床转数为180r/min，发酵液摇床培养温度为37℃，装液量为发酵液50mL/100mL，接种量为8%。

（二）分析方法

(1) 菌种对数生长期的确定：取培养至一定时间的种子培养液，低速离心除去样品中的少量基质后在660nm处测定其吸光度，以吸光度的大小来判断菌液的浓度，从而断定菌种达到对数生长期的培养时间，或可将菌液用结晶紫染色液染色后，通过在电子显微镜下观察菌种的形态来断定对数长期。

(2) α-淀粉酶活力的测定：取发酵液10mL，7000r/min离心10分钟。取0.1ml的上清液到100ml的锥形瓶中，再加入5ml的基质缓冲液，混匀后于37℃水浴锅中静置反应7.5分钟。取出后加入5ml的5 mmol/L碘液与40ml蒸馏水，混匀后以蒸馏水校零点在660nm处测定吸光度，从而可测得淀粉酶活力（即碘淀粉比色法

[13]

）。酶活力单位的定义为：37℃

下，30min水解10mg淀粉所需要的酶量为1个酶活力单位（u/L）。

淀粉酶活力单位（u/L）=（空白吸光度-测定吸光度）/空白吸光度×8000 （三）单因素实验

在基本培养基中去掉所有的碳源或氮源再分别加入某单一碳、氮源[14]，通过对发酵水平的测定，考察这两个因素对α-淀粉酶活力的影响，从而确定最优的碳、氮源。实验测定后确定这两个因素分别为蔗糖、蛋白胨。

（四）预备试验

11

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

在初始液体发酵培养基的基础上，分别选取蔗糖、蛋白胨为唯一碳、氮源，设计新的含量配比，测定α-淀粉酶活力，从而获得一个粗略的发酵培养基含量组成。

（五）响应面法实验设计

在单因素实验的基础上，根据预备试验确定上下水平后，按二元二次正交旋转组合的设计表确定各试验组的编码与取值[15] 选取蔗糖、蛋白胨为实验因素，其水平编码表见表2-1

表2-1 响应面分析试验因素水平表

Table 1 Test-factor response surface analysis of the level of table

水平（%）

因素 蔗糖 蛋白胨

-1 -0.5 0 0.5 1 2 5

2.5 5.5

3 6

3.5 6.5

4 7

（六）实验流程

菌种活化 ↓

菌种对数生长期的确定

↓

菌种最佳发酵周期的确定

↓

发酵培养基中最佳碳源的确定

↓

发酵培养基中最佳氮源的确定

↓ 预备试验 ↓

响应面法确定最佳浓度配比

↓ 验证试验

2.2 结果与分析

2.2.1 菌种对数生长期的确定

将实验室中冷冻保藏的枯草芽孢杆菌菌种活化后在液体种子培养基中摇瓶培养。分

12

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

别在培养至第4、5、6、7、8、9、10、11、12小时的菌液中取样，并在660nm处测定其吸光度，以菌液的浓度确定菌种达到对数生长期所需的培养时间[16]。由图2-1可以看出，第4个实验号吸光度数值最大，即菌种培养至大约第7小时可达到对数生长期。

菌液OD值0.1000.080OD值0.0600.0400.0200.000024实验号6810

图2-1 菌种对数生长期的确定

Fig.2- 1 Strains to determine the logarithmic phase

注：实验号1-9分别代表培养至第4-12时小的菌液

2.2.2 菌种最佳发酵周期的确定

将培养至对数生长期的种子液以8%的接种量接种到初始液体发酵培养基中进行培养。分别在培养至第12、14、16、18、20、22、24、26、28小时的发酵液中取样，用碘淀粉比色法测定发酵产物α-淀粉酶的活力，以淀粉酶活力的大小确定最佳发酵周期。由图2-2可以看出，第7个实验号数值最大，即发酵培养到大约第24小时时α-淀粉酶活力最大。

图2-2 菌种最佳发酵周期的确定

Fig.2-2 Strains to determine the best fermentation cycle

注：实验号1-9分别代表发酵培养至12、14、16、18、20、22、24、26、28小时的菌液

13

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

2.2.3 单因素实验结果

碳源是培养基的最主要成分，是菌体的骨架，用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物[17] ，又是一种双功能的营养物，可为微生物提供新陈代谢所需能源。

从图2-3可以看出，液体发酵培养基在分别以蔗糖、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米粉为唯一碳源时对发酵产物α-淀粉酶活力的影响。其中第4个实验号数值最大，即以蔗糖为碳源时，淀粉酶活力最大，可达到295.60u/L。其次是乳糖，淀粉酶活力为251.71u/L。

.

图2-3 不同碳源对α-淀粉酶活力的影响

Fig. 3 different carbon sources on α-amylase activity

注：实验号1-5分别代表玉米粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉

氮源主要用于构成菌丝体细胞物质和含氮的目的产物。有机氮源中除含有丰富的蛋白质﹑多肽﹑氨基酸外，往往还含有少量脂肪﹑糖类﹑维生素以及某些生长因子，因而微生物在含有有机氮源的培养基中表现为生长旺盛，菌体浓度增长迅速，代谢产物积累丰富等特点。

在以蔗糖为唯一碳源，其它条件不变的前提下，从图4可以看出液体发酵培养基在分别以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸钾、豆粉为唯一碳源时对α-淀粉酶活力的影响。其中第1个实验号数值最大，即以蛋白胨为氮源时，淀粉酶活力最大，可达到258.5u/L。在以其它元素为氮源时，淀粉酶活力相对较低。

14

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

图2-4 不同氮源对α-淀粉酶活力的影响

Fig.2-4 Effects of different nitrogen sources on α-amylase activity

注：实验号1-5分别代表蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸钾、豆粉

2.2.4 预备试验设计及结果

以初始液体发酵培养基各组分的含量为基础，设计新的碳、氮源配比（其中，碳源为蔗糖，氮源为蛋白胨），以α-淀粉酶活力为检测水平，为响应面实验作准备。预备试验方案与结果如下表格。

表2-2 预备试验方案与结果

Table 2 with the results of a pilot program to prepare

蔗糖（%）

3 3 3 5 5 5 7 7 7

蛋白胨（%）

2 4 6 2 4 6 2 4 6

酶活力（u/L）

279.33 343.24 390.59 111.73 155.87 256.42 245.81 246.37 201.12

从表2可以大致推断，当蔗糖、蛋白胨的含量分别在3g、6g这一配比的小范围内α-淀粉酶的活力可以达到最大值，可以此含量为基础来确定响应面实验各因素水平。 2.2.5 响应面法实验设计结果

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理[18]，进一步进行二因素五水平的响应面

15

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

分析实验，结合表2-1响应面分析实验因素水平表可规划15个实验点，其给出的实验结果如表2-3所示。15个实验点可以分为两类，其一是析因点，自变量取值-1、-0.5、0、0.5、1，实验共有12个析因点（实验1至12号）；其二是零点，为区域的中心点，零点试验重复3次13至15号），用以估计试验误差。

表2-3 实验方案与结果

Table2-3 Experimental program and results

实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

蔗糖（%） -0.5 -0.5 0.5 0.5 -1 1 0 0 1 1 -1 -1 0 0 0

蛋白胨（%）

-0.5 0.5 -0.5 0.5 0 0 -1 1 1 -1 -1 1 0 0 0

淀粉酶活力 (u/L)

223．41 257．31 287．13 246．78 170．18 146．78 123．40 321．05 327．49 260．00 274．27 280．00 392．20 390．80 389．82

2.2.6 数据分析

以α-淀粉酶活力为响应值，根据表2-3的实验结果，用SAS统计分析软件景象多元回归分析[19]，得到的主要分析结果见表2-4。

从方差分析表（表2-4）中可以看出，方程一次项、二次项的影响都是显著的，交互项作用影响不显著，故交互项可以省略，也可以看出各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。经回归拟合后，实验因子对响应值的影响可用回归方程表示为： - 70.94997*X2*X2

16

Y1 = 358.1999 - 9.961273*X1 + 81.96157*X2 - 152.8002*X1*X1 - 93.45*X1*X2

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化 表2-4 回归方程偏回归系数的估计值

Table 4 The regression equation of the partial regression coefficient estimates

大于|t|的

参数 x1 x2 x1*x1 x2*x1 x2*x2

Root MSE R-square

自由度 1 1 1 1 1

参数估计 -9.961273 81.961572 -152.8002 -93.4500 -70.94997

标准误 22.97229 22.97229 24.63506 32.48770 24.63506

t值

概率

-0.43362 3.567845 -6.20255 -2.87647 -2.88004

0.677613 0.009130 0.000444 0.023771 0.023650

离回归偏差 决定系数

64.97541 0.9014

从表2-4中可以看出，用上述回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量和自变量之间的线性关系是显著的，决定系数为90.14%，说明回归方程的拟合程度较好，总回归达到显著。表明蔗糖和蛋白胨两个培养基组分与对发酵产物α-淀粉酶活力总的来说存在显著的回归关系。表明改变蔗糖和蛋白胨用量对α-淀粉酶活力的影响是显著的。

2.2.7 采用岭脊分析寻求蔗糖与蛋白胨的最佳配比

对全变量的二次回归模型进行规范分析，考察所拟合出的响应曲面的形状。获得的响应面立体图如图2-5所示。

图2-5 响应面立体分析图和相应的等高线图

Figure 2-5 Three-dimensional analysis of response surface and corresponding contour map

利用SAS软件进行岭脊分析[20]（也可以通过求偏导解出最佳值），对这两个显著因素进行寻优，通过岭脊分析后，得出回归模型存在最大值点，即采用岭脊分析寻求蔗糖与蛋白胨的最佳配比时的α-淀粉酶活性为391.66u/L。从而可得优化后的培养基中各因素

17

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

的取值分别为：蔗糖为3%、蛋白胨为6%、磷酸氢二钾为8%、硫酸铵为4%、无水氯化钙为2%。 2.2.8 验证试验

在以上优化条件:蔗糖为3%、蛋白胨为6%、磷酸氢二钾为8%、硫酸铵为4%、无水氯化钙为2%进行验证试验，共进行3批次250ml摇瓶试验并测定α-淀粉酶活性的平均值为408.89u/L。证明采用岭脊分析寻求蔗糖与蛋白胨的最佳配比时预测值391.66u/L与试验平均值408.89u/L是非常接近的。

18

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

3 结 论

工业上用于生产α-淀粉酶常采用的菌株是枯草芽孢杆菌，而其发酵方法也可以分为固体发酵和液体深层发酵。本课题采用液体摇瓶发酵，主要从培养基优化这一方面，选取应用广泛而又节约时间和资源的响应面分析法来研究α-淀粉酶的发酵生产。

通过对本课题的研究可以得出以下结论：

（1） 培养基组成对淀粉酶活力的影响：通过单因素实验可以得出，枯草芽孢杆菌液体发酵培养基在以蔗糖为单一碳源，蛋白胨为单一氮源时，发酵产物α-淀粉酶活力最大； （2） 培养基成分含量对淀粉酶活力的影响：通过响应面分析得出，本实验所用的枯草芽孢杆菌菌株的最佳液体发酵培养基组成为蔗糖为3%、蛋白胨为6%、磷酸氢二钾为8%、硫酸铵为4%、无水氯化钙为2%；pH为7.0；

（3） 通过验证试验可以确定，对培养基组分进行优化后，可以明显提高淀粉酶的活力，并基本上能够达到预计的酶活力水平。

19

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

参考文献

[1] 王星云，宋卡魏，张荣意.枯草芽孢杆菌菌剂的开发应用[J].广西热带农业，1997，13(4):34-56. [2] 刘志恒. 现代微生物学[M]. 北京:科学出版社，2002 :92 - 99.

[3] 惠明， 窦丽娜， 田青， 侯银臣枯草芽孢杆菌的应用研究进展 安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci. 2008 ，36 (27) :11623 - 11624 ，11627

[4] 刘春莉，张文学，杨瑞.α-淀粉酶的应用研究现状和前景展望[J].四川大学学报，2002，

12(3):65-74.

[5] 孙晓菲，李爱江.α-淀粉酶的应用及研究现状[J].河南科技大学学报，2000，36(8):81-87. [6] 张树政.酶制剂工业[M].北京:科学出版社，1984:625-634.

[7] 仇丽.枯草芽孢杆菌在养殖中的应用[J].江苏大学学报，2003，26(4):22-27. [8] 褚以文.微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件[J].国外医药抗生素分册.1999，

20(2):58-61.

[9]慕运动.响应面方法及其在食品工业中的应用[J].郑州工程学院学报，2001，22(3):91-94. [10] 欧宏宇，贾士儒.SAS软件在微生物培养条件优化中的应用[J].天津轻工学院学报，2005，

23(1):14-27.

[11] Thompson D R.Response surface experimentation[M].Food Industry Press.1982，

16(6):155-158.

[12] 陈坚，李延.发酵过程优化与实践[M].北京:北京化学工业出版社，2002.

[13] 冯华，史鹏飞，左瑞雨，郑秋红，尹清强.枯草杆菌分泌淀粉酶的变化规律及酶学特征[J].河

南农业大学报，2003，12(1):65-70.

[14] 张祝华，李岚，袁瑞.单因素实验的应用[J].山西农业大学学报，1998，12(3):36-47. [15] 严冲，王世凯.SAS软件的应用[J].杭州:浙江大学出版社，1994， 11(12):110-112. [16] 刘亚萍，方民，徐孝华.普通微生物学.北京:北京农业大学出版社，1992:147-178. [17] 赫林，王启南，冯安瑞.食品微生物实验技术[M].北京:中国农业出版社，2001. [18] 赵燕，孙佳平，俞渭江.生物统计附实验设计[M].北京:农业出版社，1999. [19] 高惠璇.SAS/STAT软件使用手册[M].北京:中国统计出版社，1997，30(3):18-22． [20] 吴有炜.试验设计与数据处理[M].苏州:苏州大学出版社，2002，10(3):30-39.

20

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

致谢

首先，我要感谢的是我的指导老师李入林。李老师平日里工作繁多，但在我做毕业论文的每个阶段，都给予我悉心的鼓励和支持。可以说，没有李老师的指导，我是不可能顺利完成我的这个课题的。当初李老师分给我的课题是年产六万吨精馏塔的设计，后来发现自己化工知识相对薄弱，毕竟学的是生物工程专业做化工设计还是很费劲的。我把决定自己选课题做的想法告诉李老师，李老师对我的想法很是支持和鼓励的。另外，他的治学严谨和科学研究的精神也是我永远学习的榜样，并将积极影响我今后的学习和工作。从课题的选择到最终毕业论文的定稿，李老师都始终给予我悉心不懈的支持。两年多来，李老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想上给我以启迪，李老师教书育人的热情和工作作风都深深感染着我。在此谨向李老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。 其次，我要感谢我的父母，感谢他们的养育之恩，没有他们就没有我这二十几年的成长更没有今后的发展，我将用自己的一生去回报。

再次，我要感谢张荣华和曾琼靓同学，在我毕业论文期间，他们对本课题作了不少工作，并给了我不少的关心和帮助。特别是在论文数据处理过程中和他们进行了深刻的探讨交流。

最后，感谢校方给予我这两年的学习机会，能够独立地完成一个课题，并在这个过程当中，给予我各种查阅资料、学习和实践的方便，使我们在离校的后能够更多更好的学习一些实践应用知识，增强了我们实践操作和动手应用能力，提高了独立思考的能力。再一次对我的母校表示感谢。 总之，感谢每一位关心过我，爱护过我的人。滴水之恩，当涌泉相报。最后，再次感谢我的导师李入琳教授。

经过半学期的忙碌，本次毕业论文已经接近尾声，在此，我要感谢每一个帮助过我的人。

21

产淀粉酶的枯草芽孢杆菌培养基的优化

附录

（一）单因素试验(One Variable at a Time)法

实验室最常用的优化策略是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。单因素试验法是以因素间没有交互作用为前提，而对于大多数培养基而言，其中包含多种复杂的成分，这种试验方法往往达不到预期效果。当考察的因素较多时，需要较多的试验次数和较长的试验周期。因此，单素试验经常被用在正交试验之前或与均匀设计、响应面分析等结合使用。利用单因子试验和正交验相结合的方法，可以用较少的试验找出各因素之间的相互关系，从而较快地确定出培养基的最佳组合，比较常见的是先通过单因素试验确定最佳碳、氮源，再进行正交试验；或者通过单因素试验直接确定最佳碳氮比，再进行正交试验。

（二）二次回归正交旋转组合(Rotation-regre ssion-or-thofonal combination)法 在正交设计试验法的基础上，加入组合设计和旋转设计的思想，并与回归分析方法有机结合，建立了二次回归正交旋转组合设计法。它是旋转设计的一种，不仅基本保留了回归正交设计的优点，还能根据测量值直接寻求最优区域，适用于分析参试因子的交互作用。它既能分析各因子的影响，又能建立定量的数学模型，属更高层的试验设计技术。基本思路是利用回归设计安排试验，对试验结果用方程拟合，得到数学模型，利用计算机对模型进行图形模拟或数学模拟，求得模型的最优解和相应的培养基配方，并在一定范围内预估出在最佳方案时的产量。与响应面法有相似之处。

（三）响应面优化设计(Re sponse surface optimization design)法

响应面优化设计法是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，是数学方法和统计方法结合的产物，它可以用来对人们感兴趣的受多个变量影响的响应问题进行建模与分析，并可以将该响应进行优化。它能拟合因素与响应间的全局函数关系，有助于快速建模，缩短优化时间和提高应用可信度。一般可以通过Box-Benhnken的中心组合实验设计从众多因素中精确估计有主效应的因素，节省实验工作量。响应面分析法以回归法作为函数估算的工具，将多因子试验中因子与试验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与试验结果(响应值) 的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，并进行优化。常用SAS软件作为辅助工具。

22

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/za7p.html