超氧化物歧化酶SOD的分离纯化实验报告

超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术

证明SOD提取过程工艺不同浓度的硫酸铵对纯化SOD蛋白酶的效果

的综合影响

一、摘要：

通过对绿豆的研磨破碎获得SOD粗酶，经过(NH4)2SO4分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶中的杂质及干扰蛋白。

二、关键词：

SOD 连苯三酚自氧化法 SOD酶活性测量 透析除盐

三、前言：

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果。本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

四、实验技术路线：

我们的这次试验主要的路线是通过测定经过不同浓度的硫酸铵分离出来的不同的SOD蛋白的上清和沉淀，以此来确定硫酸铵沉淀SOD酶和其他杂蛋白的一个大致区间。经过40%的硫酸铵和50%的硫酸铵作用过后的提取液，得到40%的上清和沉淀，50%的上清和沉淀。然后分别测定这4份样品的SOD酶活力，来推理出硫酸铵沉淀区间。

五、材料和试剂：

绿豆（实验使用前需先用蒸馏水浸泡20h）；连苯三酚（使用时需先稀释5倍）；硫酸铵（粉末）；Tris-HCL缓冲液；蒸馏水。

六、仪器：匀浆机；低温离心机；分光光度计；移液枪；500ml量筒；纱布；烧杯和试管若干。

七、实验步骤：

1、取30g绿豆，并加入300ml蒸馏水，用匀浆机匀浆。

2、匀浆出来的豆液用二层纱布过滤，离心（5℃，3000rpm / 8min）取上清液，取1ml上清液测量其总活性（用连苯三酚自氧化测SOD活性法），其余量取150ml分装成两支各75ml。

3、其中一支加入40% (NH4)2SO4（16.95g），标记为A；另一支加入50% (NH4)2SO4（21.82g），标记为B。置于5℃冰箱保存。

4、3h后将A、B两液取出，离心（5℃，3000rpm / 8min）后取得上清液和沉淀，分别装到4个透析袋中，透析20h以上。

5、透析完毕后，取出，分别测量4种液体的活性（用连苯三酚自氧化测SOD活性法）。

测酶活力的操作：

25?C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL ，加入10 ?l 50 mmol/L 连苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０Ｓ测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（△Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（△Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的△Ａ’在0.035/min左右。 一个SOD活性单位（连苯三酚单位）：在以上条件下，加入酶如果在一分钟时间能抑制连苯三酚自氧化速率的一半，此时所加的酶量就为一个SOD的酶活性单位（unit）。

数据处理：

酶活力计算公式：

加入酶量相当的酶活力单位（unit）＝(△Ａ-△Ａ’)/ △Ａ×２ 提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=(△Ａ-△Ａ’)/ △Ａ×２×(反应液总体积/取样液体积）

八、实验数据记录：

表1 总活性 试剂 连苯三酚 用量 15μL 20μL 25μL 30μL 28μL 27μL 0'' 0.009 -0.006 0.026 0.020 0.012 0.012 0.065 30'' 0.032 0.008 0.052 0.053 0.054 0.054 0.105 离心所得上清液

表2 4支各活性

50μL 45μL 40μL 0.057 0.075 0.044 0.072 0.093 0.064 0.083 0.108 0.081 0.026 0.033 0.037 60'' 0.050 0.032 0.077 0.086 0.094 0.090 0.140 60''差值 0.041 0.038 0.051 0.066 0.082 0.078 0.075 备注 选取这个连苯三酚用量 试剂 连苯三酚 用量 27μL 27μL 0'' 0.035 0.010 30'' 0.078 0.049 60'' 0.121 0.084 60''差值 0.086 0.074 操作有失误 选取这个连苯三酚用量 操作有失误 计算活力 取平均值 计算活力 取平均值 操作有失误 计算活力 取平均值 计算活力 取平均值 40%沉淀 200μL 100μL 80μL 75μL 60μL 50μL 40μL 30μL 35μL 35μL 0.210 0.083 0.079 0.069 0.070 0.056 0.043 0.029 0.031 0.038 0.016 0.020 0.020 0.053 0.042 0.052 0.010 0.022 0.014 0.019 0.021 0.044 0.009 0.028 0.010 0.217 0.098 0.094 0.084 0.084 0.073 0.060 0.043 0.052 0.056 0.033 0.040 0.042 0.069 0.060 0.072 0.040 0.033 0.030 0.037 0.036 0.061 0.024 0.048 0.028 0.223 0.110 0.107 0.097 0.100 0.087 0.076 0.056 0.070 0.072 0.048 0.056 0.060 0.083 0.078 0.091 0.067 0.043 0.045 0.054 0.050 0.077 0.038 0.064 0.044 0.013 0.027 0.028 0.028 0.030 0.031 0.033 0.027 0.039 0.036 0.032 0.036 0.040 0.030 0.036 0.039 0.057 0.021 0.031 0.035 0.029 0.033 0.029 0.036 0.034 40%上清液 30μL 25μL 25μL 50%沉淀 30μL 30μL 30μL 50%上清液 20μL 60μL 45μL 40μL 37μL 35μL 30μL 30μL 计算结果：

其中，样品总量是150ml，40%上清50ml，40%沉淀定容到51ml，50%上清50ml，50%沉淀定容到51ml。

总活力：加入酶量相当的酶活力单位（unit）=1.12 提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=3906.97

40%沉淀：加入酶量相当的酶活力单位（unit）=0.98 提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=1409.266

40%上清：加入酶量相当的酶活力单位（unit）=0.97 提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=1984.86

50%沉淀：加入酶量相当的酶活力单位（unit）=0.98 提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=1644.14

50%上清：加入酶量相当的酶活力单位（unit）=1.05 提取液的总活力（或材料总活力）（unit）=1791.89

讨论与结论：经过计算，各个上清与沉淀的提取液的总活力（或材料总活力）的总和是6830.16，这个数值远远大于总活力中提取液的总活力（或材料总活力）的3906.97这个值，经过我们全体组员的认真讨论和查阅资料，我们怀疑是在透析那一步的硫酸铵没有透析干净，由于硫酸铵也会对连苯三酚的自氧化产生抑制作用（与SOD对连苯三酚的效果差不多），导致对实验结果产生了严重的影响。

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