痰涂片镜检实验室质量保证手册

痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册

编制：汪平帮

审核：李志波

批准：李志波

2012-04-01

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浏阳市人民医院 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：2.0 第 1 页 共 32 页 医学检验中心

01.目 录 序号 主 题 内 容 页 码 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 术语注释 绪论 目的和任务 实验室网络及职能 痰涂片的意义 分枝杆菌的形态和结构 检查对象 涂片抗酸染色检查方法 痰涂片实验室质量保证 室内质量控制 室间质量评估 分支杆菌分离培养标准操作程序 2 4 5 5 6 7 8 11 18 18 21 28

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 1 页 共 32 页 02.修 订 页

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质量保证（Quality Ass u rance ，QA ）是能持续提高实验室服务效率和可信度的体系，包括室内质量控制、室间质量评估和质量提高。 质量控制（Quality Control ，QC ）也称室内质量控制。包括结核病痰涂片操作镜检实验室质量控制的所有方法，如仪器和染色液的检查等。

室间质量保证（External Quality Assessment ，EQA）是根据与其他网络实验室（中间级实验室和中心实验室）比较批量检测和盲法复检结果评价基层实验室能力的过程。EQA包括实验室现场评估以评价操作质量并且也包括现场对涂片的复读。EQA是IUATLD 描述的熟练度检测的扩大。

质量提高（Quality Improvement ，QI）是通过分析痰涂片镜检诊断服务的各组成部分，寻找能永久清除障碍成功的过程。数据收集、分析、创意思路都是这一过程的重要部分。它涵盖了连续监测、明确缺陷及后续改正措施，如必要时重新培训以杜绝问题再次发生。QI常依赖于有效的现场评估访视。

现场评价（On-site evaluation）国家或地区结核病规划下的地区督导员的常规对下级实验室的督导检查和高水平实验室督导员的年度督导检查。

批量检测（Panel Testing ）把已染色和/ 或未染色涂片从中心或国家参比实验室送到外围或中间级实验室以检查读片和报告的过程。批量检测和世界卫生组织定义的熟练度检测是等同的。

盲法复检（Blinded-Rechecking） 把涂片从外围实验室送到参比实

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 3 页 共 32 页 验室（中间级或中心实验室）再次读片。指南推荐采用盲法复查，确保控制方事先不知道外围实验室的检查结果。其他文件中，这也被称做复读。

涂片阳性率（Slide positivity rate ，SPR ）在一定时间内一个实验室所有受检涂片（诊断或监测涂片）中阳性涂片的比例。

高假阳性（High False Positive ，HFP ）阴性片被错误地判读为 2 ＋～4 ＋阳性。

高假阴性（High False Negative ，HFN）2＋～4 ＋阳性涂片被错误地判读为阴性。

量化误差（Quantification Error ，QE）同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。

低假阳性（Low False Positive ，LFP ）阴性涂片被错误地判断为低阳性（1 ＋以下）。

低假阴性（Low False Negative ，LFN） 低阳性（1＋以下）涂片被错误地判断为阴性。

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为了进一步加强结核病控制工作，实现全国结核病防治规划目标，加强直接面视下短程化疗的技术策略和结核病细菌学实验室质量控制，提高肺结核病人的发现率，通过实验室细菌学诊断传染性肺结核是实施DOTS 策略的一个关键，而且对结核病控制项目的成功起着重要的影响作用。因此，在执行国家结核病防治规划中必须具备有效的结核病实验室网络。一个可信的实验室必须符合成本- 效益原则，并且提供准确的实验结果，为此只有通过质量保证（Quality Assurance ，QA）才能实现。结核病实验室质量保证的一个重要组成部分就是室间质量评估（External Quality Assurance ，EQA），即由上级参比实验室通过一系列的规范性活动来监督，不断完善实验室的质量保证程序，其质量保证有赖于国家结核病控制规划对各级实验室检查工作的支持、培训和监督，并逐步完善与国际接轨的质量保证管理系统。

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 5 页 共 32 页 第一节 目的和任务

在结核病控制工作中痰结核菌检查对发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。因此，结核病细菌检查是国家结核病控制规划（NTP ）的重要组成部分，在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用。

第二节 实验室网络及职能

1. 做好本实验室痰涂片镜检和室内质控工作，接受上一级参比室定期室间质量保证督导。

2. 承担同级间实验室（县级）初次复验者盲法复检工作。

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第二章 痰涂片检查

第一节 痰涂片的意义

在当前国家结核病控制措施的框架下，抗酸杆菌（acid-fast bacilli，AFB ）镜检的目的是：

一、传染性结核病的诊断指标：目前，控制结核病流行以发现和控制传染源为主。现在认为，痰涂片AFB 阳性的肺结核患者是传染源，对未经细菌检查证实的肺结核患者成为“可疑肺结核患者”；故痰涂片 AFB 镜检结构对诊断传染性肺结核是一项重要指标。

二、评价传染性结核病的化疗效果：由于目前结核病的药物化疗方案，其原理主要是根据结核分枝杆菌的生物学特征而制定的，所以对化疗效果的评价，也必须以AFB 细菌学检查结果作为根据。

三、为结核病疫情的流行病学统计服务：由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此，在反映某一国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患者率、涂阳发病率被更多关注。根据世界卫生组织（WHO）和国际防痨及肺部疾病联合会（IUATLD ）针对低收入且结核病疫情严重的发展中国家所制定的技术指南，痰涂片AFB 镜检是相应国家开展结核病控制项目时，非常符合成本效益原则的细菌实验技术，相对于临床和实验室经常采用的其它诊断和检查项目，高质量的AFB 镜检方法有其特有的优势：

1. 作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X 线的准确性高； 2. 作为实验方法，技术相对简单，容易标准化和完成操作‘

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 7 页 共 32 页 3. 建立AFB 检查时所需设备投入少； 4. 检查成本低，易于接受；

5. 从受到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要； 6. 对菌阳患者的治疗效果，能够作为及时和准确的评价。

第二节 分枝杆菌的形态和结构

一、分枝杆菌的形态

当患者标本直接进行涂片镜检时，能够发现不同的分枝杆菌形态变化较多。结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度 0.3～0.6μm ；菌体长度不一，在 0.5～8μm 之间，多数在1.5～3.5μm ；少数菌体较长者可呈螺旋状；染色良好的结核分枝杆菌菌体内，能够发现着色较深的异染颗粒，含结核分枝杆菌较多的新鲜标本经萋尔-尼尔逊染色（Ziehl-Neelson ，Z-N ，简称萋-尼氏染色），100×油镜观察，能够发现单个存在的细菌、也能看到聚集成簇或分枝状排列的细菌，多数非结核分枝杆菌（non-tuberculosis mycobacteria，NTM）的形态较结核分枝杆菌短且粗，呈棒状、短棒状甚至颗粒状。培养生长的菌落经生理盐水研磨、悬浮物稀释后涂片镜检，结核分枝杆菌的形态较标本直接涂片的稍短且粗，常聚集而形成“索状”；经培养的 NTM菌体形态与临床标本中的比较变化不大、且较少聚集。 二、结核分枝杆菌的结构

分枝杆菌由于细胞结构和细胞成分的特殊性，具有经碱性染料染色后，能够耐受酸性介质脱色的特征，具备相应染色特征的细菌习惯上被称为抗酸菌（acid-fast bacillus，AFB ）。目前，除结核分枝杆菌以外（临床上最为常见的分枝杆菌），发现的分枝杆菌种类已达100

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 8 页 共 32 页 余种。当然，除分枝杆菌以外，还有少数细菌具有抗酸染色的特征。AFB 菌体细胞结构的完整性与其抗酸染色特性有着密切联系。通过电子显微镜观察分枝杆菌，完整的细胞结构主要有以下部分组成： （一）细胞壁：分内、中、外三层；外层细胞壁的主要成分－分枝菌酸，是造成分枝杆菌细胞抗酸染色特性的主要成分，中层细胞壁的只要成分有肽脂糖和磷脂蛋白，内层细胞壁的主要成分是多糖体，分枝杆菌细胞壁的组分和结构的完整性，对相应细菌的抗酸染色特性起到 关键作用。

（二）细胞膜：主要由脂蛋白组成。部分细胞膜通过折叠、卷曲，能够形成层状结构被称为中介体（或间体）的细胞器。 （三）细胞质：本身致密性交叉。

（四）核区：因遗传物质DNA和参与表达的RNA较密集而成。 （五）细胞器：有主要成分为甘油三酯、抗酸染色的能力较差的脂质空泡，和主要成分是聚磷酸盐、具有较强的抗酸脱色性的异染小体（异染颗粒）等。

第三节 检查对象

根据《国家结核病防治规划指南》的有关规定，检查对象根据检查目的分为两类：

一、确定诊断：凡因结核病症状求诊及转诊的可疑结核患者，均应进行直接涂片检查。一般包括持续咳嗽、咳痰超过3 周；咯血或伴有血痰；发热或胸痛超过2 周；胸部X 线异常。确定诊断的涂片检查应采集 3 个合格的痰标本。就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，

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二、疗效评价：凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰：

（一）初次涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3 个月和继续结束时，复治涂阳患者在疗程强化期末、继续期满3 个月和继续期结束时，各查一次晨痰。

（二）初、复治涂阳患者在疗程强化期接受时，痰菌仍为阳性者，应在1 个月时增加晨痰检查一次；若复治涂阳患者治疗满 3 个月时痰菌仍阳性，应在治疗满 5 个月增加晨痰检查一次。

（三）确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满 2和6 个月时进行痰菌检查。 第四节 痰标本的采集 一、标本采集：

（一）用于采集标本的容器：采用 WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶（见图 2 ），或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4cm ，高 2cm ）。痰容器上应标明病人的姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目、容器序号1、2 、3 （1 ＝当日即时痰，2 ＝夜间痰，3 ＝次日晨痰）。 （二）标本的性状：

合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。 1 、干酪痰：标本外观以黄色（或奶酪色）脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可见大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。由于此类标本是由肺部深处

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 10 页 共 32 页 咳出，对肺结核的诊断最有价值，故AFB 的检出率较高。 2 、血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝；涂片染色后镜检除能够观察到粘液痰或干酪痰的细胞特征外，含新鲜血液的标本中还可见到被染色的红细胞。由于含血标本易干扰AFB 镜检的结果，故在制片时 应尽量避免挑取含血标本。

3 、粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞（细胞较长且形态不规则、细胞核和细胞质着色均较深，细胞一端可见着色较浅的纤毛），伴有少量肺上皮脱落细胞（多 数为圆形，细胞核较小，且着色较细胞质深，核质比＞1:3）、脓性炎症细胞（卵圆形、细胞核占细胞比例较大且着色较深，核质比＜1:1）、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB 检出率较唾液高。 4 、唾液：目视观察标本外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞（形态不规则、细胞核 着色较细胞质深，核质比接近或＞1:2）和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标 本进行AFB 检查时的检出率很低，用于患者确定诊断时是不合格的标本。

（三）标本采集：

根据痰标本采集的时间，可将标本分为三类： 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液。

晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2 口、第3 口痰液。 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液。

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 11 页 共 32 页 进行AFB 检查的医疗机构应提供符合要求的标本收集容器，医务人员在容器上应注明患者姓名、编号（门诊序号或登记号）、检查项目、痰标本序号，然后交给患者。对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料。（注意：由于当患者咳嗽、咳痰时，易于产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。） 患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量（特别是用于初次诊断的痰标本）：标本量一般在3～5ml ，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应予以进一步指导并要求其重新送检。进行细菌学检查时，应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。

第五节 涂片抗酸染色检查方法

抗酸染色的基本原理：抗酸菌具有耐受酸性介质脱色的生物性状，此类细菌在石炭酸（苯酚）的协同作用下，被复红染色剂着色，能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持紫红色；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝色。

一、玻片的制备：

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 12 页 共 32 页 （一）用于AFB 检查的载玻片要求： 1. 一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。

2. 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于 AFB 涂片检查；

3. 应使用以95% 乙醇擦拭（浸泡）脱脂，经干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片制备涂片，在玻片背面一端的 1/3 处注明实验室序号及标本序号（如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用 2B铅笔在磨砂面上直接书写）。

（二）制备涂片：小心打开留取痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢（最好在超净工作台中操作）。仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05 ～0.1ml，于玻片正面右侧 2/3，处均匀涂抹成 10mm×20mm 的卵圆形痰膜。痰膜朝上静置，自然干燥后（一般约需要30 分钟）进行染色镜检。 涂抹完毕后的痰标本，在报告结果前应暂时保留。为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时，对载玻片进行加热。

二、萋尔－尼尔逊染色法（Ziehl-Neelson ，Z-N ，简称萋－尼氏染色）：

（一）试剂的配制 1 ．石炭酸复红染液： （1 ）储存液

① 碱性复红液：碱性复红 8g，加 95% 乙醇至100ml ，充分振荡使复红溶解。 碱性复红乙醇储存液应避光保存，为保证染液的质量，建议储存液保存不超过 6 个月。

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 13 页 共 32 页 ② 5% 石炭酸水溶液：40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸 5g 溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml 。

（2 ）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液 10ml与5%石炭酸水溶液 90ml充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。 碱性复红（或称为碱性品红，basic fuchsin，or pararosaniline chloride，分子式为 C 19 H18NCl）用于AFB 染色时，必须使用染料最低含量超过88% 的生物染色剂，合格产品一般在试剂包装上注明相应含量。如果标注的染料含量低于88% ，则在配制时需调整称取量。例如，染料含量标注为75% 的产品，配制 100ml 储存液时实际的称取量应是8/0.75=10.7g。

石炭酸（苯酚，phenol ，分子式为 C 6 H6 O）:应使用熔点为40.5 ℃的分析纯试剂。

2 ．5%盐酸乙醇脱色液：35% 浓盐酸 5ml 与95% 乙醇95ml混合。 3 ．亚甲蓝复染液：

（1 ）储存液：亚甲蓝 0.3g 溶于95% 乙醇50ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml 。

（2 ）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5 倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06% ，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。亚甲蓝（methylene blue chloride，or methylthionine chloride ，分子式为 C 16 H18 ClN3S）：染色时必须使用染料含量超过82% 的生物染色剂。 4 ．萋－尼氏染色步骤：

1. 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm 以上

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 14 页 共 32 页 的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4 次）。 2. 滴加石炭酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5 分钟。染色期间始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。

3. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 4. 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1 分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。

5. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 6. 滴加亚甲蓝复染液，染色30 秒钟。

7. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。 一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。 三、镜检读片：

（一）萋－尼氏染色玻片镜检

使用 10 ×目镜双目显微镜读片。取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40×物镜，在玻片上滴 1 ～2 滴镜油，使用 100×油镜进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止AFB 的交叉污染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。 由于香柏油（cedarwood immersion oil）能溶解复红染料，使萋-尼氏染色退色，并且容易干燥凝结，对油镜头造成损害，故推荐使用专门用于100×油镜、不干燥、不变硬的镜油（immersion oil ）。

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 15 页 共 32 页 读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mm ×20mm 的痰膜，使用100×油镜，每行可观察约100 个视野。仔细观察完300 个视野，一般需要 5 分钟以上；每个工作日，一位镜检人员的玻片阅读量不要超过25 张，且连续阅读 10～12 张玻片后，应休息20 分钟左右。 四、镜检结果报告：

由于与疾病传染性的程度及其相应严重程度密切相关，故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据。因此痰涂片镜检的结果报告，不仅是对疾病的定性，也是对疾病严重程度的半定量。 （一）萋－尼氏染色镜检结果分级报告标准：

抗酸杆菌阴性（－）：连续观察300 个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：1 ～8 条/300 视野。 抗酸杆菌阳性（1+）：3～9 条/100 视野。 抗酸杆菌阳性（2+）：1～9 条/10 视野。 抗酸杆菌阳性（3+）：1～9 条/ 每视野。 抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/ 每视野。 五、抗酸染色玻片的保存：

阅读完萋－尼氏染色玻片后，应及时用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油、干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。

六、痰涂片抗酸染色检查注意事项 （一）AFB 痰检假阳性结果的预防措施

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 16 页 共 32 页 1. 必须使用新的载玻片进行痰涂片检查。 2. 每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。 3. 所有染液均经过过滤。

4. 染色时玻片彼此之间保持一定距离，相互彻底分隔开。 5. 严禁使用染色缸将玻片放置一起染色。 6. 染色时勿使玻片上的染液干燥。

7. 滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。 8. 严禁物镜镜头直接接触玻片痰膜。

9. 完整、准确的标注痰盒、玻片和实验室登记本的各项内容。 10. 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 11. 准确记录和报告结果。

（二）AFB 痰检假阴性结果的预防措施 1. 确认标本是痰而非唾液。 2. 确认每份标本至少有 3 ml 。

3. 选择脓样、干酪样、粘液分泌物涂抹制备玻片。 4. 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。 5. 使用高质量染料、严格按照配方配制染液。 6. 严格按照操作程序完成染色过程。

7. 判断结果为“阴性” 前，必须阅读规定要求的视野数。 8. 作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。 9. 完整、准确地标注痰盒、玻片和实验室登记本。 10. 登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。 11. 准确记录和报告结果。

第六节 涂片抗酸染色检查材料管理

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 17 页 共 32 页 一、显微镜日常维护

显微镜作为发现涂片阳性病人的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给予正确维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点：

1. 显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。 2. 使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。 3. 严禁物镜镜头直接接触玻片上痰膜。 4. 使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。

5. 使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。 二、AFB 镜检耗材管理:

为保障痰涂片检查工作能够连续不断开展，应储存一定数量的实验耗材和相应试剂，储备量可根据既往每季度工作量来进行评估，一般应准备比平均工作量高20% 的相应耗材和试剂。参考文献： 1. 《全国结核病防治工作手册》，卫生部疾病控制司、卫生部医政司编，1999。

2. Technical Guide. Sputum Examination for Tuberculosis by Direct Microscopy in Low

Income Coutries.5th edition,IUATLD,2000.

3.The Micoscope.A Practical Guide.WHO Project:ICP TUB 001.New Delhi, India:WHO

Regional Office for South-East Asia,1999.

4. Laboratory Biosafety Manual.2nd edition.Geneva:WHO,1993:60-61.

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 18 页 共 32 页 第三章 痰涂片实验室质量保证

按照世界卫生组织（WHO）和国家结核病防治规划（NTP ）的要求，在我国已全面推行DOTS 策略或DOTS 策略得到良好贯彻执行的地区，为了持续提高结核病实验室痰涂片检查的工作效率和可靠性，必须建立我国结核病实验室质量保证系统网络，在实验室内部质 量控制的基础上，应用实验室间质量检查和评估方法，进行实验室检查系统的评价，并通过采取一系列措施改经和不断提高实验室业务总体水平。

第一节 室内质量控制

室内质量控制（Quality Control ，QC）是指实验室内部的操作规程、设备和耗材、痰标本收集、染色剂制备、涂片制备和染色、显微镜维护、显微镜镜检、结果登记和报告、以及痰片保存等整个过程中的内部检查和监测。 一、痰标本收集

（一）容器：采用 WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集标痰本（参考规格：直径 4cm ，高度 2cm ）。痰容器应标明病人姓名、日期、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）和容器序号1 、2 、3 （1 ＝当日即时痰，2 ＝夜间痰，3 ＝次日即时痰）。

（二）痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 24 页 共 32 页 盲法复检不是为了验证单个病人诊断正确与否, 而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了涂片镜检结果存在的误差之外，还包括涂片样品的质量（痰液与唾液的比例）、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等, 以便采取纠正措施，改善实验室工作质量。 1. 误差分类

（1 ）定性错误包括高假阳性和高假阴性

高假阳性（High False Positive ， HFP）：阴性片被错误地判读为2 ＋～4 ＋阳性。

高假阴性（High False Negative ，HFN ）：2 ＋～4 ＋阳性涂片被错误地判读为阴性。

（2 ）定量错误包括量化误差、低假阳性和低假阴性

量化误差（Quantification Error，QE）：同一张阳性涂片受检方和控制方阳性判断级别的差异。

低假阳性（Low False Positive ，LFP ）：阴性涂片被错误地判断为低阳性（1 ＋以下）。

低假阴性（Low False Negative ，LFN ）：低阳性（1 ＋以下）涂片被错误地判断为阴性。

2. 常见“误差”原因 假阳性 （FP）

1) 假象（例如着色沉淀或结晶）被误识为抗酸杆菌 2) 抗酸杆菌来自以前阳性涂片的镜油 3) 原始报告后着色的抗酸杆菌退色

1 、2 ）对技术人员复训，3 ）对假阳性涂片重新着色并复检。

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 25 页 共 32 页 假阴性（FN）

1 ）观察涂片的视野数量不足 2 ）显微镜检查技术能力差

3 ） 染色操作不规范（抗酸杆菌颜色暗淡、背景对比不足或过高） 4 ）显微镜存在问题 5 ）染液质量查

1 、2 、3 ）对技术人员复训 ，4 ）现场检查显微镜， 5 ）重新购置质量合格的染料并重新配制染液 。

量化误差 （QE） 1 ）观察涂片时间不足

2 ）阳性涂片的分级报告标准掌握差 3 ）显微镜检查技术能力差 4 ）显微镜存在问题

1.2.3）对技术人员复训 ，4 ）现场检查显微镜工作状态。 （七）复检结果反馈

1. 盲法复检的最终目的是提高实验室涂片镜检的质量，必须按规定、持续和及时地向下级实验室反馈复检结果。

2. 复检发现的假阳性或假阴性涂片，由复检单位保存，以便最初的检验人员了解自己的失误，查找原因提高检测质量。

3. 初次复验者对最初的涂片结果并不清楚, 应当将再次复验者的结果反馈给初次复验者，使其有机会了解自身水平。

4. 反馈内容应包括造成失误可能存在的原因，和技术改进建议。 5. 对存在严重误差（定性错误和频繁的定量错误）的实验室，再

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 26 页 共 32 页 次复验者应及时反馈信息，并进行现场调查，协助查找原因解决问题。 6. 按统一要求填写反馈报告。 三、批量检测

批量检测是指定期地由国家或省级参比室向外围实验室发送已经染色和/ 或未染色的涂片，由外围实验室人员来读片并对读片结果进行评估。这种方法是检查实验室技术人员的染色能力和/ 或读片能力，主要检测个人的操作技术，而不是检测实验室的整体操作水平，也 不是检测实验室的常规操作。当没有其它质量评价方法存在时，批量检测可以作为评价当前操作第一个有价值的测量方法 。 （一）、测试涂片准备和要求

1 、测试涂片由国家参比室和省级参比室负责制备。

2 、测试涂片包括染色和未染色涂片，低阳性的涂片，太厚或太薄的涂片，染色不好的涂片。

3 、每张阳性涂片的抗酸杆菌数量都已确定，阴性涂片都具有一致的背景。

4 、为提高制作的效率，参比实验室应按 50～100 张涂片为一批进行制备。

5 、已染色的涂片主要用于评估痰检人员的镜检能力，不能表明技术人员的准备染色剂和染色能力。

6 、未染色的涂片可检测技术人员的综合技术水平，包括染色剂的制备、染色、镜检和结果报告。

7 、当参比实验室条件有限，不能准备批量检测涂片时，可利用已染色的病人涂片（如盲法复检后的涂片）用于批量检测。此法可降低国家或省参比室的工作量，但仅能评价技术人员的镜检能力（该法的缺

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 27 页 共 32 页 点是涂片之间缺乏一致性，即每个实验室接受的是不同背景的涂片）。 8 、批量检测是评价个人的能力和操作水平，实验室人员不能共享批量检测结果，每个实验室人员应有自己的独立结果。

9 、测试人员包括：1 ）新上岗的结核病实验室技术人员；2 ）现场督导（根据情况确定）；3 ）盲法复检中有较重大误差者的能力测试；4 ）常规培训活动内容之一；5) 年读片量在500 张以下的实验室。 （二）、涂片的数量和类型

一次批量检测限定的涂片量为10 张，涂片应包括不同等级的阳性涂片和一定数量的阴性涂片。批量检测时送往各实验室的涂片应包含相同比例的阳性片和阴性片。但批次不同，阳性和阴性的比例也不同。

浏阳市人民医院 医学检验中心 痰涂片镜检及痰培养 实验室质量保证手册 文件编号：lryj-jh-01 生效日期：2012.04.01 版本号：1.0 第 28 页 共 32 页 分支杆菌分离培养标准操作程序

【试验原理】：

标本通过适当的处理方式，杀灭杂菌，结核杆菌保留活性，根据专用培养基上是否有结核杆菌生长，判断标本中是否含有结核杆菌。

【标本留取】：

1. 发放40ml已灭菌标本瓶给病人。 2. 嘱咐病人漱口、深咳痰、量3-5毫升。 3. 标本瓶上写好病人姓名、送检日期。 4. 与检验单一起送检验科。

【标本处理】： 1不同标本的处理方法

1.1痰标本视标本性质加1～2倍体积4%NaOH溶液，振荡混匀2～3分钟。

1.2支纤镜标本同痰标本处理

1.3尿、胸水、腹水标本离心沉淀后，沉淀物加1～2倍体积4%NaOH溶液，振荡混匀2～3分钟。

1.4组织标本粉粹后，加1～2倍体积4%NaOH溶液，振荡混匀2～3分钟

1.5大便标本加一定量的无菌生理盐水，搅拌混匀，静止5～10分钟，取上层液加等体积4%NaOH溶液。

1.6脑脊液标本清亮时可直接用中性罗氏培养基，浑浊时加体积4%NaOH溶液。

2消化处理时间

从加入4%NaOH溶液开始计时，室温放置15分钟，15分钟开始接种，20分钟内接种完。

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【标本接种】

用无菌滴管取消化处理后的标本接种于两管酸性罗氏培养基斜面， 每管0.1ml,并使标本与斜面充分接触。接种后, 拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞, 37% 平卧放置斜面24h后, 直立放置,37% 继续培养。这一步骤的关键在于必须严格无菌操作,接种量一定要足量, 且要保证培养温度的恒定。

【标本培养】：接种标本的培养基于37℃恒温箱培养，培养第3天、第7天各观察一次细菌生长情况,此后每周观察一次,培养阳性随时报告结果。若7d内发现菌落生长,并经抗酸染色证实为抗酸杆菌, 可报告快速生长分支杆菌。一周后菌落生长, 且抗酸染色阳性,可报告分支杆菌生长,若培养满8周仍未见菌落生长, 报告分支杆菌培养阴性。

【结果报告】： 1结果报告

1.1阳性：结核分支杆菌菌落一般于第二周开始生长，菌落微黄，干燥；非结核分支杆菌菌落因菌种不同而异。菌落经涂片抗酸染色确认。 1.2阴性：至第八周无菌落生长。

1.3污染：培养基液化或其他杂菌生长。 2报告方式

2.1无分支杆菌生长：至第八周无菌落生长 2.2有分支杆菌生长： 1+，菌落占斜面1/4 2+，菌落占斜面1/2

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【注意事项】：

1. 培养基一定要在有效期内使用。

2. 标本瓶一定要灭菌，所有操作要遵守无菌操作规程。

3. 严格遵守标本处理时间，防止过处理和消化不足。标本过多时要分批处理。

4. 配制的培养基一定要做无菌试验。 5. 阳性结果要涂片镜检确认。 6. 每天观察记录恒温箱的温度。 7. 污染率控制在2%-5%。

8. 每批处理标本的数量不超过8个。

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