浅析实验动物房转基因小鼠微生物污染原因及对策 - 图文

编号：

中国农业大学现代远程教育

毕业论文（设计）

浅析实验动物房转基因小鼠微生物污染原因

及对策

学 生 许杰 指导教师 田纪景 专 业 动物医学 层 次 专升本 批 次 121 学 号 W320209121020 学习中心 上海农林-闵行 工作单位 中科院神经科学研究所

2014年 02 月

中国农业大学网络教育学院制

独 创 性 声 明

本人声明所呈交的毕业论文（设计）是我个人进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在毕业论文（设计）中作了明确的说明并表示了谢意。

学生签名：许杰 时间： 2014年02月24日

关于论文（设计）使用授权的说明

本人完全了解《中国农业大学网络教育学院本、专科毕业论文（设计）工作条例（暂行规定）》对：“成绩为优秀毕业论文（设计），网络教育学院将有权选取部分论文（设计）全文汇编成集或者在网上公开发布。如因著作权发生纠纷，由学生本人负责”完全认可，并同意中国农业大学网络教育学院可以以不同方式在不同媒体上发表、传播毕业论文（设计）的全部或部分内容。中国农业大学网络教育学院有权保留送交论文（设计）的复印件和磁盘，允许论文（设计）被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编论文（设计）。

[保密的毕业论文（设计）在解密后应遵守此协议]

学生签名：许杰 时间： 2014年02月24日

密级：（请注明密级及保密期限）

摘要

本文通过对从业人员素质、动物微生物质量控制、物品传递控制、设施运行维护、饮水质量监测、饲料垫料质量控制等环节进行分析。旨在研究造成实验动物房转基因小鼠出现微生物污染的可能原因及预防措施。结果我们发现出现微生物污染的原因最有可能是物品传递、人员不遵守操作规范而导致的。因此严格控制屏障设施的物品进出并强化从业人员的守规意识是影响设施长期稳定运行的重要因素，将给从事实验动物管理者带来十分重要的指导意义。

关键词：实验动物 设施管理 微生物污染 预防措施

目录

1.前言 ....................................................... 1 1.1 研究背景 ............................................... 1 1.2 研究现状 ............................................... 1 1.3 研究目的和意义 ......................................... 1 2.中科院神经所情况简介 ....................................... 1 2.1研究领域 ................................................ 1 2.2实验动物平台 ............................................ 2 3.污染动物的危害性 ........................................... 2 3.1对研究结果的影响 ........................................ 2 3.2对人员健康的影响 ........................................ 2 3.3对动物健康的影响 ........................................ 3 3.4污染动物净化史回顾 ...................................... 4 4.动物微生物质量监控 ......................................... 4 4.1微生物检测的重要性 ...................................... 4 4.2上海地区2011-2012年微生物检测数据统计 .................. 5 4.3神经所2012-2013年微生物检测数据统计 .................... 5 5.实验小鼠出现污染的原因和预防措施 ........................... 6 5.1人员综合素质 ............................................ 6 5.2动物质量监测 ............................................ 6 5.3设施维护及监控物品传递 .................................. 8 5.4动物饮水、饲料、垫料质量控制 ............................ 8 6.结论 ....................................................... 9 后记 ......................................................... 9 参考文献 .................................................... 10

1.前言

1.1 研究背景

现代神经科学基础研究的各个领域（包括分子、细胞和发育神经生物学、系统和计算神经科学以及神经与精神类疾病等）都需要广泛使用实验动物--转基因小鼠。比如利用小鼠模型研究MeCP2介导的神经电活动调控基因表达过程如何对神经可塑性以及大脑发育产生影响，为什么MeCP2的基因突变会导致孤独症谱系障碍类的神经系统疾病。再如抑郁症影响着千万人的心理和生理健康。利用小鼠模型并对其脑区定点基因操作进行在体研究，从而来验证候选基因在抑郁行为中的作用。今天，转基因动物已经成为21世纪生命科学和功能基因组研究中最重要的技术平台，备受科学家和世界各国政府的关注

［1］

。它们的健康水平决定着科学研究成果的成败，因此我

们必须为动物提供科学、稳定、优良的饲养环境才能为科研事业的推进贡献力量。

1.2研究现状

近年来随着实验动物行业的迅猛发展，行业内对高质量动物的期望与需求是与日俱增。生命科学研究领域所使用的转基因小鼠必须具备对外界因素敏感、反应均一、遗传背景明确、生物学特性稳定等基本条件，以保证动物实验结果的科学性、可靠性、可比性及可重复性

［2］

。动物的健

康水平也是影响实验结果和进度的重要因素，每位研究者对此无不十分关注。然而动物设施在实际运行中每时每刻都面临着来自人员、动物、物品进出的污染风险。由于转基因小鼠大多是由高度近交系繁育制作而来，本身就有遗传缺陷。再比如裸鼠、SCID等免疫小鼠自身抵抗力非常脆弱，动物一旦出现污染情况，既是安全隐患又对周围的环境产生影响，要想彻底清除病原体并非易事。而全群淘汰集体扑杀有造成了人力物力的巨大浪费。最重要的是研究组的长期科研成果很可能功亏一篑，损失是不可估量的。这对实验动物管理者的工作带来了巨大的挑战。

1.3 研究目的和意义

由于不同研究课题的需要及设施空间有限等条件限制，诸如大学或研究所等机构的动物设施内饲养的实验小鼠往往维持时间较长（比如老年病PD项目的研究）。实践中很难做到动物定期全进全出，然后设施彻底消毒待用。在实际操作过程中如何正确地预防和降低所面临的风险因子使其维持在可接受的范围内，是保证动物设施长期稳定地运行的关键，这将给从事实验动物管理者带来十分重要的指导意义。

2.中科院神经所情况简介

2.1研究领域

作为推动新千年基础科学研究的重要战略步骤和作为知识创新工程中的一个试点，中国科学院于 1999 年 11 月 27 日成立了神经科学研究所。截止2014年初神经所已经发展到30名研究

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组长（PI），他们致力于神经科学基础研究的各个领域，包括分子、细胞和发育神经生物学、系统和计算神经科学、认知和行为神经科学以及神经与精神类疾病的研究。这些研究领域绝大部分都要使用到转基因小鼠，并将其作为推动科研进展的重要实验工具。

2.2实验动物平台

在神经所动物使用与管理委员会的领导下，近三年来实验动物平台快速发展。新设立了胚胎实验操作部、动物质量检测部，与之前的动物饲养管理部和动物行为学实验室并列为平台的四大部门。平台共有16名员工，其中50%具有大学本科、研究生学历，并且全部通过上海市实验动物管理办公室举办的实验动物上岗证培训与考核。目前平台拥有两个清洁级实验动物饲养室共900㎡，5000笼位。先后于2004和2012年对动物房设施的通风系统进行了升级改造，并引入EVC（Exhaust Ventilated Closed-System Cages）垂直流通气笼具。动物微环境优化、空间利用率高、操作简便的EVC饲养系统更好地满足动物对环境的要求以及研究组对动物笼位的需求。

2014年底将搬入新的SPF级动物设施，面积2000㎡，笼位增加到11400笼。新的动物设施具有科学、先进、合理、管理方便、运行费用低等特点。鼠房的屏障环境由恒温、恒定气压梯度控制，自动控制照明。人流、物流、动物流、气流流向合理。设有物品消毒灭菌传递系统，动物饮用水纯化系统，自动报警和电话通讯系统，以及应急备用电源系统。中科院上海生命科学研究院和中科院神经科学研究所的领导对新大楼动物平台的启用高度关注并给予了大力支持，期望能为我国重大科技攻关项目的推进作出应有的贡献。

3.污染动物的危害性

3.1对研究结果的影响

对于生命科学研究的四大支撑条件(AERI)大家都很熟悉。你不能容忍仪器设备不准，不能容忍化学试剂不纯，同样你也一定不能容忍实验动物不健康。高分文章靠科学数据，科学数据靠健康的实验动物，如果动物不合格那么实验一定不顺利，数据一定不精确，重复性也一定很差。

例如鼠肝炎病毒（MHV）能引起小鼠致死性肝炎、肠炎、脑炎，并且改变动物机体的各种免

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疫应答参数，还能导致许多酶系统发生改变，大大降低动物繁殖性能。免疫缺陷的裸鼠感染了MHV可造成消耗综合症、下痢，严重影响肿瘤免疫学的研究。此外如小鼠肺炎病毒、仙台病毒、呼肠孤病毒3型、细小病毒等，许多携带病毒的小鼠常常是无明显临床症状或隐性感染，一方面在小鼠受到实验处理等应激状态下，能使动物出现临床症状和病理改变，影响动物健康并干扰研究结果；另一方面也直接导致动物生理生化参数的改变从而影响实验结果，特别是在一些疾病的

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病因学研究项目中，是造成研究失败的主要原因。实验一旦中断还会造成人力、物力、财力的极大浪费。

3.2对人员健康的影响

说起对人的危害，惨痛的教训不胜枚举。1999年广州中医药大学博士后张某从事“九五”国家攻关课题“补肾法治疗老年性痴呆”的实验时接触大鼠，3个月后感染流行性出血热，2003年被诊断为肾功能衰竭，2006年进行肾移植手术。

2

2001年6月，北京发生了因使用质量不合格实验动物和动物实验不规范致使鼠源性人兽共患病流行性出血热感染：一名院士死亡和700多师生紧急预防接种。

2002年,湖北省药检学校的一名毕业生在某药厂从事动物实验工作，由于接触了带出血热病毒的实验动物而感染流行性出血热不治死亡。

2006年长春市某高校中药系实验室发生学生感染流行性出血热事件，10名学生受感染。 由于这些人鼠共患性病原菌多数可通过气溶胶进行空气传播，非常容易污染环境，严重威胁动物实验人员和饲养人员的生命安全，同时也是动物健康稳定的破坏性因素。

表1：2002-2006年主要人鼠共患病发病和病死情况

年份

发病数（例）

鼠疫 病死数（例） 病死率（%） 肾综合 发病数（例） 出血热 病死数（例）

病死率（%）

2002 2003 2004 2005 68 13 0 1 0 7.69 31056 21496 190 144 0.61 0.69

22 10 9 3 40.91 30.0 26177 22288 215 227 0.82 1.02

［5］

合计 114 13 11.40 117146 921 0.79

2006 1

0 0

16129 145 0.90

表1：国际流行病学传染病学杂志2007年4月第34卷第2期Inter J Epidemial Infect Dis,April 2007,Vol.34,No.2

3.3对动物健康的影响

比如实验小鼠感染了鼠痘病毒（Ectro Virus），常常引起爆发流行，甚至能毁灭整个动物种群。

患病鼠急性症状为突然死亡，慢性症状表现为皮肤斑丘疹、结痂，眼部结膜炎，偶尔肢端脱落或隐性感染。免疫力低下的动物容易感染其他病原体，加重病情的发展，动物健康得不到保证，实验进程也就此终止。

再比如实验小鼠感染了体内外寄生虫（螨虫、蟯虫、鞭毛虫等），可以通过直接接触水平传播，也可以通过笼具独立送排风笼具系统纵向传播污染饲养环境。寄生虫对小鼠的影响主要表现为掠夺宿主的营养，对小鼠的骚扰及机械性刺激和损伤，并能影响动物的情绪。此外寄生虫的分泌物、毒素对动物机体产生毒性作用，能影响动物的生理、生化及免疫系统。感染螨虫的小鼠会不停地抓挠皮肤破溃处，严重影响小鼠的休息和健康，违反了动物福利的基本要求，更别说用这样的小鼠去做行为学实验了。

图1 图2

图3 图4

3

图1、图2为2011年净化前的动物照片；图3、图4为2012年净化后的动物照片

3.4污染动物净化史回顾

对于实验型屏障系统动物房管理，每时每刻都会面临着动物被污染的风险。而且这是个量变到质变的过程。下面就简要回顾一下神经所动物房的净化史。2011年底我刚来到动物房任鼠房组长，当时神经楼屏障系统内饲养的转基因小鼠细菌、病毒、寄生虫污染已非常普遍。经过检测部门鉴定，动物种群中感染了体外寄生虫、全部蠕虫、鞭毛虫、金黄色葡萄球菌、泰泽病原体、肺支原体、鼠肝炎、仙台病毒等。严重影响到科研项目的实施和从业人员的健康，为此神经所动物使用管理委员会紧急召开会议，决定不惜一切代价将污染风险控制在最低限度，启用23号楼屏障系统作为净化专用设施，逐步将各品系转基因小鼠进行胚胎移植净化并按计划清理污染小鼠。经过动物平台全体人员的共同努力，与神经所领导和动物使用管理委员会的大力支持，我们终于在2012年的2月份顺利对神经楼屏障系统进行熏蒸消毒，3月份将已经净化好的转基因小鼠从23号楼安全转移到神经楼交与各个研究组实验使用。

4.动物微生物质量控制

4.1微生物检测的重要性

首先，实验型屏障系统动物房是一个多用途的动物饲养设施，容纳着几百个品系的转基因小鼠，从事着各种类型的实验（行为学、药物注射、胚胎电转等）。其次随着研究的深入与合作加强，转基因小鼠的来源单位也相当复杂，动物进出设施频繁，可移植性肿瘤、杂交瘤、细胞系、

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血制品和其他生物材料都可能是污染啮齿类或对实验人员产生威胁的鼠类及人类病毒的来源。最后，某些特殊性实验周期长，小鼠需要养老后才能使用，过程上做不到全进全出，也就意味着没有多余的时间与空间来消毒设施和动物笼架。

另外，除了人兽共患病之外，与小鼠密切相关的还有烈性传染病和条件性致病菌，由于我们所现在大部分使用的都是基因工程小鼠，所以受条件致病菌的干扰更大甚至改变小鼠表型。比如绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、诺瓦克病毒、螺杆菌等。感染了这些病原菌的小鼠通常表现为无症状感染，但会改变动物生理状态，改变实验进程甚至改变微环境和基因表达模式。而遗传工程小鼠更易感，它能够干扰遗传工程小鼠的表型，并改变病原微生物的易感性。比如SCID小鼠和裸鼠感染嗜肺巴氏菌后形成结膜炎导致眼眶脓肿；螺杆菌感染致使SMAD3-/-小鼠结肠癌。

因此，我们的动物微生物检测部门必须掌握设施内部饲养的小鼠所携带的微生物种类，一旦发现有病原体就立即采取相应措施，缩小污染范围隔离目标群体，必要时全部淘汰，为动物营造一个健康稳定的生存环境。

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4.2上海地区2011-2012年微生物检测数据统计

上海市实验动物质量监督检测站对45家实验动物使用和生产单位进行抽查的不同级别的啮齿类实验动物，其中SPF级小鼠86批次666只，清洁级小鼠17批次151只，SPF大鼠30批次128只，清洁级大鼠11批次84只

［7］

。

表2：各级别啮齿类实验动物寄生虫检测批次感染比例

体外寄生虫

实验动物

（阳性批次/总批次）

大鼠CL 大鼠SPF 小鼠CL 小鼠SPF

1/11 0/30 0/17 9/86

弓形虫 （阳性批次/总批次） 0/11 0/30 0/17 0/86

蠕虫 （阳性批次/总批次） 3/11 3/30 1/17 12/86

鞭毛虫 （阳性批次/总批次） 0/11 3/30 0/17 8/86

纤毛虫 （阳性批次/总批次） 0/11 0/30 0/17 0/86

36.4 20.0 5.9 33.7 批次阳性率%

从表2可见，清洁级大鼠、SPF级大鼠及SPF级小鼠的批次阳性率较高，分别达到36.4%、20%、和33.7%。影响清洁级大鼠批次阳性率高的主要是蠕虫（27.3%）和体外寄生虫（9.1%）；影响SPF级大鼠批次阳性率高的主要是蠕虫（10%）和鞭毛虫（10%）；影响SPF级小鼠批次阳性率高的主要是蠕虫（14%）、体外寄生虫（10.5%）和鞭毛虫（9.3%）。清洁级小鼠批次阳性率为5.9%（蠕虫）。

4.3神经所2012-2013年微生物检测数据统计

净化工作完成后的近两年内，检测部门对动物房内的微生物进行了跟踪监控，共抽检哨兵鼠962只、新进小鼠808只、转基因小鼠433只、单检小鼠2039只。

表3：2012-2013转基因鼠房微生物检测数据统计

检测对象

只数

哨兵鼠 新进小鼠 转基因小鼠 单检小鼠

347 375 110 795

只数 0 3 0 1

0 0.8 0 0.13

2012年

阳性

阳性率%

只数 615 433 323 1244

只数 36 1 134 225

5.9 0.2 41.5 18.1

2013年

阳性

阳性率%

表3显示的是2012年度新进3只动物分别检测出体外寄生虫阳性、蠕虫阳性、金黄色葡萄球菌阳性，阳性率0.8%。单检小鼠1只被检测出蠕虫阳性，阳性率0.13%。2013年8月开始哨兵鼠36只动物分别检测出鞭毛虫、绿脓杆菌，阳性率5.9%。新进动物1只被检测出肺支原体阳性，阳性率0.2%。转基因小鼠有134只抽检出鞭毛虫、绿脓杆菌，阳性率41.5%。单检小鼠有225只检测出鞭毛虫、绿脓杆菌，阳性率18.1%。

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5.实验小鼠出现污染的原因和预防措施

5.1人员综合素质

从业人员整体素质的高低是动物是否健康不被污染和设施能否稳定运行的关键性因素。目前我国实验动物行业采取的是资格认证制度，设施通过专家组考评获得相应的生产或使用许可证，从业人员通过市级实验动物管理办公室举办的培训考试即可获得上岗证。想要获得认证难度并不大。相比较而言，国外非常重视实验动物的质量和从业人员素质的培养，只有规范化操作才能保证科研数据的准确性与可重复性。我国实验动物行业并不十分关注动物的质量与健康，从业人员的素质普遍较低。PI们除了对所进行的实验要有充分的知识储备外，对相关的实验动物和动物设施也要有一定的了解

［8］

，这样才能对其学生进行教育。就以我们所为例，由于从业人员不重视，

违规行为屡禁不止。比如超净台使用完不清理、屏障区专用拖鞋外穿、进出设施不随手关门等。这些违规情况至今还在不断发生。很小的行为造成的不良后果不断积累，最终量变导致质变。

随着动物质量与设施等级的不断提高，动物房的管理理念的与时俱进也成为每一个管理着必须考量的重要问题。神经所动物房设施复杂，使用人员多，这就必须要求大家能够严格按照规范执行，把污染风险降至最低。比如设施配置上要有核心保种区，对于那些看不见摸不着的病原体来说微生物检测部的建立至关重要，外来动物进入鼠房首先必须检疫，合格后方可放行。对于珍贵动物提供不了足够抽检数量那么可以暂放于动物隔离检疫区，再通过胚胎移植净化的方式进入鼠房。如果需要可将动物由相应饲养室转移到各个功能实验室，但切记动物一旦出了屏障禁止返回。动物繁殖配比一定要控制，分笼要及时避免过度拥挤的环境产生的应激造成动物免疫力下降，从而激活潜在携带的病原体导致疾病的传播。这些规定都是需要我们使用动物的人牢记在心并严格履行的。因此，严格制定人员培训计划，必要时执行惩罚制度势在必行。

5.2动物质量监测

5.2.1哨兵鼠制度

由于多数转基因鼠具有遗传缺陷，免疫缺陷鼠自身抵抗力很差。SPF是指无特定病原体动物，但也可能携带其他病原微生物，若长期饲养在IVC动物设施中而不定期清除消毒必将引起微生物的交叉感染。如何长期保证实验动物的质量，控制目标病原微生物才是关键。加之引进的动物数量稀少，无法按比例抽检，而且多数为珍贵品系，价格不菲。为此我们建立了较为完善的哨兵鼠监控制度。虽然哨兵动物身处恶劣环境，但是却担负着监测病原微生物的重任。

垫料哨兵鼠：以每个笼架为单位，50-60笼小鼠由一笼哨兵鼠监控，一笼里放三只哨兵鼠。每周从待检测动物笼盒中取出一勺脏垫料放入哨兵动物笼盒中，与其充分接触。一般6周/12周后，哨兵鼠会被送到检测部门进行全面的健康检测。优点是单只哨兵鼠可以接触到同一品系动物不同笼盒中的垫料；能够在不危害或者引起待检动物疼痛的情况下检测病原体；不需要全面筛查动物节省人力与时间。缺点是并不是所有的病原体都能够感染垫料哨兵鼠（仙台病毒）。

环境哨兵鼠；以每个房间为单位，200-300笼小鼠由一笼环境哨兵鼠监控，一笼里放2-3只小鼠，只需正常换笼而不需要添加其他动物笼盒内的脏垫料，并且去除笼盖开方式饲养。优点是

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弥补了垫料哨兵鼠检测不到的由空气传播的病原体。缺点是一定程度上增加了房间的氨浓度。

5.2.2国内外动物引进

外来动物携带的病原微生物入侵也是引起动物污染的原因之一。由于神经所的PI很多是来自国外的知名实验室或者大学的研究机构，他们的研究课题中经常需要使用到特殊的转基因小鼠，然而这些动物并非通过商业公司能买到，因此只能从保持有该品系动物的研究者那里获取。但是国内外不同的实验室管理水平有差异，动物质量控制方面也存在本质区别。加之动物长途运输导致的应激条件也是激发产生病原体的潜在因素。我们曾经引进南京某研究机构的转基因小鼠发现了体外寄生虫（螨虫），引进日本某大学的SPF转基因小鼠时发现了体内寄生虫（线虫）。目前国内的实验动物生产商神经所只认可上海斯莱克实验动物有限公司，国外除了来自JacksonLab的小鼠提供抽检动物合格后可直接进入屏障系统，来自其他任何国家和地区的研究所、院校、生产单位的动物都必须经过胚胎移植净化程序才能进入屏障系统动物房。与此同时，上海市浦江出入境检验检疫局还严格规定，外来引进的实验小鼠必须饲养在单独设立的检验场所的隔离器内，且饲养人员必须固定，经专业兽医仔细观察30天无异常症状后才可放行。这也成为进一步降低外来微生物污染的有效措施。

5.2.3微生物检测制度

检测部门完全按照国标GB 14922.2-2011实验动物微生物学等级及监测和GB 14922.2-2011实验动物寄生虫学等级及监测的检测方法

［10］

［9］

对目标病原微生物进行检测，共计19个项目。金黄

色葡萄球菌、绿脓杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、沙门氏菌、鼠棒状杆菌采用分离培养方式鉴定；支原体、泰泽菌、鼠肝炎病毒、鼠肺炎病毒、鼠细小病毒、仙台病毒、鼠痘病毒、呼肠孤-3型采用Elisa检测方法；体外寄生虫采取刮取眼部、颈部、耳后根部的皮屑镜检；蠕虫取回盲部内容物镜检或饱和食盐水粪便漂浮法检测；弓形虫采取间接血凝试验（IHA）；纤毛虫、鞭毛虫采取回盲部内容物镜检观察。

除了哨兵鼠以外，检测部门还会对设施内不同笼架上饲养的不同品系的转基因小鼠进行随机抽检，并做好详细的抽检记录。另外很多病原体（螺杆菌、绿脓杆菌、金葡菌等）可以通过粪便的PCR检测方法实现快速检测，同时对Elisa检测抗体出现的假阳性结果可以做比对复检，增加结果的准确性。这样可以不完全依靠Elisa试剂盒，很大程度上能够节省费用开支，大批量样本还能节约检测时间，目前我所检测部门对运用这种快速检测的方法还在进一步研究和实践中。

对于啮齿类动物来说极少数流行性传染性病原体会引起发病，而亚临床传染病的监测需要进行实验室微生物检测。由于动物群体数量庞大，因此我们大多数精力都集中在病原体的筛查而非诊断。除上述的血清学检测方法外，我所还结合了兽医临床观察（异常外观、行为、粪便、尿液、其它分泌物等）、大体病理学剖检（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠道）等辅助方法。将来条件允许的话我们还想引入组织病理学检查，因为它通常是判定病因的必要方法，而且特异性染色可能有助于某些微生物或沉着物的鉴定。希望通过建立兽医临床观察、实验室微生物培养、血清学和PCR检测、大体剖检与组织病理学诊断等综合监测方法来为实验动物质量的监控工作保驾护航。

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5.3设施维护及监控物品传递

5.3.1设施维护

设施大环境与笼盒小环境的清洁水平是影响动物微生物污染的原因之一。动物数量超标饲养引起笼盒内氨浓度过高，对动物产生的应激作用会增加患病风险；通风系统耗材不定期更换也会导致送风量逐渐减小甚至出现逆向气流引起交叉污染。动物笼、架和附属设备要定期进行清洗、

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消毒或灭菌。消毒频率：每天下班前对走廊、缓冲间、更衣间等公共区域进行喷雾消毒，每周对整个饲养区域进行喷雾消毒一次。消毒液交替使用，主要为二氧化氯、过氧乙酸、百毒杀等。

耗材更换：通风系统的初效过滤网每两周清洗一次，中效过滤网每三个月更换一次，高效过滤网布每年更换一次。屏障系统内的回风树初效过滤网每周清洗消毒一次。检测部门每季度的环境落下菌检测数据也为过滤器耗材的定期更换起到一定的指导依据。

5.3.2监控物品传递

由于无法全时监控传递进屏障系统的物品是否都能达到无菌水平，因此物品的来源也成为最能影响设施环境的重要因素。凡是进入屏障内的物品能高压灭菌的一律高压灭菌，不能高压灭菌的从传递窗传入。先表面彻底喷雾酒精或过氧乙酸消毒液，再紫外灯照射15-30分钟。由于学生的物品（记录本、EP管、手术器械等）较多，我们动物房全部提供相关实验物品，并在屏障内专门安装了电脑供学生使用，避免了笔记本的频繁传入，降低不同来源的物品传递对屏障系统的威胁。但实际操作中作为管理者很难对传递进去的物品进行监控，表面有没有彻底喷雾消毒，紫外灯照射的时间有没有达到标准，传递明令禁止传入的物品，没有及时登记传递窗使用表格等等。有些外源性的病原体一旦进入设施后很难清除，比如棒状杆菌、鼠轮状病毒。建议搬入新设施后采用带有时间定时器控制的传递窗装置，在人员不可控制的情况下改善设备条件也是降低污染风险的措施之一。

5.4动物饮水、饲料、垫料质量控制

5.4.1动物饮水

动物长期饮用的最好是无菌水。目前我所小鼠饮用的水源来自动物纯水设备。虽然工艺上采用了多级过滤，RO膜逆渗透，紫外杀菌，0.25μm微孔终端过滤，基本上能满足动物饮水水质需求。但必须定期进行系统消毒处理，否则纯水箱中会出现绿脓杆菌。除了加酸HCL以外真正能达到无菌水要求的只有经过高压灭菌。我们不建议动物长期饮用加酸的水，因为这样会影响动

［12］

物的摄水量和适口性。免疫缺陷鼠的胃肠道对酸化水较为敏感，长期饮用会干扰肠道正常菌群。等待搬入新的设施后将全面采取高压灭菌的方式对饮水进行消毒处理。除了对高压灭菌锅做好日常维护工作以保证其灭菌能效外，每年应采取水样送专业检测机构（PONY Test）进行检测，从而对动物饮水的质量做好长期监控。

5.4.2动物饲料

除营养水平需要达到国标规定外，饲料包装的严密性和保质期也是影响动物健康的因素。目

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前小鼠喂养的是生产自上海斯莱克实验动物有限公司的大小鼠辐照繁殖料，出厂前均经过25KGY的Co60辐射灭菌处理。饲料传递进屏障前也同样要经过严格的气密性检验、表面消毒液浸泡和紫外灯照射消毒。另外每年都会安排对购买的饲料抽样进行微生物、重金属、农药残留等检测。

5.4.3动物垫料

与动物直接接触的垫料品质（舒适性、无刺激性气味、无毒物残留）同样影响着动物的身心健康。目前小鼠使用的是生产自上海茂生衍生物科技公司的大小鼠玉米芯垫料。垫料进入屏障前随笼盒一起经过121°C高温，30分钟的高压蒸汽灭菌，以达到完全无菌的状态。传递进屏障待冷却后给动物使用，且灭菌好的垫料在清洁物品储藏室内停留时间不超过3天，避免微生物的滋生。另外每年都会安排对购买的垫料抽样进行微生物、重金属、农药残留等检测。实验动物使用的饲料、垫料必须从有资质的、正规的、大型专业的生产商处购买，切勿贪图便宜节约成本，否则必定得不偿失。

6.结论

综上所述，净化后的动物设施再度出现了污染的主要原因有两点，一是人员的违规操作带来了巨大的安全隐患；二是实验物品的传递实际操作中并没有按照规定的要求执行，且无法监控。虽然我们在2011年动物房净化后按照SPF要求进行管理，但由于动物设施老化、外围环境恶劣、管理和检测经验不足，在坚持了1年半后鼠房出现了鞭毛虫和绿脓杆菌的污染，使动物房又回到了清洁级。但这些问题的出现也为我们今后启用新大楼SPF级鼠房的管理提供了宝贵经验。

因此我们必须加大宣传教育的力度，让大家都知道污染动物的危害性，严格遵守规章制度的必要性。同时，我们也要不断加强专业知识学习，努力提高从业者自身的素质，明确哪些做法是对的哪些做法是错的，掌握更多应对风险的正确处理方法才是提高管理水平的立根之本。

实验动物行业是一个充满希望的朝阳行业，它与一个国家的科技发展水平密不可分，希望能有更多的人能够了解、关注、理解这个行业。再此也建议相关实验动物管理部门能够优化专业知识结构，增加从业人员的培训授课次数，让我们能够真正运用学到知识来解决工作中遇到的问题。

后记

我从事实验动物行业时间不长，经验不足，还有很多地方需要努力学习与改进，在此非常感激神经所的同仁们，在工作中付出了巨大的努力，同时也给予我的无私帮助与支持！我在农大网络学院上海农林-闵行分院求学的过程中，得到了老师们的关心和指导，在此向她们表示衷心的感谢！我还要感谢在百忙之中对该论文进行评审和提出宝贵意见的各位专家老师，非常感谢！

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参考文献

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