CHO细胞大规培养

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摘要

CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞。微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-Sephadex A50）作为载体，轻微搅动即可悬浮在培养基中。由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。后来根据细胞附着生长的特点，对微载体进行改良，使其电荷或其介质更利于细胞附着和生长。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1 g 微载体其比表面积可达6000 cm2，从而可实现细胞的高密度培养。首先将CHO细胞在无血清培养基（SAF-CHO-G-004）中进行无血清驯化。其次将CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中连续培养生成一定量的种子细胞。最后将种子细胞进行大规模培养。运用半连续式培养来操作：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。最后在细胞培养过程中进行细胞常数的检查和培养基内污染物的检测一些抗凋亡策略来增加细胞培养的效率。

[关键字]CHO细胞;明胶微载体;无血清培养;半连续式培养

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目录

摘要 ....................................................... 1 关键字：CHO细胞 明胶微载体 无血清培养 半连续式培养 .......... 1 绪论 ....................................................... 3 1.2CHO细胞培养的特性 ....................................... 3 2.2.1培养基的物理性质 ...................................... 5 2.2.2无血清培养 ............................................ 7 3.1.2蛋白质作基质的微载体 .................................. 8 3.1.3微载体培养原理与操作 .................................. 9 3.2.2微载体培养种子细胞 ................................... 12 3.2.3微载体培养的细胞传代 ................................. 12 3.3半连续式培养（semi-continuous culture） 操作 ........... 12 4.2细胞常数检查 ........................................... 14 4.3CHO细胞培养内污染物的检测 .............................. 14 4.3.2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 ................... 15 4.3.3支原体污染对细胞影响及污染物的检测 ................... 16 5抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用 ....................... 16 5.1 营养物质抗凋亡 ........................................ 17 5.2 基因抗凋亡 ............................................ 17 5.3 化学方法抗凋亡 ........................................ 17 参考文献： ................................................ 18

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绪论

1.1引言

CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-_-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。

1.2CHO细胞培养的特性

CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：

动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；培养过程需氧量少(氧传质系数kLa 大于10 h-1即可满足每毫升107 个细胞的生长)；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，

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生产成.本高，但附加值也高。 2.1DMEM培养基的组成与制备 2.1.1DMEM培养基的组成

序号 化合物名称 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

无水氯化钙 硝酸铁 .9H 氯化钾 无水硫酸镁 氯化钠

无水磷酸二氢钠 L-盐酸精氨酸 L-盐酸胱氨酸 L-谷氨酰胺 甘氨酸 L-盐酸组氨酸 L-异亮氨酸 L-亮氨酸 L-盐酸赖氨酸 L-甲硫氨酸 L-苯丙氨酸

含量 (mg/L) 200.00 2 O 0.10 400.00 97.67 6400.00 125.00 84.00 63.00 584.00 30.00 42.00 105.00 105.00 146.00 30.00 66.00

序号 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

化合物名称 L-丝氨酸 L-苏氨酸 L-色氨酸 L-酪氨酸钠盐 L-缬氨酸 D-泛酸钙 氯化胆碱 叶酸 肌醇 烟酰胺 核黄素 盐酸硫胺 盐酸吡哆辛 葡萄糖 丙酮酸钠 酚红

含 量 (mg/L) 42.00 95.00 16.00 104.00 94.00 4.00 4.00 4.00 7.20 4.00 0.40 4.00 4.00 1000.00 110.00 15.00

将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温20℃～30℃）到950毫升，轻微搅拌溶解。

（1）加入2.438克碳酸氢钠。

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（2）轻微搅拌溶解，加注射用水至1升。

（3）用1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol / L盐酸溶液调pH至所需值。

（4）用0.2μm滤膜正压过滤除菌。 （5）溶液应在2℃－8℃下避光保存。 2.2.1培养基的物理性质

无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物，对细菌和霉菌也是高度营养物，细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡，因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身。因此，培养室的空气等要彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌操作，各种物品拿入操作台前应消毒，用洒精擦表面，用前于紫外线照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时禁止讲话。

温度：组织培养的最适温度为35-37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时死亡，温度在43℃以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响较小，细胞臵于25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放在4℃数小时之后，再臵37℃培养，细胞仍能继续生长。

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气体：气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。O2参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。CO2既是细胞代谢产物也是细胞所需成分。它主要与维持培养液pH值有直接关系。

pH值：多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可产生有害的影响。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐/ CO2。细胞代谢产生的各种酸使pH下降，而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH增加。

培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大。它们只有贴附于不起化学作用的物体的表面时，才能生长、生存或维持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡1至7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水过洗2次，烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1N HCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照射消毒；新橡皮塞须先用1/2NnaOH煮沸15分钟，冲洗后再用4%HCL煮沸15分钟，清水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压灭菌。

总之，细胞在适当的培养条件下可迅速增殖，但若遇到不良环境细胞会变圆，停止生长，甚至死亡，这是细胞的保护机制。综上所述，细胞培养的基本条件主要包括了营养液、无菌条件、PH、温度、气体条件和培养器皿的清洁度。

培养液水质

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配制培养液前要制备纯净的水。

平衡盐溶液

组织培养中所用的各种平衡盐溶液主要有三个功效：作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压;提供缓冲系统，是培养液的酸碱维持在培养细胞生理范围内;提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子。

因此，平衡盐溶液的组成和含量应符合如下条件：要与培养物来源的动物血清相近似；呈溶液状态，利于物质的传递和扩散；是等渗的，否则会引起细胞的收缩（高渗透压）和膨胀（低渗透压）. 2.2.2无血清培养

无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。

无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。以ＤＭＥＭ基础培养基，并添加了维生素Ｃ、转铁蛋白、乙醇胺、羟基丁酸钠等成分。

无血清培养基的组成及其主要补充成分:激素和生长因子

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、结合蛋白、贴壁因子和扩展因子、低分子量营养因子、微量元素。

特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装臵制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。

为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞： （1）处于对数生长中期 （2）>90% 活细胞率

（3）适应时以较高的起始细胞接种 3细胞培养方法与操作 3.1细胞培养方法

固定化培养方法

在动物细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活力，更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白，因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。由于动物细胞的极度敏感性，上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性，另外多糖(如卡拉胶等)由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害。

微载体细胞培养法是一种用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒(微载体)，使细胞在微载体表面附着和生长，并通

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过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1 g 微载体其比表面积可达6000 cm2，从而可实现细胞的高密度培养。

微载体的直径在60~250 靘，由天然葡聚糖、凝胶或各种合成的聚合物组成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性，在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质，因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。 3.1.1微载体培养原理与操作

原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。

细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。黏附主要是靠静电引力和范德华力。细胞能否在微载体表面黏附，要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。

搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。 3.1.2蛋白质作基质的微载体

明胶微载体，用明胶水溶液与疏水性有机液体如矿物油，明胶混合即聚结成微珠，继用戊二醛交联，最后用NaBH4还原，即得到淡黄色明胶

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微载体。这种微载体，具有优良的表面性质和光学性质，比重略大于水，基质是非刚性，无毒，能与多种细胞自然配位结合。特别是培养上皮形态细胞，如用其他基质微载体，收获细胞非常困难，但用明胶微载体时，用胶原酶消化细胞-微载体，明胶即完全溶解于消化液中，游离细胞悬浮在液体上层，收获很容易，且活细胞收率可达98%。所以，明胶微载体，是培养贴壁依赖细胞的一种优良微载体。Corning GlassWorks新近修饰了明胶基质，合成新的明胶微载体，培养后的细胞-微载体，用0.13%～0。2%胰蛋白酶或0.4%Dispase溶液消化12分钟，明胶珠即完全溶解。明胶微载体的缺点是能吸附或捕捉培养基中有效营养成分，特别是血清。 3.2操作步骤

3.2.1细胞的无血清驯化

取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95%，开始进行无血清驯化。细胞驯化在转瓶（spinner-bottle）中进行。将无血清细胞培养基和含血清培养基的按1：1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2×105cells/ml的细胞，在37℃、5％CO2培养箱进行培养。

根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一阶段可稳定传代1－3代，接种密度维持在2×105cells/ml。逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2- 4×105cells/ml。直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大

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培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO种子细胞库。

连续适应

分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到SAF-CHO-G-004细胞培养基中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。

（1）以2倍正常接种密度接种生长活跃的物到75%有血清培养基：25％SAF-CHO-G-004细胞培养基中，传代培养。

（2）当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SAF-CHO-G-004细胞培养基为50∶50的混合培养基中传代培养。

（3）以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SAF-CHO-G-004细胞培养基中传代培养。

（4）当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SAF-CHO-G-004细胞培养基中传代培养。

（5）每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的物应该再次传代培养。

建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SAF-CHO-G-004细胞培养基/有血清混合培养基中进行几次传代。在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SAF-CHO-G-004细胞培养基包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。

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3.2.2微载体培养种子细胞

将上述CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，用培养基调整接种细胞浓度为3×105/mL。沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中37℃，50 r/min 搅拌30分钟静臵30分钟（37℃）。37℃，50 r/min 搅拌2分钟再静臵2～4小时（37℃）（以利细胞贴附） 、37℃，50 r/min 持续搅拌培养每天换液1/2～3/4量，并取样2～3mL，行染色计数连续培养三天细胞在明胶微载体上生长良好，经计数可达1×106/ml细胞浓度，扩增了三倍。基本达饱和密度，此时可以消化传代，进行扩大培养。 3.2.3微载体培养的细胞传代

连续培养3天左右，细胞已基本在载体上铺满，已达饱和，此时为了扩大生产细胞，采用胰酶柠檬酸盐消化，并进行高速搅拌，可成功地将CHO细胞从载体上解离，取样检查，计算解离率。即消化前先取样染色计数的细胞数为分母，消化后取细胞悬液，计数的细胞数为分子，两者进行比较即得解离率。结果解离率可达69%，当细胞扩增至3～4倍时，消化解离效果好。解离的细胞又可扩大再吸附，再进行微载体悬浮培养，细胞密度又可达1×106/mL。

3.3半连续式培养（semi-continuous culture） 操作

半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，

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使反应器内的总体积不变。

这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。

用明胶微载体系统进行细胞培养的放大：

可通过增加微载体的含量或培养体积进行在DMEM-无血清培养基中用半连续式培养（semi-continuous culture） 操作进行放大。 4细胞培养过程中检测 4.1细胞生长的检测

细胞计数 消化后的细胞要加入培养液中，制成一定浓度的细胞悬液，在分装入培养容器之前，需计算出细胞悬液的浓度，即细胞数/ｍL悬液。另外也应测定细胞生活状态，区别出活细胞和死细胞数，只有活细胞才有效数值，计算出细胞浓度后，根据拟分装的瓶数和所需浓度，再将细胞悬液稀释进行培养。

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活体染色 台盼蓝活体染色简单易行，是常用检查细胞存活的方法，用台盼蓝染液，染后可见死细胞染成均匀的蓝色，活体细胞不着色。

细胞计数 用血球计数板做细胞计数。根据情况用营养液稀释与否均可。做法是用吸管吸取少许染色的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满盖片下方间隙，勿留气泡。稍后片刻，镜下观察并计算出四角大格内的细胞数，压线只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：细胞数/ｍL原液=四角大格内的细胞总数/4*10000*稀释倍数 4.2细胞常数检查

细胞生长 初代组织培养或细胞悬液接种以后，都有一个长短不同的潜伏期。一般在第二天就可见细胞生长，一周就可接连成片。

细胞生长的四个阶段

游离期：刚接种后，细胞在培养液中呈悬浮状态，此时细胞胞质回收，胞体变圆形。

吸附期：为细胞贴附于培养壁过程。 繁殖期：生长期。

退化期：当细胞长满瓶壁以后，如不及时做传代，由于营养物消耗和代谢物积累，细胞进入退化期。

细胞形态 生长良好的细胞，在一般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜，才能看见细胞的细微形态。

营养液：在正常情况下，培养液呈桃红色 4.3CHO细胞培养内污染物的检测

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4.3.1细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测

常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒臵显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。

如果培养无真的细菌污染，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。 4.3.2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测

微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。

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4.3.3支原体污染对细胞影响及污染物的检测

细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题,是细胞培养最常见的、干扰试验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在被应用。研究表明，95％以上是以下四种：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。 5抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用

生物反应器动物细胞大规模生产过程中，细胞凋亡在细胞死亡中占主要部分。最近研究显示在大规模培养生物反应器中细胞的死亡中80%是凋亡所导致,而不是以前所认为的坏死。而在大规模细胞培养中，细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍。理论上讲，防止或延长细胞死亡，可以极大提高生物反应器生产重组蛋白的产量。

细胞凋亡由一系列基因精确地调控，是多细胞生物发育和维持稳态所必需的生理现象。已知凋亡的最终执行者是Caspase家族，它们均为半胱氨酸蛋白酶，各识别一个4氨基酸序列，并在识别序列C端天冬氨酸残基处将底物切断。Caspase含有可被自身识别的序列，可以切割活化自身而导致信号放大，并作用于下游Caspase成员，从而形成Caspase家族的

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级联放大，最终作用于效应蛋白，引起细胞凋亡。 5.1 营养物质抗凋亡

在常规生物反应器构造中，营养耗竭或缺乏培养基中特殊的生长因子则引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗尽。培养基中添加氨基酸或其它关键营养可抑制凋亡、延长培养时间从而提高产品的生产。大规模培养中细胞凋亡主要由于营养物质的耗竭或代谢产物的堆积引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。 5.2 基因抗凋亡

与凋亡相关的一系列基因产物可对其进行正、负向的调控，因此可通过导入相应基因来调节细胞凋亡的机制。Bcl-2基因是目前最为有效的抗凋亡基因，在多种细胞系中均表现出很强的抗凋亡活性。 5.3 化学方法抗凋亡

凋亡发生时细胞许多部位发生生化物质的改变，有些变化如改变细胞氧化还原条件产生活性氧在凋亡信号阶段发生，其它的如破坏线粒体膜电位、激活caspase则发生在凋亡效应阶段，这在绝大多数细胞死亡中是相同的。因此,阻止这些生化物质的改变可能阻止或至少延迟细胞凋亡的发生，运用化学物质可抑制信号效应阶段的发生，被认为是抗调亡策略之一。

[展望]

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通过几十年的发展至今，CHO细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，这种局面人将持续并且其所占比例有逐年增大趋势。CHO细胞大规模培养技术及其生物反应器工程可广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。国家重点实验室在动物细胞大规模培养技术及其生物反应器工程研究和开发应用方面，长期以来得到国家重大科技攻关计划、863计划等的大力支持，拥有一支精干的研究开发团队和一系列现代化设备仪器，建立了由无血清悬浮培养技术、培养过程及生物反应器设计放大与强化技术、大规模高密度流加和连续灌注培养技术、培养过程计算机实时监测与控制技术、病毒类产品大规模高效生产技术等核心技术组成的大规模动物细胞培养技术及其生物反应器工程平台。而大规模的细胞培养在药物产品的生产方面具有重大的价值。

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