实验十 微生物鉴定中常用的生理生化试验

实验十 微生物鉴定中常用的生理生化试验

摘要

本次实验包括大分子水解试验、糖发酵试验和IMViC试验（吲哚、甲基红试验）三类试验，根据要求本实验使用六种培养基分别对所需菌种组合进行了大约24h的培养，之后按照实验要求进行各个试验。最后观察到了实验现象，了解了所用菌种鉴别的方法和原则。

关键词

微生物鉴定；生理生化试验；大分子水解试验；糖发酵试验；IMViC试验

前言

类的微生物有着不同的代谢类型，例如对一些物质的分解能力及分解代谢的产物的不同反映出他们不同的生理特征，这些特征可以用来对不同种类微生物进行鉴定和分类。因此可以对微生物的不同生化反应进行试验，以此证明微生物生理特征的多样性，证明微生物分类鉴别的依据。生理生化试验相比其他鉴别方法而言相对简便、快捷、经济实用，在一般的实验室中都可以进行，因此在微生物种类的初步鉴别中被广泛使用。

一、 实验目的

1、大分子水解试验

证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统，掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 2、糖发酵试验

了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 3、IMViC试验

了解IMViC的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。

二、 实验原理

在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes）.许多细菌产生胞外酶(exoenzymes)，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1、 大分子水解试验：

微生物对大分子如淀粉、蛋白质和油脂不能直接利用，必须依靠产生的胞外

酶将大分子物质分解后才能被微生物吸收利用。微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可以改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。 2、 糖发酵试验：

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应。在肠道细菌的鉴定上尤其为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3、IMViC试验 吲哚试验：

用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。

吲哚对二甲基氨基苯甲醛反应：

甲基红试验：

用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（PH6.3）转变为红色（PH4.2），即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个实验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上还是有价值的。大肠杆菌和产气肠杆菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养的后期仍能维持酸性PH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大约6。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

三、 实验材料

1. 菌种

（1）大分子物质水解试验

枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌。 （2）糖发酵试验

大肠杆菌，普通变形杆菌。 （3）IMViC试验 大肠杆菌，产气肠杆菌。 2.培养基

固体淀粉培养基，固体油脂培养基，葡萄糖发酵培养基（附德汉式小管），乳糖发酵培养基（附德汉式小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂

革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。 4.仪器和其他用品

无菌平板，无菌试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管，德汉氏小管等。

四、 实验步骤

A、大分子水解试验 1、淀粉水解试验

（1）配制固体淀粉培养基，高温蒸汽121℃灭菌20min，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板；

（2）用记号笔在平板底部划成四部分，并标明1、2、3、4；

（3）无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和普通变形杆菌分别在不同的区域点种，贴标签纸，注明每一区域对应接种的菌种； （4）将平板倒置，在37℃温箱中培养1～2d；

（5）观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。

如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。 2．油脂水解试验

（1）配制固体油脂培养基，高温蒸汽121℃灭菌20min，待培养基冷却至50℃左右，无菌操作制成平板；

（2）用记号笔在在平板底部划成四部分，并标明1、2、3、4；

（3）无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和普通变形杆菌分别在不同区域划十字接种，贴标签纸，注明每一区域对应接种的细菌； （4）将平板倒置，在37℃温箱中培养1～2d； （5）取出平板，观察菌苔颜色。

如果出现红斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。

B．糖发酵试验

（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名； （2）取葡萄糖发酵培养基试管5支，分别接入大肠杆菌2支、普通变形杆菌2

支，第5支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基5支，同样分别接入大

肠杆菌2支、普通变形杆菌2支，第5支不接种，作为对照； （3）将已接种的和作为对照的10支试管均置37℃中培养1～2d； （4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 C．IMViC试验

1、吲哚试验

（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明培养基的名称和所接种的细菌菌名； (2)取5支蛋白胨水培养基试管，分别接入大肠杆菌2支、产气肠杆菌2支，第5支不接种，作为对照；

（3）将已接种的和作为对照的5支试管均置37℃中培养1～2d；

（4）向蛋白胨水培养基内加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上

升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状

物为阳性反应。

配蛋白质水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白胨水 解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。 2、甲基红试验

（1）用标签纸在各试管外壁上分别标明培养基的名称和所接种的细菌菌名； (2)取5支葡萄糖蛋白胨水培养基试管，分别接入大肠杆菌2支、产气肠杆菌2支，第5支不接种，作为对照；

（3）将已接种的和作为对照的5支试管均置37℃中培养1～2d；

（2）向葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。

五、实验报告

1、实验结果

（1）大分子水解试验

淀粉水解试验结果记录表（“+”表示阳性，“-”表示阴性） 菌名 枯草芽孢杆菌 阴/阳性 + 结论 可以水解淀粉 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 普通变形杆菌 菌名 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 普通变形杆菌 （2）糖发酵试验

- + - 阴/阳性 - - + - 不可以水解淀粉 可以水解淀粉 不可以水解淀粉 结论 不可以水解油脂 不可以水解油脂 可以水解油脂 不可以水解油脂 油脂水解试验结果记录表（“+”表示阳性，“-”表示阴性）

糖发酵试验结果记录表（“+”表示产酸或产气，“-”表示不产酸或不产气） 培养基 变化 大肠杆菌 普通变形杆菌 对照 颜色变化 葡萄糖发酵培养基 是否产气 阴/阳性 结论 颜色变化 乳糖发酵培养基 （3）IMViC试验

IMViC试验结果记录表（“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应）

试验名称 菌名 吲哚试验 甲基红试验 大肠杆菌 产气肠杆菌 对照 + - - + - - 是否产气 阴/阳性 结论 黄色 是 + 黄色 是 + 可以分解乳糖 黄色 是 + 紫色 否 - 不能分解乳糖 紫色 否 - 对照组 紫色 否 - 对照组 可分解葡萄糖 不能分解葡萄糖 2、思考题

（1）你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？

答：①淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要高耗能的胞吞作用。因而通过胞外酶的作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效。 ②试验中出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌产生的胞外的淀粉酶起的作用。

（2）不利用碘液，你能否证明淀粉水解的存在?

答：由于淀粉水解生成葡萄糖，即多羟基醛，因此可利用醛的性质进行检验，如银镜试验，斐林试验等。呈阳性者，说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。

（3）假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？

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