Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(12):89~93

Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展

张 雪

1,2

*

温廷益

2**

(1天津科技大学生物工程学院 天津 300457 2中国科学院微生物研究所 北京 100101)

摘要 Red重组作为一种新的重组系统已经被广泛用于大肠杆菌的基因敲除、基因替换。与传统的Rec重组相比,Red重组具有同源臂短,重组效率高等优点。分别详细介绍了Red重组系统中Exo、Beta、Gam3种蛋白质的功能,Red重组系统运用于大肠杆菌基因敲除的3种质粒及其功能,同时概括了Red重组的技术要点及技术难点,分析了文献报道的阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间、转化后的复苏温度及时间、引物同源臂长度对于重组率的影响,总结出了Red重组的最佳条件。关键词 Red重组 大肠杆菌 基因敲除 同源臂 L-阿拉伯糖

中图分类号 Q819

同源重组作为体内基因工程的新方法使DNA修饰变得更容易、更有效,它是功能基因组分析的高效方法,可以在没有限制性内切酶和DNA连接酶的情况下实现DNA修饰

[1]

的末端,从5!向3!降解DNA单链,产生3!末端单链悬突(3!single_strandDNAoverhangs)

[3]

[Carter等

(1971)]。Beta作为单链退火蛋白,结合在由核酸外切酶(Exo)外切产生的3!末端单链悬突上,促进DNA互补链的退火

[4~6]

。

传统同源重组方法是利用RecA重组系统,但是以RecA同源重组为基础的基因敲除有很大的不足,如需要较长的靶基因同源臂,重组率很低,很难获得所需要的重组子等。

1998年,Murphy首次报道了利用 噬菌体Red

[2]

。Gam蛋白作为Exo、Beta的辅助蛋

[7]

白,可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制RecBCD核酸外切酶活性,抑制体内的外源DNA的降解

。

RecBCD是高度ATP依赖的双链DNA核酸外切酶,在大肠杆菌中用于基因的同源重组和DNA复制叉的修复。研究表明,Gam蛋白对于反应进行中的RecBCD双链DNA核酸外切酶的抑制作用很小。事实上,Gam蛋白并不能抑制一个正在进行的反应,而是在ATP的存在下分离连在双链DNA末端的RecBCD。

[8]

重组系统在大肠杆菌染色体上进行基因替换的方法,将 噬菌体的重组功能基因exo,bet,gam在多拷贝质粒上表达,用于野生型E.coli宿主菌的基因替换。近年来,Red重组以其较短的同源臂和较高的重组效率等优点广泛用于大肠杆菌的基因修饰中。

Red重组系统在大肠杆菌等一系列基因工程菌的基因修饰中发挥了重大的作用。本文将从Red重组的作用机理,相关质粒,技术方法及国内外研究应用等方面进行讨论。

2 Red同源重组相关质粒的介绍

Red重组系统共需要3种质粒:一种质粒是同源重组辅助质粒,其提供协助同源重组的exo、bet、gam3个基因,用于表达重组系统的3个蛋白;另一种质粒含有两侧带有翻转酶结合位点(flipaserecognitiontarge,tFRT)的抗性基因,用作PCR模板;最后一种质粒为抗性基因消除质粒,其含有重组酶,用于消除染色体上同源重组的抗性基因。本文将介绍几种最常用的相关质粒。

2.1 同源重组辅助性质粒pKD46、pRedET

46敏的制起ori,1 Red同源重组的作用机理

Red同源重组由 噬菌体的exo,bet,gam3个基因组成,分别编码Exo、Beta、Gam3种蛋白质。

Exo作为双链核酸外切酶,可以结合在双链DNA

收稿日期:2008 06 25 修回日期:2008 08 22*国家 863 计划(2006AA02Z216)资助项目**通讯作者,电子信箱:wenty@

30 培养时可以正常复制,而高于37 时会自动丢失。在pKD46上还含有受ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因,它们通过L 阿拉伯糖诱导表达,并携带氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记(图1)

。

pRedET含有oriR101温度敏感型复制子,在30 复制。带有受pBAD启动子调控 噬菌体的red , ,!3个基因,通过L 阿拉伯糖诱导表达。pBAD同时受araC基因产物的正调控和负调控,araC作为转录阻遏物可以与L 阿拉伯糖形成复合物,从而启动转录。2.2 提供抗性片段的质粒pKD3/pKD4

pKD3含有氯霉素抗性基因,且在抗性基因两侧有FRT位点,常在Red重组系统中作为抗性标记使用。pKD4作用机理与pKD3相同,抗性标记不同于pKD3的氯霉素,为卡那霉素抗性(图2)。2.3 抗性基因消除质粒pCP20

pCP20含有温度敏感型的复制起点,同时带有氨苄青霉素和氯霉素抗性。pCP20上含有一个翻转酶重组酶(flipaserecombinationenzyme,FLP)基因,FLP重组酶可以与FRT位点结合,在FLP重组酶的作用下,FRT位点自身发生同源重组,从而消除一个FRT位点及抗性基因(图3)。重组酶FLP在42 时诱导表达,同时质粒也逐渐消失

[9,10]

图1 pKD46质粒图谱Fig.1 ThemapofpKD46

。

图2 质粒pKD3(a)与pKD4(b)图谱Fig.2 ThemapofpKD3(a)andpKD4(b)

3 Red同源重组的技术方法及技术难点

Red重组系统共需要设计两对引物,即带同源臂的抗性基因扩增引物和鉴定引物。带同源臂的抗性基因扩增引物可以扩增两侧带有FRT位点的抗性基因片段,并在FRT位点的外侧加入同源臂,其扩增产物可以通过同源重组将抗性片段替换掉拟敲除的目的基因。具体的技术路线如图4。

与Rec同源重组方法相比,Red重组系统的同源臂,Red可以直接将同源臂设计在引物上,免去了添加酶切位点或重叠延伸PCR(genesplicingbyoverlapextensionPCR,SOEPCR)等操作。鉴定引物用于鉴定目的基因是否被成功地替换为抗性基因,通过PCR检测两个目的位点之间的距离判断菌体是否进行了重组,通常设计在同源臂外侧的基因上,但如果敲除基因片段与插入片段长度相似,则无法通过该方法进行检测。理论上,可以将鉴定引物分别设计在同源臂的内侧和外侧,但目前尚未有文献报道,可能是在PCR鉴定过程中无

表1 引物同源臂长度

Table1 Thelengthofprimerhomologousarms

国内外文献报道Red载体系统白光兴等(2005)Serra等[11]Liu等

韩聪等(2004)Lee等

[13][12]

抗性模板pKD3######pFK3pKD3或pKD4

pKD3###

引物同源臂的长度

45nt280nt200~500nt

40nt48~58nt40~55nt36~50nt

pKD46pKD46BACspKD46pKD46pBR322 RedpKD46

陈伟等(2005)Datsenko等

[9]

酸外切酶活性,但由于其抑制作用并非完全抑制,RecBCD会留有一部分活性,而且体内还有其他核酸外切酶,例如,RecQ和RecJ。长度较短的同源臂容易被这些核酸外切酶降解,导致重组效率偏低

[14]

。

根据国内外有关文献报道,我们经过条件优化,将同源臂的长度设计为56nt,转化后长出的假阳性很少,转化子70%均为重组子,无论从转化子的数量及假阳性比例都可满足实验的要求。

由于用于同源重组的DNA片段为PCR产物,可能有模板的干扰而导致转化子假阳性偏高,通常用DpnI对PCR产物酶切。DpnI能对甲基化的GATC酶切,因为PCR产物不会甲基化,而模板一般为质粒或基因组,在体内会甲基化,所以用DpnI对PCR产物进行酶切以消除模板的干扰效果甚佳。

Red重组中感受态细胞的优劣也是影响重组效率的关键因素之一。许多文献都对制备感受态细胞时,L 阿拉伯糖的诱导浓度及诱导时间和转化后的复苏时间做了优化试验(表2)。 Serra Moreno等

[11]

通过试验发现,转入重组片段后

复苏3个小时,在37 复苏得到的转化子多于30 复苏的转化子。pKD46在37 生长时虽然会丢失,但其表达的蛋白仍可以继续维持进行同源重组,而大肠杆菌在37 的生长速度快于30 ,这可能是造成37

对于要敲除的目的基因,其引物同源臂的长度是影响重组效率的最主要原因。同源臂短,可能造成敲除的失败或产生大量的假阳性结果。同源臂越短,通过抗性筛选到的转化子的假阳性就越多;而同源臂过长,则会造成引物合成的成本几倍或十几倍增长且合成时间过长,影响研究进度。目前,国内外通过Red重组进行基因修饰所使用的引物同源臂长度主要在40~60nt之间(表1)。

同源臂的长度影响重组率的高低主要和菌体内的amecBCD表2 L 阿拉伯糖的诱导时间及浓度、转化后复苏的

时间及温度

Table2 TheconcentrationandL arabinoseanditsinducingtimeandrecoverytimeandtemperatureaftertranslation

国内外文献报道

L 阿拉伯糖

诱导浓度30mmol/L30mmol/L10mmol/L

L 阿拉伯糖

复苏时间复苏温度

诱导时间###60min90min######

1~3h60min1h###1h

37 37 30 ###30

Serra Moreno等[11]100mmol/L白光兴等(2005)付小花等(2007)

Lee等

[13]

韩聪等(2004)###

复苏产生更多转化子的原因。在操作过程中,复苏后取一定的菌液涂布后,可将剩余的菌液继续培养过夜,如初次复苏没有得到转化子,可以继续涂布过夜培养的菌液。

白光兴等(2005)根据试验得出L 阿拉伯糖在浓度高于120mmol/L时,细菌生长会受抑制,而诱导时间要在40min以上才能保证重组效率。

我们根据国内外文献报道,对L 阿拉伯糖的诱导浓度作了优化。分别用不同浓度的L 阿拉伯糖诱导Red重组酶表达。实验证明,感受态细胞在浓度为100mmol/L的L 阿拉伯糖诱导后,可得到更多重组子。最终确定,L 阿拉伯糖诱导时间为90min,37 复苏2h。 此外,同源重组后的菌株,需要电转入pCP20用以消除抗性基因。我们的试验结果表明,将pCP20转化进重组后的菌株中所长出的转化子有80%均为消除抗性基因的重组子,反敲效率较高。

的位置有关

[16]

图5 sacB同源重组Fig.5 sacBrecombination

。如果改为短同源臂,就可以一次PCR

扩增出片段1,而片段2直接合成即可,大大节省了实

4 问题与展望

近年来,Red重组已经发展成为一套比较成熟的重组系统,以重组效率高和方法简便著称。对Red重组的改进方法主要是对Red载体系统的改造来提高其重组率。例如,Datta等

[1]

验时间,增加了实验效率。

但是,这种方法同样存在缺点。第一次同源重组的效率较低,原因可能为,sacB基因在没有蔗糖存在的情况下对E.coli也有一定的毒性,第一次同源重组时,多表现为sacB失活的突变,从而导致添加蔗糖筛选消除sacB的重组子时出现假阳性。

Red重组技术虽然已比较完善,但是对于Red重组的某些更深层次的机理还有待研究,例如,虽然我们已经知道Gam蛋白可与RecBCD核酸外切酶结合,抑制RecBCD核酸外切酶活性,然而其精确的抑制机制还不清楚,有待进一步研究。

目前,Red重组技术大多数应用于大肠杆菌的基因修饰中。有人曾在沙门氏菌(Salmonella),痢疾杆菌(Shigellaflexneri)等菌中利用Red重组进行基因敲除,但在其它菌种例如枯草芽孢杆菌中,还是运用其自身的重组系统,难摆脱其重组效率低、操作复杂等缺点。所以,如何对Red重组系统进行改造,使其可以在大多数细菌中运用将成为今后Red重组的主要研究方向。 随着基因工程研究的不断深入,Red同源重组作为一种高效的打靶技术,其应用范围将越来越广泛,将使基因修饰(尤其是基因敲除技术)技术的发展得到进一步的完善。

通过缺口修复和交换质粒原点

的方法构建了一套在革兰氏阴性菌中表达重组功能的质粒,这些质粒包括一个复制起点和由Red基因(exo,bet和gam)组成的 噬菌体基因组片段。还有人在敲除一个基因的同时引入另一个基因,即基因敲入(geneknocking)。即在FRT位点 抗性基因后连入一个要敲入的基因,与抗性基因一起重组到染色体上。 但是,Red重组系统也有缺点。利用Red重组进行基因敲除后,会在目的菌株基因组的敲除位点留下几十至一百个碱基的外源片段,包括一个FRT位点。Zhang等

[15]

将B.subtilissacB基因连在抗性基因上,通

过两次同源重组,分别用抗性和添加蔗糖来筛选重组子,可以在不引入外源基因的基础上敲除基因(图5)。 这种重组方法需要两个DNA片段用于重组:片段1:同源臂#抗性基因 sacB#同源臂;片段2:同源臂#同源臂。Zhang等Mizoguchi等

[16]

[15]

选用500nt长的同源臂,通过酶

切连接的方法构建出两个DNA片段。操作比较复杂。

通过overlappingPCR构建两个DNA片和Mizoguchi等

[16]

段,虽然方法比前者简便,但是也增加了PCR的错误率。Zhang等

[15]

参考文献

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张 雪等:Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展

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ZHANGXue

1,2

WENTing yi

2

(1TianjinUniversityofScience&Technology,SchoolofBiologicalEngineering,Tianjin 300457,China)

(2InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing 100101,China)

Abstract Asanewrecombinationsystem,RedrecombinationhasbeenwidelyusedinE.coligeneknockou.tComparingwithRecrecombination,Redrecombinationhastheadvantagesofexploringshorthomologousarmsandhighrecombinationrate.Thelengthofhomologousarmsusuallyare36~60n.tThefunctionofExo,BetaandGamproteinsinRedrecombination,threekindofplasmidsandtheirfunctionsinE.coligeneknockoutsystemwerereviewed.Thethreekindofplasmidsareplasmidwhichhasexo,bet,gamforRedrecombination,plasmidwhichhasresistancetagandFRTsiteforPCRtemplateandplasmidwhichhasFLPrecombinaseforeliminatingresistancetag.TheconcentrationandinducingtimeofL arabinoseandthelengthofhomologousarmsbyliteratureminingweresummarized,andtheoptimalparameterswasproposed.TheoptimalconcentrationandinducingtimeofL arabinoseare100mmol/Land90min,homologousarmsis56n.t

os L andtheoptimallengthof

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/z28e.html