益气润肠通便颗粒醇提

1.仪器与试药

1.1仪器

Waters2695-2996高效液相色谱仪(在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器；美国Waters公司)、Empower色谱数据工作站(美国Waters公司)；LC-10ADVP型高效液相色谱；Millipore-Q超纯水制备仪(密理博公司，法国)；FA1104 型电子分万，上海精密科学仪器有限公司)；MS105DU型电子分析天平(1/10万，梅特勒-托利多公司)；KQ-500E型医用超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）；数恒温水浴锅HH-4（国华电器有限公司）；TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2试药

黄芪甲苷对照品（批号110781-200613）购自中国药品生物制品检定所、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号111920-201304）购自中国食品药品检定研究院。

黄芪、火麻仁、白术、枳壳、肉桂饮片均来自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，批号均为141203批。五味药的饮片按照2010版《中国药典》一部规定从性状、鉴别、检查、含量测有限公司化工分公司)；乙腈(色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司)；正丁醇、氨水为市售分析纯；水为超纯水。

2.实验与方法

2.1黄芪、火麻仁醇提工艺研究

根据工艺文献研究表明，黄芪、火麻仁等药材的有效成分为脂溶性物质[1-2]，以乙醇为溶媒，可以有效的提取出来[3-4]。 2.1.1黄芪、火麻仁醇提工艺正交试验

称取处方两倍量的饮片，黄芪24g，火麻仁20g，共9份，按表1-1、1-2相应的因素水平回流提取，合并滤过液，水浴浓缩成浸膏，要求无醇味，取样测定浸膏中浸出物得率、黄芪甲苷及毛蕊异黄酮苷的含量，进行方差分析，结果见表1-3、1-4。

测定的色谱条件为：照2010年版《中国药典》一部附录VID[5]测定。 黄芪甲苷：色谱柱为Diamonsil C18色谱柱( 250mm×4. 6 mm，5μm)；流动相为甲醇一水溶液(79：21)；流速1.0ml/min；ELSD检测器，温度90℃，气体流量2.20SLPM[6]。

对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.48mg的溶液，即得[6]。

供试品溶液的制备：约取相当于4.0g的黄芪生药的稠膏，精密称定，残渣加水30ml，超声溶解，水溶液转移至分液漏斗中，加水饱和正丁醇振摇萃取4次，每次40ml，合去氨试液，分取正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加蒸馏水5ml，使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱长为12cm)，用水50ml洗脱，弃去水液，再％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继续使用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。进样量：10ul。运用外标两点法计算含量[6]。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷：色谱柱为Diamo洗脱；流速1.0ml/min；时间0～20min，A相20～40%，B相80～60%；检测波长为260nm[6]。

对照品溶液的制备： 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.046mg的溶液，即得[6]。

供试品溶液的制备当于1.0g的黄芪生药的稠膏，精密称定，精密加入甲醇50ml，称定重量，然后超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足缺失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25ml，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，加刻度，摇匀，即得[6]。进样量：10ul。运用外标两点法计算含量。

结果表明：以浸出物含量作为考察指标，由表1-2、1-3分析可知，各因素对浸出物含量的影响均没有显著性差异，采用直观分析法可知，各因素影响程度为A>D>B>C，提取工艺以A1B3C3D3为佳；以黄芪甲苷含量作为考察指标，由表1-2、1-4可知，各因素的影响程度为D>B>C>A，由表1-4方差分析结果表明，D因素（提取次数）对黄芪甲苷含量的影响具有显著性差异，A、B、C因素无显著性差异，提取工艺以A1B3C3D2为佳；以毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为考察指标，由表1-2、1-5分析可知，各因素对毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的影响均没有显著性差异，采用直观分析法可知，各因素影响程度为A>C>D>B，提取工艺以

A1B3C3D2为佳，以中药提取液中有效成分的含量为主要考察因素，兼顾节约时间提高效率，综合浸出物、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷方差分析结果，并结合实际生产，确定最佳醇提工艺条件为A1B3C3D2 ，即乙醇浓度为60%，取12倍量，分两次提取，每次两小时。

2.1.2 黄芪、火麻仁等最佳醇提工艺条件的验证试验

称取处方四倍量的饮片，黄芪24g，火麻仁20g，共3份，按正交试验得到的最佳工艺条件提取，即加饮片总量12倍量的60%乙醇，分两次提取，每次两小时。提取液过滤，合并，水浴加热，浓缩至无醇味，取样测定浸膏中浸出物得率、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷的含量。结果见表1-6。

表1-6 醇提验证工艺结果

由表1-6可见，验证实验结果与优选工艺期望值基本一致，表明该工艺稳定可行，重复性好。

2.2 挥发油提取工艺研究

白术中有效成分主要为挥发性成分，此外，还有苷类，多糖等[7]。枳壳有效成分主要为挥发油类，此外，还有黄酮类、生物碱类、香豆素类等[8]。肉桂有效成分主要为挥发油类[9]，药典对肉桂药材中挥发油含量有明确规定[10]。 2.2.1挥发油提取粒度及提取时间的考察

分别称取处方四倍量的不同规格的饮片粉末，加入10倍量的水，浸泡1小时，开火煎煮，待沸腾以后，从第一滴油下落时开始计时，每隔一小时记录一次挥发油的量。结果见图2-1。 由图2-1分析可知：

①饮片粉碎的粒度的变化对挥发油提取效率有很大的影响，饮片粉碎至过三号筛已能够达到较高提取量，再提高饮片粒度会增加粉碎成本，且粒度过细不利于后续工艺进行。因此，本工艺研究选择粗粉即可。

②挥发油提取时间达到7小时，已基本提取完全，结合生产实际，最终确定正交实验中蒸馏时间考察水平为6、7、8小时。 2.2.2挥发油提取工艺的优选

以挥发油提取得率为指标，通过L9(34)正交试验，考察饮片加水量、浸泡时

间、提取时间等主要因素对挥发油提取量的影响，通过预实验及文献查阅，选取三个水平，见表2-2。

表2-2 挥发油提取正交因素水平表

称取称取处方两倍量的饮片粗粉，白术60g，枳壳20g，肉桂6g，共9份。按表2-1相应的因素水平，照2010年版《中国药典》一部附录XD项下方法测定。将称量完成的饮片置烧瓶中，加水适量振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，保持微沸。待达到规定的小时数，停止加热，放置片刻。开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度线0上面5mm处为止。放置1小时以上，再开启活塞使油层下降至其上端恰与刻度线齐平，读取挥发油量[11]。用每份正交样品所得挥发油体积为指标，结果进行方差分析，得出挥发油提取的最佳工艺。测定结果见表2-3。

注：F0.05(2,2)=19.00；F0.01(2,2)=99.00

结果表明：以挥发油体积为考察指标，由表2-3、2-4可知，各因素的影响程度为A>B>C>D，由表2-4方差分析结果可知，各因素对挥发油体积的影响均无显著性差异，故采用直观分析法，结合各因素不同水平相应的Ki值，因素A2>A3>A1, B1>B3>B2, C3=C2>C1，又因为C2与C3相等，考虑生产实际，时间短的能源耗费低，所以选择C（，最终确定最佳的挥发油提取工艺为A2B1C2，27小时）即饮片打成粗粉，加入6倍量水，浸泡1小时，水蒸气蒸馏7小时。 2.2.3挥发油最佳提取工艺的验证

称取称取处方两倍量的饮片粗粉，白术60g，枳壳20g，肉桂6g，共3份。按上述挥发油最佳提取工艺条件，照《中国药典》2010年一部附录“挥发油测定法”项[11]下方法测定。测定结果见表2-5。

由表2-5可见，挥发油含量在药典可测定范围内（0.5～1.0ml[11]），所以实验结果是可靠的，并且与优选工艺期望值基本一致，表明该工艺稳定可行，重复性好。

3.小结与讨论

3.1 讨论

3.1.1提取方案的初步确定

根据文献资料整理、分析可知，黄芪主要含有皂苷类、黄酮类和多糖等成分，而其中黄芪甲苷是其主要有效成分，具有增强免疫功能、抗肿瘤、保肝等药理作用[12]。火麻仁主要活性成分为油脂、蛋白质、挥发油、膳食纤维以及维生素和矿物质等多种成分，脂肪油是其主要活性成分。具有抗溃疡、治疗便秘和泻下等药理作用[2]。以上两味药的有效成分均为脂溶性成分，兼顾此药为内服颗粒剂，因此采用乙醇回流提取，进行正交试验优选提取工艺。

白术、枳壳、肉桂三味药有效成分均为挥发油类，通过文献资料比较，采用水蒸气蒸馏法提取，能较好的提出有效成分[13-15]。 3.1.2醇提工艺的研究

在醇提工艺研究的各项考察指标中，主要选取的是黄芪甲苷及毛蕊异黄酮苷的含量，这些指标用于评价黄芪单味药是足够的，但火麻仁作为复方中的臣药，通过文献资料查阅可知火麻仁有效成分为油脂类，本次实验研究中并未将其含量作为考察指标，所以此工艺对油脂含量的影响有待进一步研究。

在醇提工艺验证实验中，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷的含量约为正交实验研究时的两倍，而浸出物含量几乎持平，其原因为进行验证实验时所用饮片量为原方的四倍，如此取样是为方便后续工艺的研究。

3.1.3挥发油提取工艺的研究

在提取挥发油的过程中，出油较快且较多的时间段在前5小时内，提取至7小时，挥发油已经基本提取完全。

本次实验所得的挥发油冷却至室温时，流动性变差，而且粘壁现象严重，后决定采用乙醚萃取，再在40℃下水浴加热，挥干乙醚，最终所得的挥发油流动性较好，取用方便。

挥发油测定器在使用前必须洗干净烘干，否则在挥发油提取过程中极易发生粘壁现象，牢牢地粘在支管中，影响读数。 3.1.4含量测定

本实验中虽然涉及含量测定，但未进行方法学考察，原因是：根据2010版药典中有关方法学考察内容指导原则，只有在建立中药质量标准以及在处方、工艺等变更或改变原分析方法时，才需要对分析方法进行验证[16]。本工艺研究为初次制定提取工艺，因此不考虑方法学考察。

3.2小结

3.2.1 醇提工艺优化实验中选择提取次数、提取时间、乙醇浓度及用量等影响提取的关键因素进行考察。结果表明提取次数对实验结果有显著影响，其它因素无显著性差异，考虑实际生产操作最终确定醇提的最佳工艺为: 加饮片总量12倍量的60%乙醇，分两次提取，每次2小时。最后的醇提最佳工艺验证实验结果与预期基本一致，重复性较好。

3.2.2 挥发油提取工艺的优化实验中选择提取粒度、加水量、浸泡时间、提取时间等因素进行考察，以所得挥发油体积作为评价指标。由于通过预实验发现提取粒度对提取所得挥发油体积有较大影响，所以先针对粒度进行单因素的考察，结果表明饮片打成粗粉提取最合适，其余各个因素对实验结果均没有显著影响，通过直观分析以及结合生产实际，最终确定挥发油提取的最佳工艺为：饮片粗粉加入6倍量的水，浸泡1小时，水蒸气蒸馏7小时。最后的挥发油最佳提取工艺验证实验结果也在预期内，重复性较好。

3.2.3 本实验采用高效液相色谱法测定益气润肠通便颗粒中有效成分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，本实验方法能达到有效分离各组分的目的，具有诸多优点，如灵敏度高、操作简便、分离效果好等。

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