TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo_9762 350元)

Code No. 9762 研究用

TaKaRa MiniBEST Agarose

Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0

说明书

v201412Da

目录

内容页码

●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存与运输 1 ●使用前的准备事项 1 ●操作方法 1 ●使用例 3 ●注意事项 3 ● Q&A 4

●制品说明

本试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶溶解Buffer，其具有较强的缓冲性能并含有pH指示剂，方便判断溶液的pH值是否适合与DNA制备膜结合，其溶胶能力很强，无需加热，在室温（15-25℃）条件下即可快速溶解凝胶。本试剂盒结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需20分钟便可完成。使用本试剂盒每次可纯化得到多至20 μg以上的DNA片段（50 bp～20 kb），回收率高达50～80％，20～50 kb的DNA片段回收率略低。经本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。

●制品内容（50次量）

每次处理的胶块量约为300 mg（1％凝胶浓度）时，本试剂盒可使用50次。

本试剂盒分试剂Set与Column Set两部分。

■试剂Set

Buffer GM*150 ml

Buffer WB*224 ml Elution Buffer 2 ml × 2

*1含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。

*2首次使用前，向Buffer WB中添加56 ml的100%乙醇。

■ Column Set

Spin Columns 50支Collection tubes 50支

【试剂盒之外所需准备试剂】

◆无水乙醇

◆灭菌水或Tris-HCl（pH8.0）

◆3 M醋酸钠溶液（pH5.2）

●保存与运输

1.本试剂盒可以在室温下（15-25℃）保存。

2.本试剂盒于室温下（15-25℃）运输。

3.低温状态下Buffer GM可能会出现沉淀，使用前请于37℃加热至沉淀消失并恢复至室温后使用。

●使用前的准备事项

1.首次使用前，向Buffer WB中添加56 ml的100%乙醇。

2.检查Buffer GM是否仍为黄色。

3.试剂中含有变性剂，操作时应佩戴手套等防护用具。

●操作方法

操作流程见图1，全套操作约需20分钟，详细说明如下。

1.使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含

目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块超过300 mg时，请使用多个Column 进行回收，否则严重影响收率。

注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。

-1-

3.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。

4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1μl进行计算。

5.向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：

6.均匀混合后室温15-25℃溶解胶块（胶浓度较大或比较难溶

时可以在37℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分溶

解（约5～10分钟）。

注）胶块一定要充分溶解，否则将会严重影响DNA的回收

率。高浓度凝胶可以适当延长溶胶时间。

7.当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由

黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠

溶液（pH5.2）10μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

8.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9.将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000

rpm离心1分钟，弃滤液。

注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

10.将700 μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000

rpm离心30秒钟，弃滤液。

注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

11. 重复操作步骤10。

12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm

离心1分钟。

13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin

Column膜的中央处加入30 μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。

注）将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

14. 室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。

如果实验室备有适合于Spin Column接口的负压装置，可从上述操作步骤7以后进行以下操作。

8.将试剂盒中的Spin Column插到负压装置的插口上。

9.将上述操作步骤7的溶液转移到Spin Column中，开启调

节负压装置，缓慢吸走Spin Column中的溶液（流速控制在1滴/秒）。

10.向Spin Column中加入700 μl的Buffer WB，吸尽

Column中溶液。

注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

-2- 溶液转移至

将

新

DNA solution

图1. 操作流程简图

11.重复操作步骤10，然后从负压装置上取下Spin Column，将其安置于Collection Tube上。

12.室温12,000 rpm离心1分钟。

13.将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl灭菌蒸馏水

或Elution Buffer，室温静置1分钟。

注）将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

14.12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。

●使用例

1. 500 bp、2 kb、5 kb、10 kb的PCR片段起始量分别为3μg、3μg、2μg、2μg进行1％的琼脂糖凝胶电泳后，使用本试剂盒回收纯化各DNA片段，然后取1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，其结果见图2，回收率高达60％以上。

1％ Agarose凝胶电泳

M1：DL2,000 DNA Marker

1：切胶回收前的500 bp的DNA片段

2：切胶回收后的500 bp的DNA片段

3：切胶回收前的2 kb的DNA片段

4：切胶回收后的2 kb的DNA片段

5：切胶回收前的5 kb的DNA片段

6：切胶回收后的5 kb的DNA片段

7：切胶回收前的10 kb的DNA片段

8：切胶回收后的10 kb的DNA片段

M2：λ–Hin d Ⅲ digest

M3：pUC119 DNA

2. 18 kb的PCR片段起始量为4 μg进行1％的琼脂糖凝胶电泳后，使用本试剂盒回收纯化DNA片段，然后取1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，其结果见图3，回收率高达50％以上。

M 1 2 M

M：λ–Hin d Ⅲ digest

1：切胶回收前的18 kb的DNA片段

2：切胶回收后的18 kb的DNA片段

●注意事项

1.使用前请确认Buffer WB中是否加入指定体积的乙醇。

2.切胶时切忌胶块过大，应尽量减小凝胶体积，否则会影响DNA收量。

3.DNA需长期保存时，建议在Elution Buffer中保存。

4.纯化的DNA用于DNA序列分析时，最好使用灭菌水洗脱DNA。

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M1 1 2 3 4 5 6 7 8 M2 M3

图2. DNA片段回收电泳图

图3. DNA片段回收电泳图

● Q&A

Q1. 回收DNA时，一般使用多少洗脱液洗脱？

A1. 可以根据所需浓度计算使用洗脱液的体积，一般情况下，洗脱液体积大于30μl即可洗脱Column上90%以上的DNA（但要注意洗脱液需直接加至膜中央），所以洗脱液体积最好大于30μl，当对DNA 浓度要求较高时，也可以适当减少洗脱液体积至20μl，但回收率会略有下降，应注意使用预热的洗脱液洗脱，并在洗脱离心之前静置1分钟以上，以提高洗脱效率。

Q2. 本试剂盒一次可以回收的DNA量的范围是多少？

A2. 本试剂盒中Column一次回收的最大吸附量可达20μg以上，最小DNA起始量也可低至500 ng，所以使用前请对DNA样品的总量进行估算。

Q3. DNA的收量较低，为什么？

A3. 一般情况下，DNA的回收率可以达到50-80%。DNA收量较低时，可以从以下几个方面考虑：

①胶块体积过大，单个Column可以承载的凝胶体积最好小于300 mg，大于300 mg的凝胶，请使

用多个Column进行回收，否则收率较低。

②使用请确认Buffer WB中是否加入了指定体积的乙醇。

③溶胶未完全。溶胶时注意观察胶块是否完全溶解，胶块未完全溶解会严重影响收量。溶胶时，间断

颠倒混匀溶胶液有助于胶块的快速溶解。

④溶胶液pH值过高。溶胶后注意观察溶胶液颜色，若溶胶液的颜色由黄色变为橙色或粉色表明溶胶

液的pH值过高，会造成DNA收量较低，此时应向溶胶液中加入3 M醋酸钠（pH5.2）10μl,混合后至溶胶液颜色变回黄色时，再将溶胶液转移至Column上进行后续操作。

⑤使用离心方法时，注意要在常温下离心，使DNA更好地和Column上的膜结合。

⑥洗脱前的空离步骤不可省略，此步骤可以除去Column上残留的洗液中的乙醇，否则影响洗脱效率。

⑦洗脱时将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

Q4. 长片段DNA回收时应该注意哪些问题？

A4. 当DNA片段长度较长（10 kb以上）时，回收效率会有所下降，这是DNA切胶回收时的常见现象。

此时建议按以下方法解决问题：

①适当增加待回收DNA样品的添加量（如起始量加至2～5μg）。

②由于长片段DNA不易从滤膜上洗脱下来，建议使用加热至60℃的Elution Buffer洗脱DNA，

可以提高回收效率。

③减少操作过程中对长片段DNA的物理损伤：如振荡混合操作不要过于剧烈，切胶时不要将DNA

长时间暴露于紫外灯下，在进行电泳时可以使用6×Quadricolor-loading Buffer（Code No. 9171）判断核酸的迁移情况，避免使用紫外灯反复照射观察核酸迁移情况。

④使用适合长片段DNA回收的β-Agarase（Code No. 7345）进行DNA片段的琼脂糖凝胶回收实

验。

Q5. 回收得到的DNA反应性能不佳（酶切、连接），为什么？

A5. ①洗脱液中残留部分盐离子，加入Buffer WB后室温静置5分钟，有助于彻底清洗掉Column上残留的盐离子。

②洗脱液中残留乙醇，在向Column中加入洗脱液之前，将Column在室温下静置2分钟有助于使

Column上残留的乙醇彻底挥发，然后再加入洗脱液洗脱。

③进行DNA洗脱时用灭菌蒸馏水或Elution Buffer洗脱。

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