紧急避孕药中左炔诺孕酮对斑马鱼卵巢的影响

紧急避孕药中左炔诺孕酮对斑马鱼卵巢的影响

丁岩 2013441011

摘要：通过以斑马鱼为实验材料，研究人类紧急避孕药中的左炔诺孕酮对其体长、体重、成活率和卵巢的影响。设置3个处理组，每组两个平行：对照组、实验组1、实验组2。根据人与斑马鱼的体重比，各组分别用0、0、0.316 3X10-3 mg、0.259 3 X10-3 mg、0.525 0X10-3 mg、0.518 7X10-3 mg的避孕药饲喂斑马鱼10天，按时喂药、喂食、换水，记录存活率以及体重、体长变化。制作斑马鱼卵巢的石蜡切片对比观察斑马鱼卵巢的发育情况。对数据进行分析处理，结果表明，处理后的实验组斑马鱼体长无明显增长，体重明显减轻，斑马鱼卵巢发育受到抑制，卵巢结构变化明显。

关键词：斑马鱼，左炔诺孕酮，卵巢

斑马鱼是一种常见的热带鱼,体型纤细，呈纺锤形。孵出后约3个月达到性成熟。对于性腺尚未发育的幼鱼，激素可以影响其性腺的分化和发育；对于已分化的性腺，外源激素可以影响性腺的发育以及导致败育或者不孕不育，但一般不能改变性腺的分化方向。目前，大多数学者对于外源激素对斑马鱼性腺发育的研究有很多，实验中多采用不同浓度的甲基睾酮处理斑马鱼，观察性腺发育情况。本实验用不同计量的左炔诺孕酮饲喂斑马鱼，通过组织学方法观察性腺变化，探讨外源激素对斑马鱼卵巢的影响。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体。进而可以了解左炔诺孕酮对女性生殖系统的影响。

1材料与方法

仪器和试剂

实验用鱼

实验用鱼为斑马鱼。斑马鱼是一种小型热带观赏鱼。由于其具有个体小、产卵量大、繁殖周期快、体外受精、胚胎透明、突变表现性明显、易于观察、胚胎发育同步且发育速度快、饲养简便等优点，除了具有经济、观赏价值外，还以其自身独有的优势被广泛的应用于发育生物学、遗传学等领域的研究，有很高的科研价值和广泛的应用前景，也因此成为研究最广泛的脊椎动物模式生物之一。

仪器设备

解剖镜、生物显微镜、电子天平、切片机、渗蜡器、中性树胶、单面切片、玻璃板、载玻片、解剖刀、石蜡、盖片、500ml烧杯、渔网、1ml注射器、直尺，培养皿。

实验试剂

饲料：人类紧急避孕药、水、普通鱼饲料。

染料：布温氏固定液、不同浓度的乙醇、1/2乙醇+1/2二甲苯、二甲苯、1/2甲苯+1/2石蜡、涂片剂、蒸馏水、苏木精染液、0.1%HCl、0.1%NaOH、0.5%伊红染液。

实验方法

左炔诺孕酮饲料的制备

将紧急避孕药片碾成粉末状溶于水中，制成0.632 5X10-3 mg/ml左炔诺孕酮稀释溶液备用。

实验分组和实验方法

本实验设置3个处理组（空白对照组、实验组1、实验组2），每个处理组设置2个平行，每组实验鱼10尾于500ml烧杯中饲养。试验期间，每三天喂食一次，每两天换一次水，换水之后给药。各组根据计算好的给药量分别给药，共处理10天。配置好的左炔诺孕酮稀释液浓度为0.632 5X10-3 mg/ml，根据体重计算，对照组1、对照组2、实验组1-1、实验组1-2、实验组2-1、实验组2-2的给药量分别为0、0、0.50ml、0.41ml、0.83ml、0.82ml。对斑马鱼存活率、体重、体长等数据进行记录。每次给药后记录鱼的死亡情况，实验过程中共测体重、体长3次。

制作斑马鱼卵巢的石蜡切片

（1）取材与固定：随机取每组的斑马鱼若干，置于冰块上致死。在解剖镜下迅速将卵巢取出，并放入布温氏固定液中固定24h。然后用70%的乙醇换洗三次，每次20min，放在70%的乙醇中0～4℃保存。

（2）脱水：依次在85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇I中脱水10min，然后在100%乙醇II中脱水15min。

（3）透明：1/2乙醇+1/2二甲苯10min→二甲苯15min→二甲苯15min。

（4）渗透：1/2甲苯+1/2石蜡25min→60℃石蜡中渗透25min。

（5）包埋：折出包埋纸盒，包埋前接蜡液，置于渗蜡器加热板上，将材料放入盛有石蜡的纸盒中，摆好位置，在水中冷却5～10min。

（6）修块：用单面刀片，在玻璃板上修块，要求一蜡块一材料，蜡块或正方形或长方形，材料位于蜡块正中央；材料边缘与蜡块边缘平行，各面要平直，材料边缘与蜡块边缘约3mm。

（7）固着：将修好的蜡块用烧热的解剖刀固着在样品台上。

（8）切片：将样品固定在切片机样品臂上，使切面垂直；调整切片厚度为6～10μm；将切片刀用纱布蘸少许二甲苯擦净后装到切片机上，调刀角15～20°，将刀固定好；调整刀距；切片。

（9）贴片：清洁载片，涂贴片剂，放切片3～5片，光面向下，加水于切片下；将载玻片放于50摄氏度温台上加热至完全展平；之后烤干，吸掉多余的水分，继续放于温台上至完全干燥；贴临时标签，临时标签要用铅笔写。

（10）HE染色

①脱蜡：二甲苯II中10min→二甲苯I中10min；

②复水：1/2乙醇+1/2二甲苯→100%乙醇II→100%乙醇I→85%乙醇→70%乙醇，每步2min，整理，50%乙醇→30%乙醇→蒸馏水，每步2min。

③初染：苏木精染色13min。

④分化：0.1%HCl脱色至变红（几秒钟）→0.1%NaOH至变蓝（几秒钟）。

⑤脱水：蒸馏水3-5s→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇，每步2min。

⑥复染：0.1%伊红染色12min。

⑦脱水透明：95%乙醇10-20s→100%乙醇I2min→100%乙醇II3min→1/2乙醇+1/2二甲苯3min→二甲苯I3min→二甲苯II≥3min。

⑧整理封片：将材料周围擦干净（用干纱布擦，勿引入水，过程中二甲苯不能干，可以随时补加），加1～2滴中性树胶，加干净干燥的盖片，贴标签，注明HE染色及部位。

（11）用生物显微镜观察。

（12）显微摄影：进行拍照并处理照片。

2 实验结果与分析

2.1 实验结果

2.1.1 左炔诺孕酮对斑马鱼死亡率、体重、体长的影响

给药之前由于饲养斑马鱼的水中溶氧较少，导致一晚上便有5条鱼死亡，第二天又重新买鱼添入后进行试验。饲养过程中，给药之前对照组2有一条死亡；第一次给药之后实验组2-2有一条死亡；第二次喂药换水过程中实验组II-2有一条死亡（由于换水操作不当，导致鱼丢失，后来发现死亡）。实验过程中，一共有3条鱼死亡。

根据表1、表2、表3数据分析得出，随着左炔诺孕酮用量的增加，三组的体重有逐渐下降的趋势（由于斑马鱼质量较小，所以每次测量斑马鱼体重时以每组为单位测量每组鱼的总体重；由于没有每条鱼的体重数据，所以表中无法给出标准差）。

根据表1、表2、表3数据分析得出，实验过程中，由于测量方法等原因，在误差允许范围内，斑马鱼的体长变化无明显差异。

表1 左炔诺孕酮处理之前各组斑马鱼的死亡率、体重、体长情况

组别体重平均数/mg 体长平均数/cm 死亡数死亡率对照组1 179.2 2.24±0.28 1 10%

对照组2 166.1 2.06±0.36 0 0%

实验组1-1 221.2 2.53±0.39 0 0%

实验组1-2 141.6 2.07±0.33 0 0%

实验组2-1 156.1 2.09±0.24 0 0%

实验组2-2 149.7 2.08±0.33 0 0%

表2 用药过程中第一次测量时各组斑马鱼的死亡率、体重、体长情况

组别体重平均数/mg 体长平均数/cm 死亡数死亡率对照组1 208.6 2.10±0.27 0 0%

对照组2 187.8 2.08±0.43 0 0%

实验组1-1 201.7 2.17±0.35 0 0%

实验组1-2 164.2 1.49±0.43 0 0%

实验组2-1 123.0 1.64±0.37 0 0%

实验组2-2 135.6 1.23±0.29 1 10%

表3 用药结束时各组斑马鱼的死亡率、体重、体长情况

组别体重平均数/mg 体长平均数/cm 死亡数死亡率对照组1 193.0 1.90±0.19 0 0%

对照组2 141.0 2.03±0.08 0 0%

实验组1-1 180.0 2.30±0.29 0 0%

实验组1-2 110.0 2.07±0.26 0 0%

实验组2-1 140.0 1.77±0.21 0 0%

实验组2-2 156.3 2.03±0.05 1 10%

2.1.2左炔诺孕酮对雌性斑马鱼卵巢的影响

A B

C D

E F

A．对照组 10X镜观察；B.实验组2 10X镜观察；C.实验组1 20X镜观察；D.实验组2 20X镜观察；E.对照组40X镜观察；

F. 实验组1 40X镜观察，C图的放大；

图版I 左炔诺孕酮对雌性斑马鱼卵巢组织的影响

我国学者多将斑马鱼卵巢发育过程分为Ⅰ～Ⅵ期，每期特点如下：

第Ⅰ期：生殖细胞主要是由卵原细胞和处于第Ⅰ时相卵母细胞组成，具有明显的细胞核，核中部有1～2个核仁，核内染色质呈细丝状，形成疏松的网状。

第Ⅱ期：该时相卵母细胞细胞质较多，被染成淡紫红色，核仁增多，染色较浅，靠近核膜内侧分布。大部分卵母细胞外有一层滤泡细胞。

第Ⅲ期：卵巢主要以该时相卵母细胞为主，有少量发育早期的卵母细胞。该时相卵母细胞体积增大，质膜外有两层滤泡膜。该时相早期，核周细胞质内出现了空泡，其数目与大小随卵母细胞的生长而增加。

第Ⅳ期：整个卵又长又粗。主要以该时相卵母细胞为主，也有发育早期的卵母细胞。该时相卵母细胞体积大，卵黄颗粒数目增多，几乎充满核外空间。细胞外辐射带较厚，染成浅紫红色。卵巢壁随卵母细胞的数量增多和体积增加而逐渐变薄。

第Ⅴ期：卵母细胞充满粗大的卵黄颗粒，并逐渐融合成块状。

第Ⅵ期：产后卵巢，此时卵巢细长，结构松散，包含有空滤泡。

实验结果：通过显微观察，A与B对照显示，用药后的卵巢中卵母细胞数量明显减少；C与D对照显示，实验组2的卵母细胞较实验组1的卵母细胞小、体积也小。

2.1.3结论

根据实验数据、观察所得结果，得出结论：左炔诺孕酮对斑马鱼的生长发育和性腺发育会产生一定的影响，斑马鱼体重减轻，斑马鱼卵巢中卵母细胞大小变小，卵母细胞数量减少、体积变小；左炔诺孕酮对雌性斑马鱼有抑制排卵抑制发育的作用。因为本实验持续喂养斑马鱼的时间较短，而且实验组较为单一，只有两种不同浓度的处理，所以对实验结果的精确程度造成一定的的局限性。

2.2 分析

本实验是通过对左炔诺孕酮的使用和对比，来确定其对斑马鱼生长情况、存活率和卵巢发育情况的影响。

在实验过程中，一共有3条鱼死亡，一条是因为给药前鱼对水环境不适所致，一条由于操作不当使鱼丢失，只有一条是在给药过程中死亡，所以不能确定是否为左炔诺孕酮的作用。

左炔诺孕酮的作用机制是通过下丘脑抑制垂体促性腺激素的分泌，显著抑制排卵和阻止孕卵着床，并使宫颈黏液稠度增加，精子穿透阻力增大，从而发挥速效避孕作用。左炔诺孕酮主要作用于下丘脑和垂体，使月经中期FSH和LH水平的高峰明显降低或消失，使卵巢不排卵，对雌激素活性有抑制作用，能使宫颈粘液变稠阻碍精子穿透，不利于孕卵着床。LNG也有一定雄激素活性和蛋白同化作用，口服或皮下注射均可抑制排卵。

理论上，实验组的体重和体长与对照组相比应该有一定程度的增长，而结果是，实验组的体长与对照组相比无明显增长，实验组的与体重对照组相比无有减轻的趋势。对上述结果出现的原因分析如下：

①由于此实验组中斑马鱼的生长状况受到了左炔诺孕酮的抑制作用，对斑马鱼的体重有影响；

②在给药前有鱼死亡，后又购入几条鱼，可能影响实验组整体的体长和体重；

③在实验过程中，我们每三天喂一次食，可能使鱼产生饥饿胁迫，影响其进食；或是因为测体重时，

有时在喂食前测量，有时在喂食后测量，也会影响实验结果；

④喂药时没有考虑到药品的溶解性和助溶剂的问题，直接将药物溶解在水中，使斑马鱼对药剂的吸

收产生影响；

⑤在测量体长过程中，可能由于方法不当，有些许误差。

参考文献：

[1] 张晗，沈丹丹，穆淑梅，等.莠去津对雌性日本沼虾的毒性作用. 河北大学学报，2010,30（6）：702-705.

[2] 郭恩棉，斑马鱼卵巢发育的组织学研究. 青岛农业大学学报（自然科学版），2009,26（3）：229-232.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/yyq4.html