hoechst PI染色

2008/11/09 09:55PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。电子天平准确称取1mg 碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶于10ml PBS（PH 7.2），成100ug/ml的储备液，用前等量混合（注意避光）

protocol:

1、收集细胞，数量需1－2×10E6个（悬浮细胞直接吹起即可，对于贴壁细胞用胰酶消化时，最好用DMEM+胰酶消化,且消化过程中不要去移动瓶子，防止消化所形成的细胞团影响后面的染色及分析），离心，11,000rpm，5min。

2、 用1ml 冰冷的PBS重悬后，离心：11,000rpm，5min。

3、用200μl冰冷的PBS重悬后，用加样器混匀后，缓慢的加入含有4ml冰冷的70％乙醇的10ml离心管中，边加边摇匀。－20℃，过夜。（或者置4℃，1h后进行下一步）

4、1,500rpm，10min，小心弃上清后，用1ml冰冷的PBS重悬，1,500rpm，5min。小心弃上清。

5、 加入含有40μg/ml 的PI，100μg/ml的RNase的PBS溶液500μl，37℃，培养30min－1h。

混匀。

溶液配方：PBS 910μl

PI 80μl

RNase 10μl

共1ml

6、过滤，供流式检测。

Hoechst 33342/PI双染色法

紫外光激发, Hoechst-PI双染在荧光显微镜下可见4 种细胞形态: 活细胞(VN) ,染成蓝色,核呈正常结构;

早期凋亡细胞(VA) ,染成蓝色,核呈固缩状或圆珠状;

晚期凋亡细胞(NVA) ,也被染成红色,但可见明显的染色质凝集。

非凋亡的死亡细胞(NVN) ,染成红色,核呈正常结构; 贴壁细胞：

1、培养细胞中加入hoechst染液，终浓度5μg/ml；

2、37℃，避光染色10min，

3、继续加入的PI染液，终浓度15μg/ml，

4、4℃，避光反应10min，

5、荧光显微镜下观察，照相。

悬浮细胞：

1.悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.2

5％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/

ml，37℃孵育7～10min。

2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。

3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。

4．400目的筛网过滤1次。

5．流式细胞仪分析。

另外这是活细胞染色，还有固定后染色的：细胞处理完毕用甲醇：冰醋酸（3：1）在4度固定5min后，PBS漂洗，进行以上操作。

先染色后固定：

Hoechst33258染色法

1．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。

2．细胞固定液4℃固定5min。

3．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。

4．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。

5．封片剂封片后荧光显微镜观察。

Hoechst33342染色法

1．将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml 37℃孵育30min。

2．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。

3．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。

4．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。

以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：

1．收集（0.5～3.0）×106个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。

2．PBS洗1次，500～1000r/min，离心5min去PBS。

3．用3％多聚甲醛50μl重悬细胞，室温下固定10min。

4．PBS洗1次，500～1000r/min离心5min去PBS。

5．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。

6．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞，计算调亡率。

注意事项：

1、－２０度７０％乙醇固定细胞过夜，固定后可以放在－20度冰箱，一般能保存几个月；

2、染色前要用DNA抽提缓冲液（PC buffer）作用５分钟，；

3、加ＰＩ的量按照1×PI，106个细胞5ul ；

4、加RNAase是为了消化RNA，以免影响DNA分析的结果。

操作过程，不用一定强调无菌，但是干净点没错的。

一般来说都采用 用Hoechest-PI双染，正常细胞对染料有拒染性，萤光着色浅，凋亡细胞主要摄取Hoechest染料呈现强兰光，而坏死细胞主要摄取PI呈红色荧光。

我的细胞已经做了盖玻片在六孔板里面的爬片 并且加了95%酒精固定 下一步打算做Hoechst-PI双染检测细胞凋亡 请教具体步骤 以及药物浓度 是不是这样 固定后

1.用PBS漂洗，加入hoechst染液，终浓度5μg/ml；

2、37℃，避光染色10min，

3、继续加入的PI染液，终浓度15μg/ml，

4、4℃，避光反应10min，

5、荧光显微镜下观察，照相。激发波长：hochest用紫外激发；PI用绿光激发

荧光显微镜下观察并计数凋亡指数（apoptotic index：percentage of apoptotic cells）。每个样本随机观察4个视野进行计数。计数1000个细胞，凋亡指数＝凋亡细胞数/1000 ×100％。凋亡指数取前后2次计数的平均值。实验重复3次。

其中hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！ 暂时了解了这么多，希望做过或是会做的大侠不吝赐教

PI分析细胞周期及凋亡率 1、200×g离心10min收集细胞；

2、弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上； 3、进行流式细胞仪检测前，200×g离心10min收集固定后的细胞； 4、PBS洗涤一次，200×g离心10min收集细胞；

5、将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min；

6、将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。

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