蛋白质的定量测定（一） - 紫外吸收测定

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（一）——紫外吸收测定

【实验目的】

了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 掌握紫外分光光度计的使用方法。 【实验原理】

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。

【实验器材与材料】

（一）试剂

1、标准蛋白溶液

牛血清蛋白预先经凯式定氮法测定蛋白氮含量，再根据其纯度用0.9Nacl%溶液

配置成浓度为1.0mg/mL蛋白质溶液。 2、待测蛋白溶液

配制成浓度约为1mg/mL的溶液。 3、0.9%Nacl溶液 4、饱和硫酸铵溶液 5、血清

（二）器材

1、紫外分光光度计。 2、试管和试管架。 3、吸量管。 4、离心机

5、移液枪

【实验步骤】

一、 制作标准曲线

0 1 2 3 4 5 6 7 管号 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 标准蛋白质溶0.0 0．5 1.0 液/ml 3.5 3.0 32.5 2.0 1.5 1.0 0.0 0.9%Nacl溶液 4.0 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.000 蛋白质浓度0.0 mg/mL 标准曲线的绘制：按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm 波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

二、 样品测定

（1） 待测蛋白质溶液含量测定：取待测蛋白质溶液1ml置于10ml试管中，加

入3ml0.9%Nacl溶液,混匀。以0.9%Nacl溶液为空白溶液，用紫外分光光度法测出待测蛋白质溶液280nm的吸光度值A280。

（2） 血清球蛋白含量的测定：取新鲜血清0.1ml，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵

溶液0.1ml，混匀温室放置10min后，3000rpm离心10min，弃去含蛋白清的上清液，与沉淀中加入0.9%Nacl溶液0.5ml,振摇使其溶解。再加0.9%Nacl溶液7.5ml，混匀。以0.9%Nacl溶液为空白溶液，测出血清球蛋白溶液280nm的吸光度值A280。

【实验结果】

蛋白质浓度 吸光度值

0 -0.054

0.125 -0.08

0.25 0.066

0.375 0.137

0.5 0.224

0.625 0.302

0.75 0.373

由图可知，待测蛋白质浓度为 0.135/0.576*4=0.9375mg/ml 血清球蛋白浓度为 0.301/0.576*80=41.80mg/ml 【注意事项】

(1)比色杯必须用石英比色杯。

(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，则会干扰实结果测定。 (3)实验中应当注意吸量管、移液枪的正确使用。 (4) 石英比色皿比较贵重，使用时要小心。

【思考与讨论】

(1)因为石英比色皿在全波段都没有强吸收而普通的玻璃比色皿在200~400nm的紫外区有强吸收此吸收大到无法校正，会导致测量误差过大，所以实验使用石英比色杯。

(1)绘制标准曲线时，蛋白质溶液浓度要准确配制，作为标准溶液。 测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面。 石英比色皿比较贵重，使用时要小心。

(3)本实验进行时有一定的误差，原本实验所获的图线应当过原点。 (4) 石英比色皿比较贵重，使用时要小心。

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