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第二章蛋白质

第一节蛋白质的概念及其生物学意义

一、什么是蛋白质？

α—AA 借肽键相连形成的高分子化合物（短杆菌肽含D-苯丙氨酸）

O

［肽键：—C—NH—也叫酰胺键］

二、蛋白质的生物学作用（或称功能分类）

物质吸收与运输、运动，调节代谢、储存养分、催化各种生化反应、分子间的识别（支架蛋白）、信息传递（受体复制酶）、记忆、疾病防御—抗体。

应用：固体酶的工业应用（联于水不溶性树脂上）、脱（纺织品）浆（淀粉酶）、生化制药，蛋白酶用于皮革的脱毛及软化等，都是利用蛋白质的催化作用，蛋白质生物芯片（贮存信息量大，将多种蛋白质抗体固定、排列到玻璃板上，能检测各种疾病蛋白及其他基因表达蛋白），进行病原体与疾病诊断等。

第二节蛋白质的组成

一、蛋白质的元素组成：

C（50-55％）、H（6-8）、O（20-30%）、N（15-18）、S（半胱aa）（0-4%）

有的还含有P（酪蛋白）、Fe、Zn、Mo（钼Fe蛋白）、Cu、I，特别是含N量都很接近，平均为16% 。所以，测出含N量× 6.25（100/16 蛋白质系数）即可推测出蛋白质的含量——凯氏定氮。

二、蛋白质的aa组成

通常只有20种，除Pro外均为α—aa ，除甘氨酸外，都有D、L两种异构体（α—碳原子为不对称碳原子）所以有旋光性。投影式如下：

COOH COOH

H2N —C —H H —C —NH2

R R

L—α D —α

aa的分类方法：

（一）氨基酸的种类

分类一根据侧链基团R的化学结构分为四类：

第一类脂肪族aa：侧链是脂肪烃链

①一氨基一羧基（中性）：一氨基一羧基aa中共九种：

H —CH —COOH CH2—CH —COO－CH2—CH —COO－

NH2 OH NH+3SH NH+3

(Gly:G) (Ser:S) (Cys:C)

CH3—CH —COO－CH3—CH —CH—COO－CH3—CH —CH —COO－

NH+3OH NH+3CH3NH+ 3 (Ala:A) (Thr:T) (Val:V支链aa)

第1页共132页

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第2页 共132页 —COO

— (Leu : L 支链aa) CH 3 — S — CH 2 — CH 2 — CH — C?O － CH 3 — CH — CH 2 — CH — ?O?－

NH +3 CH 3 NH +3

CH 3 — CH 2 — CH — CH — COO －

CH 3 NH +3

(Ile :I 支链aa)

②一氨基二羧基aa(酸性)及其酰胺

—OOC — CH 2 — CH — COO — —OOC — CH 2 — CH 2 — CH — COO — NH +3 NH +3

(Asp :D ) (Glu :E )

O O

H 2N — C — CH 2 — CH — COO —

H 2N —

C — CH 2 — CH 2 — CH — COO —

NH +3 NH +3

(Asn :N ) (Gln :Q ) ③二氨基一羧基aa （碱性： —NH 2＞-COOH ）

H 3N + — CH 2（CH 2）3 — CH — COO — H 2N — C — NH —（CH2）3— CH — COO

—

NH 3+ NH 2+ NH 3+ （Lys :K ） (Arg :R ) 第二类 芳香族aa （含有苯环的化合物叫做芳香族化合物，有的包括Trp ）：

— CH 2 — CH — COO — HO — — CH 2

— CH — COO —

(Phe :F ) （丙aa 取代） (Tyr :Y )

第三类 杂环aa ：

HC C —CH 2 —CH —COO —……… — CH 2 — CH — COO —… HN + NH NH +3 N NH +3

CH

（His :H 咪唑基） (Trp :W 吲哚基 苯并吡咯)

第四类 脯氨酸，也称杂环亚氨基酸：由Glu 还原、环化、再还原形成

四氢吡咯-2-羧酸 NH 2+

NH +3 NH +3 (Met :M )

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第3页 共132页 (Pro :P )

分类二 按侧链R 基团的极性（及在pH7左右时的解离状态）分为：

非极性：甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。

不带电荷：带OH 、SH 、酰胺基

极性 带负电荷（酸性aa ） 带正电荷：Lys 、Arg 、His (碱性aa) . His 等电点为7.59

此外在蛋白质代谢中还有鸟aa 、瓜aa （尿素循环中）、胱aa 、羟脯aa 、羟赖aa （胶原蛋白的组分）。甘aa 的H 介于极性与非极性之间，有时归入极性不带电荷类中。

人和动物的必需aa ：不能自身合成必须由食物获得。

Thr 、Val 、Met 、Leu 、Ile 、Phe 、Lys 、Trp 、His*、Arg* (*半必需aa ，儿童合成不足)

（二）aa 的性质

1. 物理性质：无色结晶，易容于水，不容于有机溶剂，熔点高（ G ly ：232℃,乙酸：16.6℃，分子间靠氢键缔合），这些特性说明是离子化合物。

2. 两性解离及等电点：（难点*）

COO — 加碱解离出H +带负电，加H +结合H +带正电，向阴极移动，

在某一pH 下带正、负电荷量相等。

H 3N + —C —H （由很酸向碱变化NH +3— CH —COOH NH +3— CH —COO — ）

R R R

在电场中不移动，此时的pH 称为aa 的等电点（pI ）。此时aa 的溶解度最小（因为静电作用），pI 与—COOH 和—NH 2的解离常数有关。

K 1：—COOH 解离为 —COO —

+ H +的解离常数；K 2：H 3N +解离为 —NH 2 + H +的解离常数。其pI 可从pK 计算或测定(用酸碱滴定法测定)。

aa 等电点的计算：

只有一个解离基团的物质AH ，其解离常数与pH 的关系为pH=pK+lg([A-]/[AH]).证明：

AH A —+H + K=[A -]*[ H +]/[AH] [ H +]=K*[AH]/ [A -]=K/（[A -]/[AH]） -lg[ H +]=-lgk--lg （[A -]/[AH]） 即：pH=pK+lg （[A -]/[AH]）Henderson-方程。当有一半解离时，即 [A -]=[AH]时，pH=pK ，即溶液的pH 可由其溶质的解离常数与解离量计算而得，溶质的解离常数可查得。

pK ：解离常数K 的负对数。aa 可看作二元弱酸（酸性条件）有两个可解离的H +其分步离解如下： K 1（+OH －）

在充分酸的条件下 R —CH —COOH R —CH —COO — + H +

NH +3 NH +

3

（R +） （R 0）

K 2

R —CH —COO — R —CH —COO — + H +

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第4页 共132页 NH +3 NH 2

（R 0） （R —）

［R +］= ∵K 1= K 1 R 0=R + 时K 1=［H +］

K 2[R 0]

K 2= R — =

[R 0] [H +] 用NaOH 滴定到R 0 = R —时K 2 =[H +]

等电点时：aa 处于两性离子状态，可有少量解离成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目和趋势相等。即：

[R —

]=[R +] 即 [R 0][H +] / K 1=K 2[R 0] / [H +] [H +]2= K 1* K 2

[H +]2=K 1 ?K 2 —lg[H +]=pH ；—lgK 1=pK 1； —lgK 2=pK 2 两边取负对数得2×—lg[H +

]＝—lg K 1＋—lgK 2即： pH=[ pK 1 + pK 2] / 2 = pI

分子的存在状态是多种多样的，但在一定条件下以某一状态为主。

即aa 的等电点pI 就是两性离子(R 0)两侧的pK 值的平均值。基团的pK 值可查得，故pI 值可由二pK 值计算得之。

对于有三个解离基团的aa ，如Asp 、Lys 只要取其兼(两)性离子两侧的pK 值的平均值即得pI 值。

COOH COO — COO —

CH — NH +3 K 1 CH — NH +3 K 2 CH — NH +3 K 3 Asp =

CH 2 CH 2 CH 2

COOH COOH COO —

Asp +(R +) Asp 0(R 0) Asp —（R —） 等电点时Asp 主要以兼性离子R 0存在，(R +)与（R —）很小且相等（等电状态为理想状态，pI 为理论值）。

pI=（pK 1+pK 2）/ 2 同上

赖COOH COO — COO —

COO —

CH —NH +3 K1 CH —NH +3 K2 CH —NH 2 K3 CH —NH 2

（CH 2）4 （CH 2）4 （CH 2）4 （CH 2）4

NH +3 NH +3 NH +3 NH 2

（R 2+） （R +） （R 0） （R —）

pI=（Pk 2+pK 3）/ 2 因R 2+可忽略不计（pI 时可认为它是不存在的，否则就不是等电状态了）。ε—NH 2比α—NH 2碱性强，结合H +能力大，结合后不易放出

[R 0][H +] [R +] [R 0][H +] [R -][H +]

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第5页 共132页 H +（因受COOH 影响小）。

3. 氨基酸的化学性质：

⑴与强酸、强碱都可生成盐（铵盐与羧酸盐）如 谷氨酸钠

⑵与水合茚三酮的反应 80-100℃的条件下，首先使aa 氧化脱羧脱氨形成醛，而本身被还原成还原型茚三酮，然后还原型茚三酮、氨和另一分子的水合茚三酮缩合形成蓝紫色的二酮茚—二酮茚胺，这是α—aa 定性定量测定的基础，反应如下

（二酮茚-二酮茚胺 紫兰色 吸收峰 570nm ）Pro 、羟—Pro 生成黄色物质(因为无氨基)

用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。因为产生CO 2 ，也可用CO 2气体分析法测定aa （只限于α-氨基酸），肽和蛋白也有此反应，肽越大灵敏度越差。

⑶与亚硝酸的反应（aa 的NH 2基被氧化成 —OH ），+NH 3—N 被氧化成N 2，HNO 2

—N 被还原为N 2，等量进行。所以N 2一半来自HNO 2（其他伯氨基均可）。 生成N 2的反应叫van slyke （范斯莱克）反应。

可测N 2量（体积）计算氨基的含量。用于测定蛋白质的水解程度。

⑷ 与甲醛的反应：酸碱滴定没有适宜的指示剂（因为等当点过高或过低）。其氨基可与甲醛反应（加成），生成N —羟甲基或N ，N —二羟甲基aa 。使NH +3变为NH 2释放出H +。使溶液酸性增强，可用NaOH 滴定之。与NH 2的含量相当，即aa 含量。这就是aa 的甲醛滴定法，（滴定到放出的H +被中和时的 pH 为终点）。

R －CH －COO － R －CH －COO －+H +

+NH 3 NH 2

+HCHO

R －CH －COO －

NHCH 2OH

+HCHO

R －CH －COO －

O N HO O O H

OH

O

O

H

O

O O O N

HO HO O O —3H 2O + NH 3 +

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第6页 共132页 N(CH 2OH)2

⑸与2，4—二硝基氟苯的反应（胺与卤代烷的反应）NH 3的烷基化，生成黄色DNP —aa ，不被酸水解。也可用之测肽和蛋白质的N —端aa ，反应后酸解得N 端的DNP —aa ，有机溶剂提取分离，层析与标准氨基酸对比即可鉴定之。

DNFB 丹磺酰氯

Sanger 试剂 （5—二甲氨基萘磺酰氯）

R H

R

+ H 2N —CH —COOH —CH —COOH

因为丹磺酰aa 有强烈的荧光，所以可用荧光光度计测定。（均在试剂与—NH 2之间脱去卤化氢）均称 Sangar 反应。DNFB 亦可与非α－氨基反应,如可生成：δ－DNP-鸟氨酸。 ⑹与异硫氰酸苯酯（PITC ）的反应，称艾德曼反应（Edman ）反应：弱碱性条件下，形成苯氨基硫甲酰aa(PTC aa)，在无水酸（硝基甲苯中与酸作用）环化

为苯乙内酰硫脲氨基酸（简称PTH 或PTH-氨基酸）。PTH 在无水酸中极稳定。

PTC 基的引入使紧接着的肽键减弱，所以在无水酸中只切下之（环化断裂同时发生）

PTH —aa 在紫外区有强吸收。Vmax=268nm.PTH —aa 可用各种层析技术分离，紫外分析测定与标准PTH —aa 对比即可知为何种aa （N — 末端），多肽、蛋白的N — 末端aa 也可与PITC 反应，不断重复可得蛋白质aa 顺序，多肽的aa 顺序自动分析仪，即以此原理设计而成。一次可测60多个aa 。

7. 成肽反应：肽即氨基酸脱水缩合而成的化合物

R —CH —COOH + H 2N —CH —COOH R —CH —CO —NH —CH —COOH

NH 2 R NH 2 R

二肽、三肽……含一个自由的α—氨基与羧基，还可缩合为多肽蛋白质

O 2N F NO 2 N CH 3 O=S=O H 3C Cl C

O

N

C NH CH S R N=C=S

+aa NH －C －NH －CH －COOH S R

O 2N F NO 2 O 2N N NO 2

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第7页 共132页

似吗啡有镇痛作用但不上瘾

Cys Tyr Phe Gln Asn Cys S S Pro Arg Gly —C —NH 2 H 3N + O 升压素 活性肽：谷胱甘肽GSH *Glu 的r 羧基——Cys 的α—氨基缩合成r 肽键： SH

COOH O CH 2 O H

CH — （CH 2）2 — C — NH — CH — C — NH — C — COOH

NH 2 2H H

GSSG （氧化还原酶的辅酶 —SH ）

催产素与加压素（激素类）：

前者使子宫与乳腺平滑肌收缩二者只有两个aa 不同：3Ile 3Phe 8Leu 8Arg 所以有催产和促排乳作用，后者则使血管平滑肌收缩使血压升高（也使肾小球血管收缩形成尿减少）（也是血压升高的原因之一）。所以也叫抗利尿激素，也与学习的记忆过程有关。均由下丘脑合成，神经垂体分泌入血

脑啡肽：许多有镇痛作用： C 端Leu （ Leu 脑啡肽已人工合成）

（5肽）Tyr —Gly —Gly —Phe —Met

促肾上腺皮质激素（ACTH 39肽，脑垂体分泌）、

胆囊收缩素（33肽，十二指肠分泌）括约肌收缩，胆汁分泌减少引起厌食(减肥) 胰高血糖素(29肽，胰岛α-细胞分泌)使糖原降解，血糖升高，与胰岛素相反。 8 与荧光胺反应（α—氨基）：产物具有荧光

荧光胺 荧光产物

（被390nm 光激发，发射475nm 的荧光）ng 级

9. 与5，5/—双硫基—双（2—硝基苯甲酸）反应

测半胱aa （Cys ） 等的游离—SH 含量，生成含—SH 的硝基苯甲酸产物OD412nm 有一吸收峰可测之Cys 的含量。

CH 2 — CH — COO －

SH NH +3 +

Cys 5，5/—双硫基—双（2—硝基苯甲酸） 硫代硝基苯甲酸 Cys 与抗性有关 (吸收峰412nm)

C 端Met HO O O O O O +aa R N — CH —COOH + CO 2 S HOOC NO 2 S NO 2 COOH S NO 2 COOH H 6 7 8 9 9肽

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第8页 共132页 （三）aa 制备与分析 （可略）

制备： 蛋白水解：毛发水解（H +） 胱aa

、半胱氨酸

发酵：Glu 菌发酵 Glu 钠

化学合成：α— 酮酸 + NH 3 aa

分 离：层析与电泳

第三节 蛋白质的结构

蛋白质多肽链可分为四级结构。

一、蛋白质的一级结构：其aa 种类、连接方式及排列顺序，包括二硫键(共价键)。 H 2N —CH —CO —NH —CH —CO —NH —CH —CO ……—NH —CH —COOH

R 1 R 2 R 3 Rn

—NH —CH —CO —

（称为aa 残基）

R

书写： N 端(氨基末端)：有α氨基的一端写在左边用H 表示 C 端(羧基末端)：有α羧基的一端写在右边用OH 表示

连接方式：—CO —NH —。—S —S —与稳定肽链的空间结构和生物活性有关 如胰岛素：51aa （分子质量5734）21A+30B

研究方法：测定蛋白质的aa 序列。Edman 法一次只能测定60-70个aa 残基的肽段 单条肽链测定如下：

1.测定aa 组成。酸解、碱解，可避免多肽链的aa 丢失。（测分子量确定aa 个数 氨基酸残基的平均分子量为120）

2.测N 、C 末端aa 。DNFB 法等，确定肽链的数目，（羧肽酶A 释放除Pro 、Arg 和Lys 的所有C 末端残基，羧肽酶B 只水解Arg 和Lys 为C 末端残基的肽键，二者合用）

3.用两种以上的方法将蛋白质断裂为不同的肽段。如用不同的酶水解。

4.分离各肽段，并测出它们的序列。Edman 法

5.根据各肽段的重叠部分推出蛋白质的全部aa 排序。也可DNA 测序后反推。 关键是小肽段aa 顺序的测定：Edman 反应（降解法）与外肽酶酶解法。如： 某十肽，用胰凝乳蛋白酶酶解得4个小肽：

A1:Ala －Phe ；A2:Gly －Lys －Asn －Tyr ；

A3:Arg －Tyr ；A4:His －Val

胰蛋白酶酶解得3个小肽：B1:Ala －Phe －Gly －Lys ；

B2:Asn －Tyr －Arg

B3:Tyr －His －Val.

根据重叠结构拼接为：

Ala －Phe －Gly －Lys －Asn －Tyr －Arg －Tyr －His －Val(可直接Edman 法)

成环则无 6 7 7 11 19 20 21 OH

H

H

OH

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第9页 共132页 + —

如果含两条以上的肽链先拆分成单链，若含二硫键需先拆开：过甲酸氧化形成二个半胱氨磺酸(或用β-巯基乙醇还原后用碘乙酸保护-形成羧甲基衍生物)： -CH 2-S-S-CH 2- -CH 2-SO 3H + -CH 2-SO 3H

含—SO 3H ，分析时即知—S —S —的位置（可先水解成只含一个或少量—S —S —的

小肽段，以便确定—S —S —的准确连接位置）。

二硫键位置的确定（另取一份样品）

+ -

熏蒸

一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pH6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，即可确定二硫键位置。

提取 DNA 测序后反推蛋白：蛋白质抗体 蛋白mRNA 反转录 cDNA 测序反推（见后一章）。

第三节 蛋白质的结构

多肽链可分为四级结构。

一、蛋白质的一级结构：其aa 种类、(共价)连接方式及排列顺序，应包括二硫键。

二、蛋白质的空间结构

多肽链按一定方式盘绕折叠，形成立体（空间）结构（各基团的作用力之故）。也称蛋白质的构象（或高级结构）：指蛋白质分子中所有原子在空间的排列及肽链的走向，以一级结构为基础。

HCOOOH

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第10页 共132页 肽键及肽键平面，双键性质（不能自由旋转且比一般C-N 键短，比C=N 键长） O O O —

C α

C α—C —N —C α—C —N —C α

C=N

O 与H 成反式

H H C α H

亚氨基

肽键中的4个原子—CO —NH —（—羧基与另一aa 的氨基构成）和与之相连的两个C α原子都处于同一平面上。这个平面叫肽键平面，Ｃ＝Ｏ 有部分单键的性质，只有Ｎ—C α ，Ｃ—C α键可以旋转。

多肽的主链由许多肽键平面构成，平面可以C α为顶点绕N —C α和C —C α键旋转，但受侧链基团的影响，只有少数的特定结构。所以肽链折叠有一定的限制，分为二、过渡、三、四级结构。

1. Pr 的二级结构：指多肽链本身的折叠与盘绕方式，驱使蛋白质折叠的主要动力来自各侧链基团及其与介质的相互作用（H 键维持系统的能量平衡）。主要有α—螺旋结构、β—折叠、β—转角、无规则卷曲四种。

1）α—螺旋结构：毛、发、羽毛中的α—角蛋白中的主要形式，多肽链盘绕成右手或左手螺旋（是由肽键平面绕C α相继旋转一定的角度形成的）。典型的右手

N

①3.6aa 残基为一圈，高0.54nm 0.54/3.6=0.15nm ，3600/3.6=1000

②侧链R 基伸向螺旋外侧相邻螺旋圈 C=O 与亚氨基（ NH ）氢间

形成链内H 键，每个残基的C=O 都与它后面的第四个 aa 残基（隔三隔aa 残基）形成H 键，氢键平行中心轴。

O H O H

— C —NH — C — C — N — n S 3.613 (3×3)+4=13

3

R

s ：形成氢键封闭（合）环内共价连接的原子数，几乎全为右手螺旋（也有极少数左手螺旋）。但整条肽链并非全是，如有Pro 存在时，即中断（无H 可形成H 键）。带同电荷的aa 出现在邻近位置上就会影响螺旋的形成，甘氨酸也不易形成螺旋。

2） β—折叠结构： O=C C N C

纵向排列形成片层 N-H

N N N

N C N

平行(角蛋白) 反平行(丝心蛋白)

β—折叠片层也可在同一肽链的不同部分之间形成。β凸起：β—折叠的一股弯曲使一个氨基酸残基突出出来不形成氢键。

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第11页 共132页 3）β—转角

出现在180°回折角处，此处Gly 、Pro 多（侧链小才

可形成），也叫发夹结构、回折、β—弯曲。

O H O H

— C —NH — C — C — N — n S 310 (3×2)+4=10

2

4）自由回转（无规则卷曲）：无规则的松散结构。

一种蛋白质中往往含几种二级结构

2. 超二级结构与结构域：

相邻的二级结构的组合体（构象单元）在空间上能与其它部分分开，βαβ、

αα、ββ（靠近）、β×β（连接链连接平行的β片层）、β曲折（β转角连接）、

回形拓扑结构

αα β×β βαβ β曲折

左手超螺旋 希腊钥匙构象

超二级结构无特定功能（只有一定的组合规则，在空间上能辨认）。

结构域：是球蛋白的折叠单位，超二级结构进一步盘曲折叠成球状的，在空

间上独立（相对）的、具有部分（一定）功能的结构，较小的蛋白可能只有一个

结构域，这时结构域等于三级结构，超二级结构与结构域在结构上很难区别（后

者比前者更复杂）。

结构域的类型：β—圆桶、螺旋束结构域（后二者）等

3 7

8 6 2

5 4

1

丙酮酸激酶 溶菌酶 肌红蛋白三级结构(单域)

由两个以上结构域组合成三级结构（可以是完整功能的蛋白质）。 每个结构域都有其功能，三级结构是指多肽链的所有原子在空间的排列与分

布，如肌红蛋白的三级结构一条多肽链，非极性侧链埋于分子内部，极性基团分

布在分子表面与水结合，所以具水溶性。有几个结构域常常就有几个功能区，结

构与功能的统一。

两条以上肽链才有四级结构：分子量大的蛋白多由几条多肽链组成，它们以

非共价键结合成一个功能单位，执行一个特定功能，其中一条肽链就称为该蛋白

的一个亚基（Subunit ）如血红蛋白由2α、2β亚基组成。

β1 β2

β转角

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以共价键连接的肽链不能称为亚基，如胰岛素A、B链以两个—S—S—键相连。

四级结构：就是指亚基之间的连接及空间排列，不包括亚基内部得空间结构，亚基单独存在无活性或活性很低，只有聚合成四级结构，才能有完整的生物活性。如血红蛋白只有2α、2β（141、146aa）=574个aa一起才能组成完整的功能单位。

胶原蛋白：左手螺旋的多肽链缠绕成三股右手超螺旋的原胶原蛋白分子。

胶原蛋白。

三、蛋白质分子中的共价键与次级键（非共价键）

一级结构由共价键维持：肽键（酰胺键），二硫键；空间结构由次级键（非共价键）维持：氢、盐键（离子键）、疏水键、范德华引力（包括H键）。二级结构主要是H键，三级结构主要是疏水力，盐键、范氏力也都起着重要作用（维持特定构象）。

四、蛋白质分子结构与功能的关系

㈠一级结构：结构决定功能，相同的功能有相同或相似的结构

1. 不同动物的胰岛素大同小异（差异在A链：8、9、10、30位aa残基）。变化的aa不起决定（功能）作用；细胞色素C（呼吸链的重要组分）在动物间亲缘关系越近，差异越小，人与黑猩猩的差异小于人与鸡的差异。细胞色素C的结构中与之功能密切相关的部位在各种动物中都是不变的（104个aa组成）。

2. 关键部位结构上的一点变化，就会引起功能的显著变化。如：镰刀型贫血病。只是血红蛋白（2α：141aa，2β：146aa）的β链的第六位Glu Val 代替就使患者红细胞在缺氧时成镰刀状，易胀破、溶血，引起头晕、胸闷等贫血症状，都证明Pr结构与功能的统一性。

㈡构象与功能的关系

构象：即空间结构。指取代基团，因为单键旋转所形成的不同立体结构。

第12页共132页

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第13页 共132页 别构现象：构象改变功能也随之改变的现象。

血红蛋白与O 2的亲和力是很弱的，但其一个亚基与O 2结合后引起的构象改

变，亚基间次级键破坏，使其它亚基与O 2结合力变大，结合速度变快。氧结合曲

线成S 型

β 1 β2

P(o 2) P(o 2)

肌红蛋白的氧合曲线 血红蛋白的氧合曲线

第四节 Pr 的性质

一、分子量

大小：一般为1万——100万

主要测定方法：

1. 超离心：在一定离心力下，分子量大沉降速度快。可用沉降系数来表示(正相关)。

沉降系数：单位离心力下的沉降速度，cm/s/(cm/s 2)单位（S ：斯威伯格单位10-13秒）

2. 凝胶过滤：分子筛作用。分子量越大过滤速度越快，用标准蛋白作标准曲线与之比较即可知未知蛋白分子量。

3. SDS 凝胶电泳：分子量与迁移率成反比，与标准样品比较。（因为SDS 使各种蛋白的荷/质比均相同）。大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W/W)的比例结合 SDS ：十二烷基硫酸钠

二、Pr 的两性电离与等电点

Pr 也是两性电解质：

解离基团：末端的α—氨基与羧基、aa 残基侧链上的氨基、羧基、咪唑基、胍基、SH 等。

NH 2

Pr

COOH

NH +3 H + NH +3 H + NH 2

Pr Pr Pr

COOH OH — COO — OH — COO —

pH ＜pI pI = pH pH ＞pI

两性离子

氧饱和度 氧饱和

度

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第14页 共132页 pI ：使Pr 所带的正电荷与负电荷相等，静电荷为零的溶液pH 值。此时在电场中不移动，溶解度最小。pI ：决定与Protein 的aa 组成，碱性aa 多则pI 大，否则小。

电泳：带电物质在电场中移动的现象叫电泳。

方向：取决于所带电荷的性质(正负)（后者又取决于溶液的pH 值和蛋白质的氨基酸组成）。

速度：取决于所带电荷的多少(正相关)和分子的大小(负相关)（荷质比） 混合蛋白的分离：电泳

自由界面电泳

电泳

纸上电泳 醋酸纤维薄膜电泳

区带电泳 凝胶电泳

圆盘电泳

平板电泳

等电聚焦电泳

免疫电泳

在pH8.6的电泳缓冲液中（各蛋白最大pI 为6.35-7.3）滤纸电泳血清蛋白的电泳图如下：

清蛋白 α1— α2— β— γ—球蛋白

+ —

三、Pr 的胶体性质

大小：直径1—100nm ，胶体颗粒：布朗运动、丁多尔现象、电泳现象、不能透过半透膜，具吸附能力（分子大表面具电荷和非极性基团），可用玻璃纸、火棉胶等透析纯化（去除小分子杂质），是生产上和实验室常用的纯化方法。

稳定蛋白质溶液的因素（不聚集成大颗粒而沉淀）：水化膜（层）与电荷pH ≠pI

四、Pr 的沉淀反应

1. 加高浓度盐——盐析：破坏蛋白质的水膜又中和其电荷。不同蛋白质所带电荷不同，所以，所需盐浓度不同，可分段盐析，（NH 4）2SO 4半饱和，球蛋白析

出；（NH 4）2SO 4饱和，清蛋白析出（分子量小pI 低）

，（只要pH ＞或＜pI 可以认为所有的分子均带同样的电荷，所以，在一定pH 下的盐析与分子量有关：越大越易沉淀，pI 过低或过高中和其电荷所需盐浓度高）。

2. 有机溶剂沉淀：

极性有机溶剂与水的作用大于蛋白，破坏水膜，多同时调节pH 使其接近pI(pI 时消除了静电斥力)。多用乙醇。

3. 重金属盐沉淀(pH 高于pI 时)：蛋白质的重金属盐溶解度很小 。 沉淀

4. 某些酸如：单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等生成不溶性盐而沉淀（pH ＜pI ），并破坏分子内氢键，使疏水性氨基酸残基移至分子表面，各分子靠疏水力结合。

5. 加热变性沉淀：破坏分子内氢键，疏水基团外露，与水亲和力减弱，水溶性降低，水化膜破坏。如制豆腐：加热大豆蛋白的浓溶液，并加入MgCl 2（盐

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第15页 共132页 卤）使蛋白凝固。

制取蛋白并保持其生物活性：盐析、低温下加有机溶剂沉淀，有机溶剂在高温或长时间接触会使蛋白质变性。

五、蛋白质的变性：

理化因素影响，使空间（次级）结构，理化性质和生物学性质改变(但一级结构并未破坏)的现象。

变性蛋白质的特点：①卷曲的肽链 伸展，构象破坏；②生物功能丧失：酶的催化能力、血红蛋白的运O 2能力、胰岛素调节血糖的功能。③溶解度降低、丧失结晶能力。因肽链松散，易被蛋白酶消化。

变性因素：

化学变性因素：强酸、强碱与尿素、胍盐、乙醇、重金属。

物理变性因素：超声波、紫外线、加热、震荡与搅拌。

变性的本质：次级结构破坏，但一级结构没破坏，所以分子量和组成不变。可逆或不可逆，胃蛋白酶的升温(80-90℃)与降温(37℃)可使活性可逆变化。 应用：制作豆腐、尿蛋白检验(加热)、急救重金属中毒病人(给中毒病人吃大量乳品、浓豆浆或蛋清，然后催吐)等。制备蛋白与酶应防变性：应用低温等。

六、蛋白质的颜色反应（分析测定的依据）

1. 双缩脲反应（要求含两个以上肽键）

在碱性条件下能与CuSO 4反应生成红紫色的络合物，具有双缩脲结构的物质

都有此反应（二脲加热脱氨形成双缩脲：H 2N —C —NH —C —NH 2）与Cu ++形成络合

离子（两侧的氨基），540nm 有吸收峰。

—C —NH —CH —C —NH ：含两个肽键的结构与双缩尿相似。

2. 米伦（氏）反应：

米伦试剂：硝酸、硝酸汞、亚硝酸与亚硝酸汞的混合液（millon,reaction/反应）与蛋白质相遇产生白色沉淀(加热后则呈砖红色)，酪aa 等含酚基化合物都有此反应。

3. 乙醛酸的反应（Trp ）

将浓H 2SO 4加入蛋白质与乙醛酸的混合液，H 2SO 4与混合液成两层，两层间出

现紫色环，为Trp 与乙醛酸的缩合物，不含Trp 的白明胶无此反应。浓H 2SO 4提供反应条件。

4. 坂口反应（精aa 的胍基）

Arg 的胍基与次氯（溴）酸钠及α—萘酚在碱性条件下反应生成红色产物，可用于鉴定含Arg 的蛋白及测定 Arg 的含量。

5. 酚试剂（碱性CuSO 4及磷钨酸——钼酸）反应

酚基（Tyr ）可还原磷钼酸及磷钨酸为兰色的钼蓝与钨蓝。

6. 与水合茚三酮反应生成蓝紫色物质（似aa ）

7. 黄色反应：Phe 、Tyr 的苯环与硝酸生成黄色的硝基苯化合物。

8. 与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀（Cys 与胱aa 含量）

9. 与考马斯亮蓝显色（595nm 吸收峰）。G-250 R-250

第五节 蛋白质的分类

分简单与结合蛋白（按组分类）

简单蛋白：水解只产生aa(α—)按溶解度可分为7类：

O O O O

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第16页 共132页 清Pr 、球Pr 、谷Pr 、醇溶Pr 、组Pr 、精Pr 、硬Pr 。

清Pr ：溶于水和稀盐溶液,在饱和硫酸铵溶液中沉淀。

球蛋白：不溶于水，只溶于稀盐溶液，在半饱和的硫酸铵中沉淀，

醇溶Pr ：不溶于水和稀盐，可溶于稀酸、稀碱和70-80%的乙醇。

谷蛋白：不溶于水和稀盐；可溶于稀酸、稀碱。

精蛋白与组蛋白（碱性蛋白）：溶于水和稀酸，为碱性蛋白。

硬蛋白：在水、稀酸、稀碱与稀盐溶液中不溶。主要存在于毛、发、角、爪、骨等组织中。

结合蛋白：= 简单Pr + 非蛋白质组分（辅基），分为：

1. 核蛋白 = Pr + 核酸：核糖体、染色质

2. 糖蛋白 = Pr + 糖（共价键相连）糖的半缩醛羟基与Pr 中的Ser 、Thr 等的羟基以糖苷键相连(O 连接)或由糖的半缩醛羟基和Asn 的酰氨基以N 连接（脱水）。

3. 脂蛋白：蛋白与脂类通过非共价键相连。其蛋白部分称载脂蛋白，主要存在于膜上及动物血浆中，使脂类能溶于水中运输。血浆脂蛋白：按密度分为，乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白4类（CM 、VLDL 、LDL 、HDL ），其蛋白质含量依次增加，而脂类(包括固醇)含量依次减少。

4. 色（素）蛋白：其非蛋白辅基为色素

如：血红蛋白 = 珠蛋白 + 血红素（原卟啉 + 二价铁），H 2O 2E 、细胞色素C

均由蛋白质和铁卟啉组成。 铁卟啉

由四个这样的吡咯环和亚甲基连接成环状的原卟啉.

5. 磷蛋白 = 蛋白质 + 磷酸（与Ser 、Thr 的羟基形成磷脂）。

如：乳汁中的酪蛋白含有许多Ser 磷酸残基(可结合大量钙)。

有人提出按蛋白质的功能进行分类分为：酶（催化）、激素蛋白（调节）、运输蛋白（转运）、运动、防御蛋白（抗体）、受体、毒蛋白、膜蛋白。非活性蛋白：丝心Pr 、胶原Pr 、弹性Pr 、角Pr 。

N CH

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第17页 共132页 X 第二章 核酸 第一节 核酸的概念与重要性

核酸：细胞核内含磷的酸性物质 DNA ：核、叶绿体、线粒体。

RNA ：C 质中。

细菌转化实验（Avery 艾弗里）,证明DNA 是重要的遗传物质（从有毒肺炎双球菌菌株提取的DNA 能使无毒的同类菌株转化成有毒菌株），为多核苷酸的高分子化合物。 DNA ：作为遗传物质，主要存在于细胞核中；真核细胞细胞器DNA 只占DNA 总量的5%。

RNA ：少数病毒的遗传物质。主要作用是转录DNA 的遗传信息，并指导蛋白质的生物合成，现发现有的有酶样作用。主要存在于细胞质内，核内RNA 只占RNA 总量的10%。小RNA 的作用（RNA 剪切）是近年来的研究热点。

第二节 核酸的组成成分

水解：核酸 核苷酸 核苷 + Pi

碱基 + 戊糖

（ 嘌呤、嘧啶）（核糖、脱氧核糖）

核糖与苔黑酚反应成绿色，脱氧核糖与二苯胺反应成蓝色

一、核糖与脱氧核糖（分类依据）：β—D 型。

CH 2OH HOH 2C CH 2OH

O OH O O

β－D －型核糖 β－D －2－脱氧核糖 D －2－O －甲基核糖（RNA 中）

二、嘌呤(嘧啶并咪唑)碱与嘧啶碱：

DNA 和RNA 各含四种碱基，嘌呤同。

A. G

1 C 不足的键用H 饱和

I

次黄嘌呤 1—甲基次黄嘌呤

黄嘌呤（酮、烯醇式） N N N N NH 2 O

HN N H 2N N N N O HN N N H 3C —N N N

N O O HN

N N H

O N N HO OH

N N N H H H OCH 3

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第18页 共132页

尿酸 含氧的碱基有酮式与稀醇式两种互变异构体，酮式为主

3

1 嘧啶 尿嘧啶 胞嘧啶

T U U 的烯醇式 嘧啶为碱性，六元杂环N 原子的孤对电子不参与P π共轭，所以可与H +结

合而显碱性，咪唑环为酸性，其N 的未共用电子对参与了环的共轭，结合H +能

力减弱其氢可以H +解离出来。显负电荷，故嘌呤碱可结合Ag +等。

三、核苷：核糖或脱氧核糖与碱基（脱水）形成的糖苷，叫核苷。

核苷中的糖苷键通常是由核糖的半缩醛羟基与嘌呤碱的第9位N 原子或嘧啶碱

的第一位N 形成糖苷键，假尿苷：C ′1—C 5，戊糖C 原子标号为1′、2′、3′ ……

碱基环中的原子标号为1、2、 3 ……

A U(ψ假尿苷/假尿嘧啶核苷)

N H

O O HN N H H N O N N O

O HN N H NH 2 N O N H H

H H O O HN N

H

O O CH3 HN

N H

OH

H N HO N H N N N

N NH 2 O HOH 2C O HOH 2C O O HN

N

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第19页 共132页 +Δ

四、核苷酸：

核苷中的核糖OH 与Pi 形成的Pi 酯，核苷酸（也叫P —核苷）可分别形成2/、3/、5/—核苷酸

脱氧核苷酸只有3/和5/—核苷酸，5/的居多。如AMP 、GMP 、dAMP 、dGMP 等。无特殊指明均指5/—核苷酸。

水解DNA 或RNA 得5/或3/核苷酸或脱氧核苷酸，核苷酸通常指5/—核苷酸，pA ：5/—腺苷酸，Cp ：3′—胞苷酸，若为2/需标明：G p 2′：2′—鸟苷酸，2′—核苷酸在生物体内很少。 AMP + Pi ADP + Pi ATP 是RNA 合成的原料 写出结构式！ dATP 、dGTP 、dCTP 、dTTP （脱氧胸苷酸）是DNA 合成的直接原料。

UTP 参与糖合成；GTP 参与蛋白质的合成。CTP 参与磷脂合成。ATP ：能量代谢。AMP ：作为辅酶FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)、NAD +（尼克酰胺腺嘌呤二

核苷酸）、NADP +（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）的结构组分。调节代谢：cAMP 、

cGMP 、ppGpp （5′—二磷酸3′—2P 鸟苷）、pppGpp 、pppApp 、pppAppp(休眠与逆境)、A 5′pppp 5′A(与细胞的生长速度正相关)。

五、核苷酸的连接方式

DNA 和RNA 中3′—5′P 二酯键，核苷酸的戊糖和P 构成核酸大分子的主链，碱基构成侧链，P 基呈酸性，在生理pH 下带负电，嘌呤和嘧啶具有疏水性（DNA 形成双链时碱基埋在里边）。每一链有—3′末端和一5′末端（长链状）

O

O —CH 2OH OH

A

O=P —O O -

3′5′OH O -O

O —CH 2C O=P —O -

3′5′OH OH O -

O

O —CH 2G O=P —O

-3′5′OH 3′5′

1′P P P OH A C

G pGpCpA OH

pG-C-A pGCA

P ：磷酸基团。简写式：pApCpGp GpU （ 表示核酸酶的酶切位点）。p 可略 简化式的读写：左5′ 右3′(中间以3′，5′—磷酸二酯键连接，如果不是应注明)。也是合成的方向！

第三节 DNA 的结构

一、 一级结构：DNA 分子中四种脱氧核苷酸的排列顺序。

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第20页 共132页 生物大分子，分子一般在5000b 以上。

二、 二级结构：双螺旋结构Watson Crick 1953提出。

拉直后：

5′ 3′

A C G T G C A T C T T

T G C A C G T A G A A

3′ 5′

1. 内容如下：

1）. DNA 分子是由两条多脱氧核苷酸链组成的，方向相反5′—3′，3′—5′以它们的糖 — 磷酸为主链，以共同的中轴，绕成右手螺旋，表面有大沟（两圈间）和小沟（两链间）。

2）．两条链上的碱基均在主链内侧（相对的两链中间）。且以氢键相连，形成碱基对AT 、GC ，其长度为双螺旋的直径2nm ，AT 间两个H 键，GC 间三个H 键。互补配对原则。

A 的1位N 与T 的3位NH ；A 的6位氨基氢与T 的4位氧形成氢键

G 的1位NH 与C 的3位N ；G 的6位氧与C 的4位氨基氢，G 的2位氨基氢与C 的2位氧分别形成氢键！

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第21页 共132页

3）．参数：碱基对平面垂直螺旋轴，糖环平面平行于螺旋轴，每个螺旋圈有10个碱基对，每圈的高度3.4nm ，相邻碱基对之间的距离为0.34nm ，碱基堆积力(疏水力)和H 键使双螺旋稳定，2碱基对间旋转的角度为36°（后来的测定证明每个螺旋含10.5个碱基对，高3.6nm ）。

单链DNA （ssDNA ）以碱基数表示其大小(b,nt)，如病毒θx174，M13 。 2. 双螺旋结构的依据

1）．X 射线衍射图谱：不同来源的DNA 图谱相似，呈两条具有螺旋结构的链，且有0.34nm 和3.4nm 两种周期性变化（碱基对与螺旋圈）Wilkins Franklin 2）．层析法分析DNA 的碱基组成A=T ，G ≡C （mol 比）。查盖夫

3）．P 基可用电位滴定，嘌呤和嘧啶不能滴定，说明埋在分子内形成了氢键。

DNA 双螺旋的类型：

类型 旋转方向

螺旋直径

（nm ） 螺距（nm ）

每圈的碱

基对数目 碱基对间垂直距离nm 碱基对与水平面倾角 A-DNA 75Na B-DNA 92Na Z-DNA CG C-DNA 45Li D-DNA AT

右 右 左 右 右

2.3 2.0 1.8

2.8

3.4

4.5 3.09 2.43

11 10 12 9.33 8

0.255 0.34 0.37 0.33 0.304

20° 0° 7° 6° 16°

Watson.crick 模型92%相对湿度的DNA 钠盐称B —DNA 。 75%相对湿度的DNA 钠盐，为A —DNA 结构随条件而变化

A-DNA 与DNA-RNA 杂交分子的构象及RNA 双螺旋部分的构象同、短、粗。

Rich 的Z —DNA 为人工合成的d （CpGpCpGpCpG ）结晶，双链绕成左手螺旋DNA ，P 基在多核苷酸主链上的分布呈“Z ”字形，所以叫Z —DNA 。表面只有一个沟（另

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