五指山猪近交系精原干细胞体外培养研究

对不同发育阶段五指山小型猪(WZSP)近交系的睾丸组织,采用不同的消化和培养方法进行了一系列的探索、研究。实验显示： 培养SSCs 的最佳时限为仔猪出生后1～20日龄;对不同日龄仔猪采用不同消化方法,以DMEM为基础培养液并添加不同成分,34℃,5%CO2培养箱中饱和湿度条件下培

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五指山猪近交系精原干细胞体外培养研究

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成钢J，冯书堂!"

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常德J湖南文理学院，

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北京!中国农业科学院畜牧研究所，

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摘要对不同发育阶段五指山小型猪（RSQF）近交系的睾丸组织，采用不同的消化和培养方法进行了一系列的探索、研究。

对不同日龄仔猪采用不同消化方法，以EUNU为基础培养液并添实验显示：培养QQG=的最佳时限为仔猪出生后JT!#日龄；

加不同成分，可获得较好的分离培养结果；原代QQG=在培养K3后，H"V，IWGX!培养箱中饱和湿度条件下培养，QQG=开始增殖，桑椹状的QQG=集落半悬浮隆突生长；细胞呈阳性反应；对QQG=细胞团在Q;X饲养层上进行传代培养，QQG=集落8YF染色，

培养"3左右大部分QQG=集落和单细胞消失；采用曲精细管组织贴壁培养法也同样获得桑椹状QQG=集落，细QQG=贴壁良好，

半悬浮生长。此外，睾丸组织在"VFZQ液中存放!"<后，仍可作为QQG=分离、培养的材料。结果表胞集落在培养I3后出现，

培养的技术方法，为其进一步深入研究提供了技术方法和操作明：本研究初步掌握了RSQF近交系精原干细胞体外分离、

依据。关键词

五指山猪，QQG=，消化方法，日龄，体外培养

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文献标识码

8

文章编号J###LH#$J（!##$）#"L#$KML#I

中图分类号

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国家高技术研究发展计划项目资助（*’)!##H88!#IJ##）。

对不同发育阶段五指山小型猪(WZSP)近交系的睾丸组织,采用不同的消化和培养方法进行了一系列的探索、研究。实验显示： 培养SSCs 的最佳时限为仔猪出生后1～20日龄;对不同日龄仔猪采用不同消化方法,以DMEM为基础培养液并添加不同成分,34℃,5%CO2培养箱中饱和湿度条件下培

A6:

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精原干细胞（!"#$%&’()(*+&,!’#%-#,,，../!）是指

未分化的0型精原细胞，位于雄性哺乳动物体内的曲细精管生精上皮基膜内，在复杂且高度有序的精子发生过程中占据极其重要的地位。精原干细胞独有的生物学特性，使其在医学、畜牧业生产等领域有其广阔的应用前景，转基因技术与精原干细胞异体及异种移植技术相结合将会为克隆动物、转基因动物生产及一些人类遗传性疾病的基因治疗提供新的机遇与途径。从所得资料，国外已成功对小鼠、大鼠、猪、人等多种哺乳动物睾丸内的精原干细胞进行

［3］过分离纯化。1#,,2#等报道，从生后45小鼠睾丸

产量达893:;中获得了纯度637的0型精原细胞，

［8］

个；（3666）从4:日龄仔猪睾丸分离出0<+$&%+等

［@］

型精原细胞的纯度达到6=7>647；1$((?等

已经沉降到管底的曲精细管小段，放置于事先涂有曲精细管应均匀涂散于皿中，明胶的@=%%培养皿，

最后用吸管吸除多余液体，放置于@CL，=7/M8培养箱中饱和湿度条件下培养，8CN后显微镜下观察

见曲精细管已贴壁时，小心加入培养液，继续培养观察。

!"#"$不同日龄DE.F睾丸细胞悬液的制备：

（3）3日龄，8日龄，@日龄，C日龄，A日龄，4日龄仔猪睾丸细胞悬液的制备：3日龄>4日龄仔猪睾丸由于体积小，重量轻，先用双抗F1.冲洗数次后，小心拨去睾丸被膜，在玻璃表面皿中用眼科剪剪碎，放入离心管，采用沉降或低速离心的方法去除血细胞，经多次洗涤后，用:B8=7的胰蛋白酶@;L水浴消化3:>3=%+*，见曲细精管软散，消化液中有大量单细胞时，用大剂量F1.液终止消化，沉降=>

收集上清，C层铜网过滤后多次离心洗涤，3:%+*后，

最后将沉降的细胞用适量培养液吹起，制得细胞悬液。

（8）33日龄，3C日龄，83日龄仔猪睾丸细胞悬液

的制备：由于此阶段睾丸内间质细胞已大量出现，消化程序为：将剪碎的曲细精管小段采用沉降或低速离心的方法去除血细胞，用:B=%)O%P胶原酶消化

然后加入:B8=7的胰蛋白酶@;L水浴消化3:=%+*，

消化液中有大量单细胞时，用大剂量F1.>3=%+*，液终止消化，沉降=>3:%+*后，多次C层铜网过滤，离心洗涤，沉降的细胞用适量培养液吹起，制得细胞悬液。

（@）通过曲3月龄以上猪睾丸细胞悬液的制备：细精管组织培养观察，此阶段睾丸内各种细胞已分化、种类繁多、复杂，将获得较纯的曲细精管小段用（!）消化=%+*，再加入:B8=7胰酶:B=%)O%P胶原酶

轻轻吹打，Q:B:C7H<R0@;L消化3:>3=%+*后，

中和后较大体积F1.多次重悬细胞，3:::$O%+*离心加入适量培养液吹散，制成细胞悬液，@%+*，"#$-(,,

不连续密度梯度离心，收集8:7>C:7梯度之间的生殖细胞，多次离心洗涤，最后将沉降的细胞用适量培养液吹起，制得细胞悬液。

取一滴制备好的生殖细胞!"#"%../!的原代培养：悬液，加入3:P:BC7台盼蓝混匀用红细胞记数板"记算细胞数目，调整细胞密度至@93:=个O%P，将细胞接种在预先涂有明胶直径@=%%的塑料培养皿中，每皿接种3B=%P，置于@CL、=7/M8培养箱饱和湿度条件下培养。!"#"&

小鼠成纤维细胞饲养层的制备：参考文献［=］。

（8::3）分离出人的精原细胞并进行低温冷冻保存实验。在国内，精原干细胞的分离、纯化主要集中在小

［C］

鼠，经纯化后其纯度可达A4B;A7（8:::，张学明）。

体外分离、培养../!是件费时、费力的工作，在目前，国内还没有见到关于猪../!体外分离、培养的系统报道。本实验的研究意义在于，确定体外分离、培养../!的相对日龄时限，最大程度，最为有效的的分离../!，总结出一套简单可行的消化培养方法及步骤。实验以五指山小型猪近交系为材料，更显示出其独特的研究意义和应用前景。

!

!"!

材料与方法

实验动物

中国农科院畜牧研究所提供五指山小型猪近交

系。分别采取3日龄、8日龄、@日龄、C日龄、A日龄、4日龄、8周龄、34日龄、83日龄、C:日龄、3月龄、8月龄、8月龄以上各个不同发育阶段DE.F的睾丸组织。!"#!"#"!

实验方法

基础培养液：<GHGI;B=7J1.I;B=7K1.

I37谷氨酰胺I37非必需氨基酸I37青链霉素使用前应将培养液在@CL，I37丙酮酸钠，=7/M8培养箱中孵育8N以上。

（目的是为了更好!"#"#曲精细管组织贴壁培养法

地在显微镜下观察曲精细管内部的发育情况，细胞类型，最终确定消化方法，同时也作为培养../!方法的另一种尝试）：无菌取出睾丸，去除睾丸脂肪垫、附睾及白膜，取出:B@>:B=)睾丸组织，用眼科剪将组织剪成大小一致的小块，采用静置法，双抗F1.液多次洗涤，去除红细胞及杂细胞，用吸管吸取适量

对不同发育阶段五指山小型猪(WZSP)近交系的睾丸组织,采用不同的消化和培养方法进行了一系列的探索、研究。实验显示： 培养SSCs 的最佳时限为仔猪出生后1～20日龄;对不同日龄仔猪采用不同消化方法,以DMEM为基础培养液并添加不同成分,34℃,5%CO2培养箱中饱和湿度条件下培

成钢等：五指山猪近交系精原干细胞体外培养研究

A<)

用!"#"$!!"#在小鼠成纤维饲养层上的传代培养：拨针将在曲精细管培养皿中和采用酶消化法平皿中形成的!!"#集落按一定的密度接种到有小鼠成纤维细胞饲养层的四孔板或$%&&培养皿上，每’(小时换液)次。

将!"#"%对形成的!!"#集落进行*+,染色鉴定：待测细胞用无钙镁离子的,-!液洗’.$次，无水乙醇(/固定)0&12，无钙镁离子的,-!液洗’.$次，用’%&&3456781#9"4（:;<=%）漂洗)次，加入新鲜配制的坚牢红*+,染色液，室温放置约$0&12后，阳性细胞呈现深红（褐）色，用无钙镁离子的,-!液终止染色，饲养层细胞、分化细胞不着色。按照上述方!"#"&睾丸组织(/冰箱存放’(>后，法进行精原细胞的分离接种培养。

图’

曲精细管培养法中出现的!!"#集落!!"#F3432EO1L>#E&121JE83K#F38I

B1CD’

（N’00

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结果

曲精细管组织贴壁培养法培养结果

).?日龄仔猪睾丸曲精细管培养显微镜下观

察，曲精细管管壁薄而透明，培养’(>后，曲精细管的两个断面，一部分细胞已“涌”到细管的外部贴铺于培养皿（图)），培养@’.<A>以后，大部分曲精细管段已不复存在，培养第%天后，!!"#集落出现，$

悬浮或半悬浮于已铺展的曲精.%个细胞为一团，

图$B1CD$

曲精细管间的成团间质细胞7>E4EPI1CFE44#MELOEE2#E&121JE83K#

（N’00）LKMK4EJ8HC&E2L#:>H#EF32L8H#L

杂，制取的!!"#纯度及质量较’0日龄以前的仔猪

显著降低。对).?日龄仔猪采用0=’%Q胰蛋白酶消化，对’.$周龄左右仔猪采用组合酶消化，以RSTS为基础培养液并添加不同成分，$(/，%Q"U’培养箱中饱和湿度条件下培养，均可获得较好的分离培养结果，实验证明：培养猪精原细胞的最佳时限为).’0日龄，此时睾丸组织内细胞类型较少，区分明显。表)为不同发育阶段VW!,睾丸内!!"!培养结果。

图)B1CD)

曲精细管内细胞的扩散情况7>EFE44#EG:H2I12!E&121JE83K#

#"’(()*原代培养及贴壁行为

（N)00）LKMK4EJ8HC&E2L#:>H#EF32L8H#L

原代细胞接种后$.(>混杂在其中的支持细

胞，间质细胞开始贴壁，细胞呈梭形或不规则多角形；部分精@.?>后绝大多数睾丸体细胞都已贴壁，原细胞开始贴壁，培养@’>后，睾丸内成纤维样细胞明显，!!"#散落分布于其间，).’日龄仔猪!!"#集落在培养$I左右出现，’.?日龄仔猪!!"#集落培养@.?I后，!!"#开始增殖，’.$个细胞成团出现，培养<.)0I较大的!!"#集落出现，?.)(I左右为!!"#的增殖期，!!"#细胞团数量可达’0.$0以上，桑椹状的!!"#集落悬浮或半悬浮生长，仅有（图%）

少量细胞贴于皿底，!!"#集落主体向培养液中隆突生长，随着培养时间的延长!!"#集落向周边扩散

细管附近，有的甚至完全贴于皿底。曲精细管周围主要为成纤维样细胞，支持细胞数量骤减；培养AI时，集落中的细胞团进一步增殖，有的可达)%.’%个以上（图’），培养?.<I后，集落基本消失。)月龄以

上睾丸曲精细管培养过程中，没有!!"#集落出现。（图$）#"#

不同日龄对猪精原干细胞体外培养的影响本实验采取不同发育阶段仔猪睾丸进行体外培观察结果显示：性成熟后猪睾丸制取!!"#养!!"#，过程中，由于睾丸内各种细胞已分化、种类繁多、

复

对不同发育阶段五指山小型猪(WZSP)近交系的睾丸组织,采用不同的消化和培养方法进行了一系列的探索、研究。实验显示： 培养SSCs 的最佳时限为仔猪出生后1～20日龄;对不同日龄仔猪采用不同消化方法,以DMEM为基础培养液并添加不同成分,34℃,5%CO2培养箱中饱和湿度条件下培

(EB

!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12生物工程学报B>>(，R13?BB，

F1?!

（图!），对""#$集落进行%&’染色，细胞呈阳性反

表!()*+,!

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-*.)/012

0*$0*+)>?@A>?!>?!A>?C>?CA>?D>?CA==?CABBAB?C=>A=B=>A=C=CA=D

应，染成红色（图(），其它细胞不着色。

不同发育阶段"#$%睾丸内$$&’培养结果(-,./+0/1,1,’/+023$$&’234533,1,602+4"#$%

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789（$(:）上的传$$&’在小鼠成纤维细胞饲养层

接种在小鼠成纤维饲养层上的""#$集落和单

代培养

成团的细胞，数小时后几乎全部贴壁，培养B!/后，细胞逐渐向四周扩散，培养第!天后，大部分""#$集落和成团状细胞消失，多数为散在的单个""#$，培养(AO,后大部分""#$消失，只有极少量""#$

图!J.)I!

桑葚状""#$集落在扩散（MB>>

）5/8$*61:098$0

分散牢固贴于";P饲养层，相差显微镜下观察，小鼠成纤维饲养层细胞和""#$层次分明，""#$透明，细胞的形态大小与原代培养的""#$无异。实验显示：贴壁良好，不能""#$集落接种在";P饲养层后，在";P饲养层上长期培养。78;

睾丸组织存放时间对$$&’培养的影响睾丸组织在!Q存放B!/后按上述分离培养方法进行""#$原代培养，通过相差显微镜连续观察，其贴壁行为，集落出现的时间与新鲜组织基本相同，由此说明睾丸组织在!Q存放B!/内仍然可进行""#$培养。

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图C

J.)IC

形成中的""#$集落

（MB>>

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<

<8!

讨论

猪不同发育阶段睾丸组织内的细胞类型哺乳动物的睾丸是一个极为复杂的组织，细胞

［O，E］

的分化类型较多。但在胎儿期以及性成熟前，支

持细胞和""#$为主要细胞类型。本实验中，通过曲精细管培养显微镜下观察，=AD,仔猪曲精细管内曲精细管间仅有少量形态扁仅有支持细胞和""#$，

平、体积较大的椭圆形细胞，估计为间质细胞的前体细胞，由于细胞类型较少，我们仅采用胰酶消化就可

图(

精原干细胞%&’染色呈阳性

（MB>>）J.)I(’1$.0.N*%&’$08.:.:)12""#$6131:*5/8$*61:098$0

得到富含""#$的细胞悬液，DAB>,仔猪曲精细管间，采用组合酶酶消化法去除有大量间质细胞（图@）

对不同发育阶段五指山小型猪(WZSP)近交系的睾丸组织,采用不同的消化和培养方法进行了一系列的探索、研究。实验显示： 培养SSCs 的最佳时限为仔猪出生后1～20日龄;对不同日龄仔猪采用不同消化方法,以DMEM为基础培养液并添加不同成分,34℃,5%CO2培养箱中饱和湿度条件下培

成钢等：五指山猪近交系精原干细胞体外培养研究

2-4

间质细胞后同样得到富含!!"#的细胞悬液，$%&后的猪睾丸细胞类型复杂，!!"#在细胞悬液中所占比例随日龄的增加而下降，不适合!!"#细胞悬液的制备。实验中，仅采用胰酶和胶原酶消化组织，并得到较高产量和活率的单细胞悬液，与张学明等（$%%%）和’()*+(等（,---）程序相比，我们没有用透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶（’.*#/）等。用本实验确定的日龄和方法，分离猪!!"#是有效的。!"#

$%&饲养层与$$’(培养的微环境

本实验接种到!01饲养层上的!!"#贴壁性能

（参考文献）)*+*)*,’*$

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［X］6>*GFY@（张学明），Z*(ZY（赖良学），Z(’Y（李德雪）!"#$L

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良好，但维持时间不长。!!"#的自我复制还是分化成各类生殖细胞的功能取决与细胞所处的微环境和干细胞本身的状态，微环境因素包括干细胞与周围细胞，干细胞与细胞外基质以及干细胞与各种可溶性因子的相互作用。在体内，!!"#与各类生殖细

胞，支持细胞形成微环境，支持细胞等分泌大量的不同种类的生长因子及各种细胞活性物质，对!!"#正常的增殖、更新、分化等生命活动提供了良好的在细胞微环境

［2，3］

；在体外，由于培养环境中缺少某些营

养成分等因素所营造的细胞微环境并不太充分，从而，!!"#的增殖能力及细胞状态会随培养时间的延长而丧失。本实验表明：!01饲养层辅助培养!!"#为!!"#体外培养提供的细胞生存微环境可能还不太完善，也可能与物种间细胞的差异有关，猪!!"#

［,%］

接种到!01饲养层上不能长期培养，与董武子等（$%%4）将山羊胎儿!!"#传代接种到!01饲养层上的结果一致。相信随着对培养条件的深入研究，可使56!7的!!"#体外长期培养提供可能。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/yvw4.html