转基因流程总结

一、取出保存的甘油菌，用接种环划线接种到LB固体培养基上，培养8—12h至单克隆长到2mm左右。

二、挑选独立的单克隆，用牙签接种到含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm的摇床上培养6—7h。

三、收获细菌，碱裂解法小量抽提质粒。 1、用1.5ml离心管收集菌液12000rpm离心1min

2、加100μL预冷溶液I，悬浮细菌，吸打均匀，也可vortex 3、加200μL溶液II，迅速颠倒离心管3—5次，至溶液澄清透明 4、加150μL预冷溶液II，迅速颠倒离心管3—5次，有大量白色沉淀生成

5、12000rpm离心5min，上清转移到干净的1.5ml离心管中，(加200微升Tris饱和酚和200微升氯仿：异戊醇24:1，颠倒混匀，放置5min，12000rpm离心10min，上清转到新的离心管)

加两倍体积的95%乙醇，放置2min。

6.12000rpm离心5min，弃上清，倒置10min，除尽残液

7.加1ml75%的乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清，倒置10min，除尽残液 8、加50μL含RNAse的TE(20μg/ml)，-20℃贮存

四、酶切质粒和目的基因

2μLBuffer

5μLDNA

1μL限制性内切酶 12μLdd H2O 五、琼脂糖凝胶电泳 0.7%琼脂糖凝胶进行电泳

20μL酶切产物 5μLDNA marker

2μL 10x loading buffer

六、回收目的条带

1.将目的条带用手术刀切下，称重置于1.5ml离心管中

2.以1μL/μg加入等体积的溶液I，50—60℃水浴10min，期间VORTEX3—5次至胶全融

3.将溶液转移到纯化柱内，加700μL溶液II，12000rpm离心1min，倒弃收集管内溶液

4.再加500μL溶液II，12000rpm离心min，倒弃收集管内溶液 5．12000再离心1min，甩干残余溶液

6.将柱子转移到干净的1.5ml离心管，加30ml溶液III洗脱，12000rpm离心1min，所得即为回收目的DNA

七．连接目的基因和质粒（37℃温育1h）

dd H2O 4μL 目的基因片段3μL 开环质粒 10μL T4DNA ligase 1μL T4DNA ligase buffer2μL 八、转化

1.感受态细胞冰浴15min

2.将10μL目的质粒DNA加到200μL的感受态细胞中，吸打均匀，冰上放置30min 3.放入42℃水浴热击90s，迅速放冰上2min 4加700μL LB培养基37℃孵育1h 九、涂布棒涂板，LB液体培养基扩大培养

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