表观遗传学药物影响乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的研究

第49卷Vol．49第7期No．7山东大学学报（医学版）

JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY（HEALTHSCIENCES）2011年7月Jul．2011

文章编号：1671－7554（2011）07－0029－06

表观遗传学药物影响乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的研究

1，23241

王新刚，王笑峰，李福年，侯琳，杨其峰

（1．山东大学齐鲁医院乳腺外科，济南250012；2．青岛大学医学院附属医院乳腺外科，山东青岛266100；

3．青岛大学医学院微生物学教研室，山东青岛266021；

4．青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室，山东青岛266021）

摘要：目的明确表观遗传学药物对乳腺癌细胞系抑癌基因BRCA1及CHD5表达的作用，探讨此类药物在乳腺

AZA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA分别作用于乳腺采用去甲基化制剂5-

癌临床治疗中的合理应用。方法

MCF-7及乳腺正常上皮细胞HBL-100，5-AZA终浓度分别为0、0．5、1．0、2．5、5．0和10．0μmol/L，癌细胞系T47D、

TSA终浓度分别为0、0．25、0．5、0．75、1．0和1．5μmol/L。荧光定量RT-PCR检测各浓度5-AZA作用12、24、4812、24、48及72hBRCA1和CHD5的表达水平，及72h，各浓度TSA作用6、并行甲基化特异PCR（MSP）检测两基因的甲基化状态。结果2．5μmol/LAZA和0．5μmol/LTSA作用可提高乳腺癌细胞系BRCA1及CHD5的表1．5μmol/LTSA作用反致表达降低，达，而10μmol/LAZA和1．0、且对乳腺正常上皮细胞呈毒性作用。MSP未7细胞两抑癌基因及T47D细胞BRCA1甲基化状态的影响，能发现AZA和TSA对MCF-而两种药物均可逆转T47D细胞CHD5的甲基化状态。结论

表观遗传学药物对乳腺癌细胞抑癌基因表达的影响具有给药剂量及时

本研究可为此类药物在乳腺癌治疗中的科学应用提供实验依据。间限制性，

BRCA1；基因，CHD5关键词：乳腺肿瘤；表观遗传学；基因，中图分类号：R737．9

文献标志码：A

EffectsofepigeneticdrugsonBRCA1andCHD5expressions

inbreastcancercells

2

WANGXin-gang1，，WANGXiao-feng3，LIFu-nian2，HOULin4，YANGQi-feng1

（1．DepartmentofBreastSurgery，QiluHospitalofShandongUniversity，Jinan250012，China；2．DepartmentofBreastSurgery，AffiliatedHospitalofMedicalCollegeofQingdaoUniversity，

Qingdao266100，Shandong，China；

3．DepartmentofMedicalMicrobiology，MedicalCollege，QingdaoUniversity，Qingdao266021，Shandong，China；

4．DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，MedicalCollege，QingdaoUniversity，

Qingdao266021，Shandong，China）

Abstract：Objective

Toinvestigateeffectsofepigeneticdrugsonexpressionsofbreastcancersusceptibilitygene1

MCF-7，T47DandHBL-100cellswereexposedto5-azacytidine（5-

（BRCA1）andchromodomainhelicaseDNA-bindingprotein（CHD5）inbreastcancercells，andexploretheproperuseofthesedrugsinbreastcancertherapy．Methods

AZA）of0，0．5，1．0，2．5，5．0and10．0μmol/Lfor12，24，48and72h，andtrichostatinA（TSA）of0，0．25，0．5，0．75，1and1．5μmol/Lfor6，12，24，48and72h．Aftertreatment，BRCA1andCHD5expressionsweredeterminedbyquantitativeRT-PCR，andmethylationstatusofbothgeneswasdeterminedbymethylation-specificPCR（MSP）．

03-31收稿日期：2011-基金项目：山东省教育厅课题（J09LC19）。

作者简介：王新刚（1978－），男，博士研究生，主要从事肿瘤分子生物学的研究。

mail：qifengy@gmail．com通讯作者：杨其峰（1970－），男，博士生导师，主要从事肿瘤分子生物学的研究。E-

Results2．5μmol/Lof5-AZAand0．5μmol/LofTSAcouldimproveexpressionsofBRCA1andCHD5inbreastcancercells，whiledrugswithtoohighdoses，10μmol/LofAZAand1and1．5μmol/LofTSAcoulddecreasebothgeneexpressionsandwereeventoxictonormalcells．MSPshowednoalterationsinmethylationstatusofBRCA1inei-thercelllineorCHD5inMCF-7aftertreatment，whilebothagentscouldreversemethylationstatusofCHD5inT47D．Conclusion

Epigeneticdrugshaveadose-andtime-dependentinfluenceontumorsuppressorgeneexpression，andthe

presentstudyprovidesfundamentalexperimentaldatafordesignedepigenetictherapyofbreastcancer．Keywords：Breastneoplasms；Epigenetics；Genes，BRCA1；Genes，CHD5

研究表明，乳腺癌的发生发展过程中不仅存在基因突变或缺失，同时还有异常的表观遗传学改变

［1-2］

为罗氏公司产品。

1．1．3引物及探针序列

。表观遗传学机制导致的抑癌基因功能丧失

本研究所用甲基化特异

PCR引物及BRCA1实时定量RT-PCR引物及探针5，8-9］分别参照文献［设计；CHD5和GAPDH实时PCR引物及探针序列如表1所示，定量RT-由宝生物

是导致乳腺癌发生发展的关键因素。BRCA1

（breastcancersusceptibilitygene1）基因是乳腺癌易感基因，能通过多条信号转导途径抑制细胞增殖，诱

［3］

导细胞凋亡，是一个重要的细胞周期负调控子。CHD5（ChromodomainhelicaseDNA-bindingpro-tein）基因是于2007年新发现的抑癌基因，定位在1号染色体1p36区，通过pl9Arf/p53通路调控细胞衰老和凋亡，是抑癌调控系统的总开关增殖、

［4］

公司设计；所有引物及探针均由宝生物公司合成。

表1

引物及探

针名称CHD5-FCHD5-RCHD5-P

引物及探针序列

序列

5'-CATCCCCTACTACGACAACCTC-3'5'-GACCGTGGGGTCCACAATG-35'-CGGCGGCTTCTCCTGCTTGTCGTC-3'

99163产物长度（bp）

。

。在乳腺癌中，两基因均有较高的甲基化发生率

本研究应用DNA甲基转移酶（DNAmethyltrans-ferases，DNMT）抑制剂5-azacytidine，氮杂胞苷（5-5-AZA）和组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylase，HDAC）抑制剂TSA（trichostatinA，TSA）对乳腺癌

7及T47D进行处理，细胞系MCF-并以永生化的乳100为对照，腺正常上皮细胞系HBL-观察两种药物

对抑癌基因BRCA1及CHD5mRNA转录表达的影响，同时检测药物作用前后两抑癌基因甲基化状态的改变，以期明确表观遗传学调控对乳腺癌抑癌基因表达的作用，并为表观遗传学药物用于乳腺癌治疗提供实验依据。

［5-7］

GAPDH-F5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3'GAPDH-R5'-TAGCCCAGGATGCCCTTGAG-3'GAPDH-P5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCACCT-3'

1．21．2．1

方法

100、T47D和细胞培养及药物处理HBL-MCF-7三种细胞均培养于含10%小牛血清的MEM培养基。取处于对数生长期的单层培养细胞，消化

5

后计数，调整细胞密度为5×10个/mL，按每孔

1mL接种6孔培养板，接种24h后去上清，加入含5-AZA或TSA的培养液，5-AZA终浓度分别为0、0．5、1．0、2．5、5．0和10．0μmol/L，TSA终浓度分别0．25、0．5、0．75、1．0和1．5μmol/L，同时设不为0、

加药物培养的空白对照组。用药后继续放入37℃、5%CO2培养箱培养，AZA组分别在12、24、然后5-48及72h各收集两孔细胞用以分别提取DNA和RNA，12、24、48及72h各收而TSA组则分别在6、集两孔细胞以分别提取DNA和RNA。1．2．2实时定量RT-PCR分析5-AZA及TSA作

用后乳腺癌细胞抑癌基因的表达变化收集0、0．5、1．0、2．5、5．0和10．0μmol/L5-AZA，0、0．25、0．5、0．75、1．0和1．5μmol/LTSA处理的乳腺癌细

以Trizol试剂提取各组细胞总RNA作为模板，胞，

PCR试剂盒分别检测细利用QuantiTectProbeRT-CHD5mRNA的表达，胞中BRCA1、并同时检测管家基因GAPDH作为内参照。每份RNA样品都做

1

1．1

材料与方法

材料细胞系

1．1．1

MCF-7，人乳腺癌细胞系T47D、人

100均购自中国科学院上海乳腺上皮细胞系HBL-生命科学研究院。

MEM培养基主要试剂及仪器小牛血清、AZA、TSA、为Gibco公司产品。5-亚硫酸氢钠（so-

1．1．2

diummetabisulfite）、氢醌（hydroquinone）为Sigma

Quanti-公司产品。Trizol为Invitrogen公司产品，TectProbeRT-PCR试剂盒及QiaexIIGelExtractionVeriti扩增仪为试剂盒均购自Qiagen公司。Multi-AB公司产品，LightCycler480II实时定量扩增仪

3次重复检测，取其平均Ct值用于分析。20μL扩

MasterMix10μL，上下游增体系中包括ProbeRT-RTMix0．2μL，引物及探针（20μmol）各0．4μL，

50℃模板RNA2μL。扩增条件为：60℃5min，30min，93℃15min进行逆转录及变性，93℃15s，50℃30s，72℃1min，进行5个预循环，然后以

93℃15s，55℃15s，72℃15s，扩增40个循环，55℃时收集荧光信号。

抑癌基因mRNA表达量变化以公式2△△计算。其中△Ct为每份标本中抑癌基因与GAPDH的Ct值之差，而△△Ct为药物作用组与空白对照组△Ct之差。1．2．3

specificPCR，甲基化特异PCR（Methylation-MSP）方法检测药物作用前后乳腺癌细胞株中

BRCA1及CHD5的甲基化状态基因组DNA采10］的方法进用酚－氯仿法抽提。MSP参照文献［

加入3mol/L行。取1～5μgDNA溶于30μLTE，

NaOH3．3μL，37℃放置10min变性。亚硫酸溶液

须新鲜配制：称取1．82g亚硫酸氢钠，加入2．8mL水和3mol/LNaOH430μL，完全溶解后加入10mmol/L氢醌210μL。混合后，向已变性的DNA

55℃避光水浴4h。中加入该亚硫酸溶液333μL，

以QiaexIIGelExtraction试剂盒回收并纯化后，将

修饰的DNA溶于50μLTE，加入5．56μL3mol/LNaOH，37℃放置15min脱硫，乙酸调pH=7．0，再所得次以QiaexII试剂盒纯化后溶解于50μLTE，

－（

Ct）

DNA溶液即可用于MSP分析。PCR反应循环条

94℃30s，60℃30s，72℃30s，进件：95℃10min，

行40个循环，最后72℃延伸5min。BRCA1甲基

化引物扩增产物长度为75bp，非甲基化引物扩增产物为86bp。CHD5两对引物扩增产物均为119bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳、Biored染色后，紫外灯下观察结果。

1．3统计学处理应用SPSS13．0软件，双侧t检

P＜0．05为差异有统计学验法进行统计学分析，意义。

2

2．1

结果

AZA和TSA对乳腺癌细胞系BRCA1表达的

1．0、2．5、5．0和10．0μmol/L5个不同影响经0．5、

7后，浓度的AZA处理乳腺癌细胞T47D和MCF-BRCA1mRNA表达量较空白对照组均有显著提高

（图1）。T47D细胞BRCA1表达量在2．5μmol/LAZA作用48h时达最高值，为空白对照组的9．85

7细胞BRCA1表达量在倍（P＜0．05）；而MCF-

5μmol/LAZA作用48h时达最高值，为空白对照

100细胞经AZA组的20．25倍（P＜0．05）。HBL-BRCA1表达量有所降低，作用后，且5μmol/LAZA

作用72h及10μmol/LAZA作用48h后，均检测不到BRCA1的表达

。

图1AZA对乳腺癌细胞系BRCA1表达的影响

Fig．1InfluenceofAZAontheBRCA1expressioninbreastcancercells

0．5、0．75、1．0和1．5μmol/L5个不经0．25、

7同浓度的TSA处理后，乳腺癌细胞T47D和MCF-中BRCA1的表达在较低浓度药物组24h内呈升高

趋势，并具时间剂量依赖性，且分别在0．5μmol/L和1．0μmol/L时达最高值，为空白对照组的4．39（T47D，P＜0．05）及4．62（MCF-7，P＜0．05）倍；24h后BRCA1表达趋于降低，MCF-7细胞72h时各浓度组均达空白对照组的两倍，而T47D组在0．5μmol/L及更高浓度组48h后均检测不到BRCA1的表达（图2）。低浓度TSA作用对HBL-

100细胞BRCA1表达无影响，0．75μmol/L组48h

72h则检测不到表达。1μmol/L和起表达降低，

1．5μmol/LTSA作用使BRCA1表达降低，两组细

胞均在48h完全脱落，并在12h后即检测不到该基因表达。

2．2AZA和TSA对乳腺癌细胞系CHD5表达的影响7细胞CHD5不同浓度AZA均可使T47D及MCF-表达升高，并分别在2．5μmol/L和5．0μmol/L组48hP＜0．05）达最高值，为空白对照组的4．15（T47D，

7，P＜0．05）倍；72h各浓度组CHD5及6．75（MCF-

表达量均降低至空白对照组表达量的3倍左右（T47D，2．88～3．47；MCF-7，3．54～4．43）（图3）。

AZA作用可降低HBL-100细胞CHD5的表达，各浓

度组表达量降至空白对照组的0．45～0．68

。

图2TSA对乳腺癌细胞系BRCA1表达的影响

Fig．2InfluenceofTSAontheBRCA1expressioninbreastcancer

cells

图3AZA对乳腺癌细胞系CHD5表达的影响

Fig．3InfluenceofAZAontheCHD5expressioninbreastcancercells

T47D细胞经TSA作用后，0．25μmol/L和0．5μmol/L组CHD5表达量在24h及以后始见升高，0．75μmol/LTSA作用48h达最高值，为空白对照组的7．28倍（P＜0．05）；1．5μmol/LTSA作用使CHD50．75、1．0及1．5μmol/L组72h均检测不到表达降低，

CHD5表达。各浓度TSA均可使MCF-7细胞CHD5

0．5及0．75μmol/L组48h内表达升高，且在0．25、

0．75μmol/LTSA作用48h呈剂量及时间依赖性，

达最高值，为空白对照组的5．46倍（P＜0．05）（图4）。TSA可降低HBL-100细胞CHD5表达，且0．75μmol/L组48h、1μmol/L和1．5μmol/L作用24h后该基因表达均已检测不到

。

图4TSA对乳腺癌细胞系CHD5表达的影响

Fig．4InfluenceofTSAontheCHD5expressioninbreastcancercells

2．3AZA和TSA对乳腺癌细胞系BRCA1及

选取T47D和

CHD5基因甲基化状态的影响

MCF-7细胞经药物作用后抑癌基因表达至最高值及同时期空白对照组的DNA样品，行MSP检测抑7及T47D癌基因的甲基化状态。BRCA1在MCF-MSP未见AZA和TSA细胞中均呈非甲基化状态，

7中呈非甲基影响其甲基化状态。CHD5在MCF-且用药后MSP检测未见变化；该基因在化状态，

T47D中呈不完全甲基化状态，经2．5μmol/LAZA或0．75μmol/LTSA作用48h后，其甲基化状态得到逆转（图5）。

图5

乳腺癌细胞系BRCA1（A）和CHD5（B）基因甲基化

状态

Fig．5MethylationstatusanalysisofBRCA1（A）andCHD5

（B）inbreastcancercellsbymethylation-specificPCR

［19］

3讨论

。TSA单

［20］

Xiong独应用即可重建甲基化沉默的基因表达，酰化介导组蛋白甲基化的逆调控机制等

［21］

表观遗传学调控导致的抑癌基因沉默或低表达

［11］

基已被证实是肿瘤病因学上的关键进程。其中，因启动子甲基化和组蛋白乙酰化是调节染色体结构

进而控制基因表达的两个主要机制。表观调控由于不涉及DNA序列改变而具有可逆性，这使其成为

DNMT和肿瘤临床治疗的新靶标。研究表明，

HDAC抑制剂可重建或增强肿瘤中抑癌基因的表

［12-15］

，达并抑制肿瘤细胞增殖因此，这两类制剂已成为治疗多种肿瘤的候选药物。

AZA和TSA对乳腺癌细胞系本研究应用5-T47D及MCF-7进行处理，并以永生化的乳腺正常100为对照，上皮细胞系HBL-观察表观遗传学调控

对抑癌基因BRCA1及CHD5表达的影响。定量RT-PCR结果提示，不同浓度AZA作用均可提高T47D及MCF-7细胞两抑癌基因的表达。TSA各7细胞两基因的表达，浓度可增强MCF-低浓度TSA

作用短时间亦可使T47D细胞抑癌基因表达升高，而高浓度长时间作用则可使抑癌基因表达低于空白

甚至完全关闭其表达。此时管家基因表达亦对照，

降低，至正常值的1/4～1/8（数据未显示），推测过乙酰化可破坏染色体正常构象，降低全基因组表达水平

［16］

发现TSA可通过调节DNMT3B的活性影响

基因的甲基化状态，证实TSA可介导由多条途径调控癌细胞抑癌基因的表达。

目前虽已有表观遗传学药物应用于肿瘤的临床治疗，但为降低毒性，取得最佳疗效，其给药剂量及一定剂量给药时间仍须探讨。本研究结果显示，

AZA和TSA作用可提高乳腺癌细胞系BRCA1及CHD5的表达，且药物对不同细胞系不同基因表达的作用不一致；而过高剂量药物作用反致表达降低，且对乳腺正常上皮细胞呈毒性作用，进一步证实了个体化用药及制定最佳用药方案的重要性。为表观遗传学药物在乳腺癌临床治疗中的科学应用提供实验依据。

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［2］

。

低浓度AZA和TSA作用较短时间时对乳腺正

100抑癌基因表达无影响，而高浓常上皮细胞HBL-1μmol/L和度长时间作用可使抑癌基因表达降低，

1．5μmol/LTSA作用48h细胞完全脱落，提示维持甲基化/去甲基化和乙酰化/去乙酰化的平衡状态对维持正常基因表达和细胞正常功能非常必［17-18］

。要

尽管AZA作用可提高乳腺癌细胞两抑癌基因

7细胞但MSP未能显示AZA对MCF-的表达，

BRCA1和CHD5及T47D细胞BRCA1甲基化状态

的影响，提示可能有本研究所用甲基化特异引物扩增区域以外的CpG岛参与基因表达的甲基化调控。AZA作用可逆转T47D细胞中CHD5的不完全甲这与AZA可共价结合基化状态并使其表达升高，

DNMT1，降低酶活性而实现去甲基化的功能相符。TSA作用亦可逆转T47D细胞中本研究同时发现，

CHD5的不完全甲基化状态。有别于普遍认可的CpG甲基化后，通过甲基化DNA结合蛋白募集组蛋白去乙酰化酶及其他转录相关因子，进而调控基因表达的传统理论，近来研究揭示了一条DNA乙

34

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山东大学学报（医学版）49卷7期

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（编辑：刘霞）

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（编辑：徐苗蓁）

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