重组人生长激素对体外培养成骨细胞的影响

牙体牙髓牙周病学杂志 ( Chin J Conserv Dent) 2005, 15 ( 8 )

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重组人生长激素对体外培养成骨细胞的影响

石 勇 ,李晓红 ,郭三萍 ,宋 玮

1 1 1

2

( 1.西安交通大学口腔医院 , 710004; 2.第四军医大学口腔医学院 ,陕西西安 710032)

[摘 要 ] 目的 :观察重组人生长激素对体外成骨细胞直接、期的影响。短 方法 :将不同浓度的重组人

生长激素 ( recombinant human grow th hormone, RHGH )加入大鼠成骨细胞培养体系 ,观察不同作用时间点对大鼠 成骨细胞的增殖、性磷酸酶活性及细胞周期的影响。碱 结果 : RHGH对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性均有影 响 ,它可促进成骨细胞增殖 ,提高其碱性磷酸酶活性 ,且可促使细胞周期中 S期、G2 /M期细胞百分比增加 ,其作 用强度随浓度增加有增强趋势。结论 : RHGH对成骨细胞的合成代谢有直接影响 ,对成骨细胞的增殖、性磷碱 酸酶活性影响远强于雌激素。 [关键词 ]成骨细胞 ;重组人生长激素 ;细胞增殖

[中图分类号 ] R780. 2 [文献标识码 ] A [文章编号 ]1005 - 2593 ( 2005 ) 08 - 0443 - 04 [牙体牙髓牙周病学杂志 , 2005, 15 (8) : 443 ]

Effect of recombinant human growth hormone in cultivated

osteoblasts of rats in vitro

SH I Yong , L I Xiao - hong, GUO San - p ing, SONG W ei

( College of S tom atology, X i′ J iaotong U niversity, X i′ 71004, China) an an

[ Abstract] A IM : To investigate the direct, short term effects of recombinant human grow th hormone (RHGH) ent doses in different tim e, and then cell p roliferation, the activity of alkaline phosphatase (ALP ) and cell cycle were observed. RESUL TS: RHGH stim ulate p roliferation and ALP activity of osteoblasts. A t the same tim e, S phase and G2 /M phase percentage was significantly higher as compared w ith the control. The effects tended to get stronger as the concentrations increased. CO NCL US IO N: The results obstained in this study suggest that rh - gh exerts direct anabolic effects on osteoblasts. The effects of rh - gh were higher than the estrogen.

[ Key words] osteoblasts; recombinant human growth hormone; cell p roliferation [ Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2005, 15 ( 8 ) : 443 ]

生长激素是垂体分泌的一种促进生长发育的临床实验 ,均发现生长激素对骨代谢有重要作

激素 ,与机体代谢关系密切 ,临床上用于小儿生长 下等

[1]

用

[3 - 5]

。本实验以雌激素为阳性对照 ,研究了不

手 发育迟缓、术或创伤恢复期、老年人免疫功能低同浓度的 RHGH对体外培养成骨细胞的增殖、分

。已有动物实验表明 ,基因重组人生长激 化及细胞周期影响 ,为 RHGH对骨质疏松的治疗

素 ( recombinant hum an grow th hormone, RHGH )对研究提供理论依据。 去势大鼠的骨代谢有显著影响

[2]

。国外学者也对

生长激素应用于骨代谢疾病的治疗进行了大量的

3 收稿日期 : 2005 - 04 - 05;修回日期 : 2005 - 06 - 14

1 材料和方法

1. 1 材料

重组人生长激素 ( RHGH ,长春金赛药业有限

基金项目 :陕西省科技计划项目 ( 2003k10 - G78) 3

作者简介 :石勇 ( 1978 - ) ,男 ,汉族 ,山东荣城人。硕士生 (导责任公司 ) ; 17β -雌二醇 ( Sigma ) ,碱性磷酸酶试

师 :李晓红 )剂盒 (中生北控生物科技股份有限公司 ) ;出生 2 d

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的 SD大鼠 (第四军医大学实验动物研究中心 ) ;酶 联免疫检测仪 (国营华东电子管厂 ) ;流式细胞仪 (美国 )。 1. 2 方法

1. 2. 1 体外培养大鼠颅骨成骨细胞 (OB )

取出生 2 d的 SD大鼠 ,弯剪断头 ,将头部浸入 PB S培养液中分离颅盖骨。将分离好的颅盖骨在 含血清的 DM EM培养液中剪碎 ,大小为 1 mm。 用牙科探针均匀拨开 ,每瓶大约接种 20～30块。 将培养瓶底部向上加入含 100 mL /L胎牛血清的 DM EM培养液 ,盖好瓶盖后 ,松半圈放入 CO2孵箱 中 , 37℃ 500 mL /L CO2孵育 2 h,然后翻转使瓶底 朝下 ,以后每 3 d换液 1次 ,待细胞铺满培养瓶底 时 ,以 2. 5 g /L胰蛋白酶消化 ,并传代培养。所用 实验细胞均为第 6代细胞。 1. 2. 2 OB的鉴定

免疫组化检测细胞Ⅰ型胶原的表达阳性 ,重氮 盐法检测细胞具有碱性磷酸酶活性 ,四环素荧光染 色法检测细胞具有矿化能力 ,提示实验原代培养细 胞为成骨细胞。

1. 2. 3 实验分组

①空白对照组培养基为基础培养基。②阳性 对照组培养基含有 17β -雌二醇 ,浓度分别为 : 1× 10

- 12

3

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ALP底物反应液 150μL , 37℃ 40 m in,加入 50μL 碳酸氢钠终止反应。在 410 nm波长 ,通过酶联免 疫检测仪测定光吸收值 A ,即碱性磷酸酶 (ALP)活 性。以空白对照组药物光吸收值 A 0为 100% ,其 他各组 A值与 A 0相比 ,计算各组比值。 1. 3. 3 OB细胞周期的测定

将培养的细胞经胰蛋白酶消化、混匀后 ,以 5×10 4/mL密度接种于 6孔板中 ,培养 24 h后再 换成含有不同浓度 RHGH的培养液 ,继续培养 48 h, 2. 5 g /L胰蛋白酶消化收集各组细胞。加入 P I染料 , 4℃染色 30 m in,上机流式细胞术 ( FCM ) , 联机专用软件进行处理。 1. 4 统计分析

采用 SPSS 13. 0软件进行统计学处理 ,不同组间 比较采用单因素方差分析 ,分别进行 F检验和 SNK - q检验。所有数据用均数±准差 (x±)表示。 标 s 用眼科镊将组织块接种于 25 mL培养瓶的底部 ,并

2 实验结果

2. 1 重组人生长激素对 OB增殖的影响 (表 1,图 1)

表 1 RHGH对成骨细胞增殖的影响 ( x±s, n = 12 )

RHGH A值

( ng /mL ) 24 h PR ( % ) 48 h PR ( % ) 空白对照 0. 390± 011 010 0. 100 0. 267 ± 0. 100 0. 1 0. 398± 013 0. 102. 0513 177. 9026 1 0. 405± 0260. 103. 8462 179. 0262 10 0. 409± 013 104. 8718 179. 4007 0. 100 105. 3846 185. 3933 200 108. 7179 188. 3895 500 107. 9487 174. 9064

( a)、1×10 - 10 ( b)、1×10 - 8 ( c)、1×10 - 6 ( d)、

- 5

1×10 ( e )、1×10 - 4 mol/mL ( f)。③实验组培养

基含 RHGH ,质量浓度分别为 : 0. 1 ( a )、1 ( b )、10 ( c)、100 ( d)、200 ( e )、500 ng /mL ( f)。药物作用 时间为 24和 48 h。实验采用 96孔板 ,各浓度组均 为 12孔。 1. 3 观察指标

1. 3. 1 OB增殖功能的测定

不同浓度的 RHGH作用于成骨细胞 24 h,

M TT法检测的 100、200、500 ng /mL 3个浓度的光 吸收值均较空白组升高 ,与空白组相比 ,差异有显 著性 ( P < 0. 01 )。作用 48 h,各实验组与空白对 照组相比 ,差异均有显著性。

将细胞按 1×10 /孔密度接种于 96孔培养板 内 ,预培养 24 h后 ,吸弃原培养液 ,每孔加 100μL 无血清培养液 ,再培养 24 h后换成含不同浓度药 物的培养液 ,分别在培养 24、48 h后 ,采用 M TT 法 ,酶联免疫检测仪于 490 nm处比色测定。结果 以 A值表示 ,计算 OB增殖率 ( p roliferationrate, PR ) 为 A /A 0×100% , A 0为空白对照组药物光吸收值。 1. 3. 2 OB碱性磷酸酶 (ALP)活性测定

OB在不同浓度药物的培养液中培养 24、48 h 后 ,吸弃培养液 , PBS洗 2次细胞 ,加入 1 mL /L Triton X - 100 50μL ( Sigma ) , 4℃过夜 ,然后加

4

0. 475±0. 0113 0. 479±0. 0233

0. 478±0. 0203

图

1 RHGH和雌激素对成骨细胞增殖影响的比较 (n = 12)

0. 411±00930. 495±

±0203 0. 467± 0. 421 0. 424±00730. 503±

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横坐标表示两种药物浓度由低到高的分组 ,均 各为 6组 ( a～f)。从 OB细胞增殖率 ( PR )来比较 , 作用 48 h后 , RHGH对 OB增殖的影响远大于雌激 素组。 PR值与药物浓度之间的关系 , RHGH是随着 浓度的增高而增高 ,而雌激素组恰恰相反。 2. 2 OB碱性磷酸酶 (ALP)测定 (图 2、3)

对 OB细胞进行的 FCM检测表明 ,在

10 ng /mL RHGH作用后 , OB细胞周期发生了改 变 , S期细胞百分比显著高于空白对照组 ( P < 0. 05)。 200 ng /mL RHGH作用下 , S期、 G2 /M期细胞百分比、P I显著高于空白对照组 ( P < 0. 01)。实验组间 S期、G2 /M期细胞百分比 有显著性差异 ( P < 0. 01)。

3 讨论

随着年龄的变化 ,大约在 40岁以后 ,人体骨质

就开始逐渐疏松 ,骨密度下降 ,而颌骨和牙槽骨吸 收萎缩、松更为明显。老年人特别是绝经后的妇 疏 女 ,这种现象更为明显

6。颌骨骨量丢失是影响

到牙齿存留、齿及种植体修复效果的重要因素 , 义 牙槽骨丧失是一个严重而普遍的临床问题 ,所以 , 如何防止口腔骨量丢失 ,增加颌骨骨量 ,是许多口 腔医师面临的难题。

传统的骨质疏松药物 ,如雌激素、钙素等 ,都 降

是通过降低骨转换、制破骨细胞性骨吸收而发挥 抑 作用 ,可以阻止患者骨量进一步丢失 ,但不能恢复 已经丢失的骨量和退变的骨结构 7。生长激素治 疗骨质疏松症的理论来源于一些临床和实验研究。 有研究报道 ,老年人存在生长激素分泌功能减退 , 尤其是患骨质疏松症的老年人。国外临床实验表 明 :对生长激素缺乏的患者注射重组人生长激素 , 1 年后可以提高患者腰椎的骨矿物质密度 8。生长 激素在成熟骨的改建过程中起到积极作用 ,可以诱 导成骨细胞前体细胞的增殖

9

图 2 RHGH对成骨细胞 ALP活性的影响 ( n = 12 )

24 h,与对照组相比 ,浓度为 100 ng /mL的 RHGH增强成骨细胞 ALP活性 ,且有显著性差异 ( 0. 05 < P < 0. 01 )。 48 h,各浓度组与空白对照组 相比 ,均有显著性差异 ( P < 0. 01 ) ,但不同浓度组 间差异无显著性。

作用 48 h后 , RHGH组成骨细胞 ALP活性远 大于雌激素组 (图 3)。

。 Isaksson等的研

究结果表明 ,生长激素能够直接作用于软骨和骨组 织的生长 ,这些组织中包括骨中的成骨细胞。

RHGH具有与人体内源性生长激素同等的作 用。成骨细胞的数量变化和新陈代谢强度 ,反映着 成骨细胞的增殖能力 [ 10。ALP活性是成骨细胞分 化成熟的重要标志之一

图 3 RHGH和雌激素对成骨细胞 ALP活性影响的比较 ( n = 12 )

[ 11 ]

。成骨细胞分泌 ALP

至细胞外基质中 ,使局部磷酸含量增高 ,促使基质 矿化 ,其活性水平可以反映成骨细胞的功能和活性 状态 [ 12。已有动物实验表明 : RHGH能显著增加 成骨发育不全小鼠骨矿物质含量 (BMC)

[ 13 ]

2. 3 OB细胞周期的测定 (表 2)

表 2 流式细胞术检测 OB的细胞周期结果 ( x±s, n = 6)

RHGH P I = ( S + G2 /M ) /

G0 / G1%期S%期G2 /M %( ng /mL ) ( G1 + S + G2 /M )

。本实

验通过 M TT法和 ALP测定法 ,得出了不同浓度组 RHGH对成骨细胞增殖和 ALP活性的影响 ,结果 表明 :不同浓度 RHGH对成骨细胞的增殖和 ALP 活性影响呈剂量依赖关系 ,促进成骨细胞的增殖和 ALP活性表达能力要强于雌激素组。考虑其原因

空白对照 10 200

91. 13±1. 92 7. 00±1. 65 1. 87±3. 21 85. 37±1. 68 11. 47±1. 30 3. 17±1. 84 77. 93±3. 27 13. 13±1. 30 8. 93±1. 99

期8. 87±1. 92 14. 64±1. 86 22. 07±3. 27

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可能是雌激素对骨骼的最终作用是在骨吸收水平 ,

[ 14 ]

调节破骨细胞的活性及破骨前体细胞的分化 , 抑制破骨细胞性骨吸收而发挥作用。而生长激素 则不然 ,它对骨质疏松大鼠松质骨的骨转换无显著 影响 ,但骨量却明显增加。这表明 ,生长激素促进 骨重建过程中的骨形成 ,从而导致骨重建正平衡 ,

牙体牙髓牙周病学杂志 ( Chin J Conserv Dent) 2005, 15 ( 8 )

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[5]

[6] [7]

史俊南 ,主编.现代口腔内科学 [M ].北京 :高等教育出版社 ,

2000

骨量得以增加

[2]

GH对成骨细胞的细胞周期也有影响 ,它提高了细 胞的 S期百分比 ,表明成骨细胞的 DNA合成速度 增高 ,细胞增殖加速。

实验结果表明 ,在所用的实验条件下 , RHGH 在细胞水平上表现为促进细胞的增殖 ;在染色体 DNA水平上表现为对细胞周期的影响。但人体是 一个复杂环境 ,药物在体内作用形式与体外不同 , 所以 ,国产 RHGH应用于临床治疗仍需进行大量 相关的动物和细胞学实验研究。

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学、理、理科学与临床分册 , 2002, 22 ( 6) : 608 - 611 生病 银粉玻璃离子桩加自攻自断钉修

复前磨牙残根残冠的临床应用

周懋莘 ,邵新瑛 ,赵维琴

(市人民医院 ,新疆克拉玛依 834000 )

我科自 2002年以来 ,对 21例 23个前磨牙残根残冠进 行银粉玻璃离子桩加自攻自断钉固位 ,瓷冠修复治疗 ,跟踪 观察 1. 5～2年 ,现报道如下。

1 临床资料 1. 1 病例选择

21例 23个牙 ,均为前磨牙残根残冠。要求 : X线片显

自攻自断钉 (0. 5～0. 7 mm ,杭州西湖生物材料有限公 司 )。

1. 3 修复方法

将残根残冠的龋坏组织去除 ,磨去锐利边缘 ,根管扩 大、洗、药、填 , X线片示根充良好。观察 2周 ,无不 冲封充 良反应 ,用登士柏机用扩孔钻将管径从 0. 7 mm扩大至

1. 1 mm ,长度为根长的 2 /3。若是双根管常预备较粗大的

L indsay R. Hormone rep lacement therapy for p revention and treat2 根管。然后将自攻自断钉打入残根残冠空余的牙本质内 ,

取少许银粉型玻璃离子按 1∶2的比例调合好 ,将其加压充 入预备好的根管 ,然后采用分次调和堆积法完成根管口以 上的桩核充填。约 30 m in,银粉型玻璃离子结固后 ,按常规 桩核预备 ,完成瓷冠修复。

2 结果

B rixen K, N ielsen HK, Mosekilde L , et al. A short course of re2 combinant human growth hormone treatm ent stim ulates osteo2

共修复 23个牙 ,成功 19个牙 ,成功率为 82. 6% ;失败

4例 ,其中 2例根裂 ,导致瓷冠及银粉型玻璃离子桩核碎裂

示牙周组织健康 ,牙不松动、隐裂无 ,牙槽骨无吸收或吸收

<Ⅰ度 ,髓室底完整。 1. 2 材料

。流式细胞术的测定也表明 , RH2

脱落 , 2例因咬合关系紧 ,桩核高度不足 ,固位性差而致冠

of normal human osteoblasts: p roliferation and differentiation po2

松动脱落 ,给予重新黏结。

(收稿日期 : 2005 - 03 - 30)

银粉型玻璃离子黏固粉 (日本松风 )。

2 Bonello RS,Marcus R , B loch D , Strober S. Effects of growth hor

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/yt06.html