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第三章 核酸化学

核酸（nucleic acid）：由核苷酸组成的具有复杂三维结构的大分子化合物，在生物体内负责生命信息的储存和传递。

核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。

核酸不仅对于生命的延续、生物物种遗传特性的保持、生长发育、细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异也有密切相关。 第一节 核酸的种类与分布 T2噬菌体

第二节 核酸的化学组成 元素组成：

核酸含有C、H、O、N、P。

通常RNA平均含磷9.4%，而DNA含磷9.9% 。这样可从含磷量推算出核酸的含磷量。 两类核酸的基本化学组成

??RNA DNA ㏒???琰茞??ü ㏒???琰茞??ü 戊糖 碱基 核糖 脱氧核糖 ??组成 A G C A G C U T Pi(磷Pi(磷磷酸 酸二酯酸二键) 酯键) 一、 核糖 二、 碱基

嘧啶碱：尿嘧啶、胞嘧啶、胸腺嘧啶 嘌呤碱：腺嘌呤、鸟嘌呤、嘌呤衍生物 修饰碱基：100余种，多数是甲基化的产物 N9是成苷位置

N1是成苷位置

修饰碱基（稀有碱基）：多数为主要碱基的修饰产物或代谢产物，在体内含量甚少的碱基，tRNA中大约有10%的稀有碱基。 碱基的性质 几乎不溶于水；

互变异构：酮式（内酰胺）烯醇式（内酰亚胺）； 氨基式 亚氨基式

（在体内主要以酮式和氨基式为主）

紫外吸收：嘌呤碱基和嘧啶碱基分子中都含有共轭双键，在紫外区有强烈吸收（260 nm左右），该性质是定性或定量测定碱基和核苷酸、核酸的依据。 各种碱基的紫外吸收光谱（pH7.0） 三、核苷（nucleoside）

核苷：含氮碱基与戊糖缩合而成的糖苷。 核苷 ＝ 戊糖 + 碱基（C-N糖苷键）

连接方式：戊糖 C1’-OH→H-N9 嘌呤碱基 戊糖 C1'-OH→H-N1 嘧啶碱基

核苷的构象：DNA和RNA螺旋中的核苷主要为反式构象。 常见的核糖核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷。

常见的脱氧核苷：脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、脱氧胸苷。 核苷的性质

核苷的水溶性大于自由碱基； 核苷在碱性条件下稳定；

嘧啶核苷抗酸水解，嘌呤核苷易被酸水解。 三、核苷酸

核苷酸是核苷的磷酸酯 核苷酸 ＝ 核苷 + 磷酸 核苷中戊糖C2、C3、C5 羟基被磷酸酯化

构成DNA的核苷酸：5’－脱氧核苷酸 构成RNA的核苷酸：5’－核苷酸 核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸

环化核苷酸：环腺苷酸（cyclic AMP，cAMP）和环鸟苷酸（cyclic GMP，cGMP），作为细胞之间传递信息的信使。

核苷酸的构象：具有一定的柔性。 核苷酸的功能

作为核酸的单体，承载遗传信息；

细胞中化学能量的主要载体，运输化学能量； 许多酶辅因子的结构成分（如辅酶A，NAD＋等）；

一些核苷酸是调节分子（作为第二信使的cAMP和cGMP等）。 一、DNA的结构

一级结构：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。

二级结构：两条DNA多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。 三级结构：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。

第三节 核酸的结构 （一）DNA的一级结构

由dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’、5’-磷酸二酯键连接起来的线形或环形多聚体，以磷酸-糖-磷酸-糖?形成核酸骨架。 5′pTpCpAp-OH3′ 5′TCA3′

（二）DNA的二级结构

查格夫规则：1943年 Chargaff（查格夫）证明，DNA中4种碱基的比例并不是相等，总是A=T，G=C，并认为在DNA中是A-T配对、G-C配对的规律。

1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNA钠盐纤维的X光衍射分析结果提出了DNA的双螺旋结构模型。 双螺旋结构模型要点

两条脱氧多核苷酸链反向平行且均为右手螺旋； 两条核苷酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起；

两条链上的碱基间互补配对，且正确配对必定为A=T，G≡C； 糖-磷酸主链在螺旋外侧，碱基对平面在内侧且平面与螺旋轴垂直； 碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行；

螺旋每圈含10个碱基对，螺距为3.4nm，双螺旋平均直径2nm；

螺旋表面有一条大沟和一条小沟；大沟宽1.2nm ，深0.85nm；小沟宽0.6nm，深0.75nm。 螺圈之间主要靠碱基平面间的堆积力维持；

稳定双螺旋结构的因素

由芳香族碱基π电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心（碱基堆积力），是稳定DNA最重要的因素；

碱基配对的氢键，GC含量越多，越稳定；

磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和磷酸基上负电荷间的斥力，有助于DNA稳定；

碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。 DNA双螺旋结构模型的理论意义：解释特定生命现象。 DNA的复制； 遗传与变异； 生物的性状控制； 为现代分子生物学 与基因工程奠定了 理论基础。

其他类型的DNA二级结构

A-DNA：右手双螺旋，外形粗短；RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。 Z-DNA：左手螺旋，外形细长；天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。 A-DNA

钠盐纤维，相对湿度75%；

结构特征：右手双螺旋、螺旋直径2.6nm、螺距2.5nm，11个碱基对/周，其碱基平面倾斜20°；

A-DNA存在及意义：存在于脱水条件下的DNA双螺旋、生理条件下的RNA双螺旋和DNA-RNA杂合双螺旋中。推测在转录时DNA分子发生B→A的构象转变。

Z-DNA

存在于d(CGCGCGCG)结晶体结构中；

左手螺旋，螺旋直径1.8nm、螺距4.5nm，12碱基对/周，核酸链骨架呈Z字型走行； 螺旋表面只有小沟；

意义：与基因的调控有关；Z-DNA转换成B-DNA将产生使双螺旋链解开的张力，因而暴露出蛋白质结合位点（复制起始点以及调控转录的启动子和增强子顺序）。

对间 碱基转 bp/类型 直距 圈 垂直对 方径 nm 距离 倾角 向 nm nm 旋 螺A－DNA 右 20o 2.3 2.8 11 0.26 B－右 2.0 3.4 10 0.34 0o DNA 1.8 4.5 12 0.27 左 7o Z－DNA

不同类型DNA双螺旋比较

三股螺旋DNA (triple helix DNA, 又称H-DNA)

由三条脱氧核苷酸链按一定的规律绕成的螺旋状结构。 组成三股螺旋的

DNA单链，一般都 由单一的嘌呤碱基 （A和G）或单一的 嘧啶碱基（C和T）

旋螺碱基 所组成。

在Watson-Crick双螺旋基础上形成，大沟中容纳第三条链形成三股螺旋。 在三螺旋DNA中三个碱基配对形成三碱基体: T-A-T 与 C-G-C。 H-DNA存在于基因调控区和其他重要区域，具有重要意义。 (三） DNA的三级结构—超螺旋

DNA在双螺旋的基础上通过扭曲和折叠形成的构象； 超螺旋是DNA三级结构的主要形式。 原核生物DNA的高级结构

在共价闭环双螺旋基础上进一步扭转盘曲，形成超螺旋(supercoil)，体积进一步压缩。 负超螺旋 （右手扭曲） 正超螺旋 （左手扭曲）

真核生物DNA的高级结构：多层次压缩包装

压缩倍数 7 6 40 5 一级包装 二级包装 三级包装 四级包装 7×6×40×5 = 8400 压缩前 200bpDNA 6个核小体 压缩后 核小体10nm 30nm螺线管 75000bpDNA 150nm突环 6个突环 300nm玫瑰花结 30个玫瑰花结 700nm螺旋圈 10个螺线圈

Solenoid [5sEulinCid] n. [电]螺线管

1400nm染色体

核骨架

二、RNA的结构

RNA的一级结构：AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体。 RNA的U替代DNA中的T，RNA中常有一些稀有碱基；

天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。 RNA中核糖存在2'-OH，导致的磷酸二酯键对碱异常敏感 （一）tRNA的结构

70-90b，分子量在25kd左右， 沉降系数4S左右；

有较多稀有碱基（ψ、DHU） 3’末端为?CCA-OH；

5’末端大多为pG?或pC?； 二级结构：三叶草形； 三级结构：倒L形。 tRNA的倒L型三级结构 （二）mRNA的结构

原核：多顺反子（polycistronic mRNA) 真核：单顺反子，断裂基因（splited gene) 真核细胞mRNA的一般结构

5’端有甲基化的帽，3’端有polyA尾巴；

一般为单顺反子结构，即一个mRNA中只含有一条多肽链信息，能指导一条多太链的生物合成；

mRNA代谢很慢，代谢半衰期长。 原核mRNA的结构（多顺反子）

由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成，没有5’帽子和3’polyA；

SD序列：5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列； SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补。 小 ??转大亚基 录单位 5 23 ㏒???琰茞??ü 30 ??亚㏒???琰茞??ü 基 原核 16 5（单真核 18 独转28 录）

（三）rRNA的结构

细菌： 16S rRNA 、5S rRNA、23S rRNA组成30S转录单位。

真核：18SrRNA、 5.8S rRNA，28S rRNA组成45S的转录单位，5S rRNA单独转录。 16sRNA的结构 RNA的功能多样性

参与和控制蛋白质的生物合成； 作用于RNA的转录后加工与修饰； 参与基因表达与细胞功能的调节； 生物催化作用；

遗传信息的加工与进化。 第四节 核酸的理化性质 一、核酸的酸碱性质

碱基、核苷与核苷酸均能发生两性解离； DNA等电点4-4.5，RNA等电点 2-2.5。 二、核酸的紫外吸收

核酸在240－290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax= 260nm 鉴定纯度：

纯DNA：A260/A280 = 1.8（1.65-1.85） 纯RNA：A260/A280 = 2.0

若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280明显降低。 含量计算

OD260 = 1相当于：50ug/mL双螺旋DNA

40ug/mL单链DNA（或RNA） 20ug/mL寡核苷酸 判断DNA是否变性

在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）；在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）。 三、核酸的变性、复性及杂交 （一）变性

核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。

DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。

变性因素：热变性、酸碱变性（pH小于4或大于11）和变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）。 变性后的理化性质：260nm吸收值升高（增色效应）；粘度降低，浮力密度升高；二级结构改变，部分失活。

5.8 5 + 45 熔解温度（Tm）：

DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在82－95℃之间。 影响DNA的Tm值的因素

DNA均一性：均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性； G-C含量与Tm值成正比：测定Tm，可推知G-C含量； G-C% =（Tm-69.3）×2.44

介质中离子强度：离子强度高，Tm高。 (二)复性

复性：变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，其物理性质和生物活性随之恢复。

退火：对于热变性的DNA，在缓慢冷却的条件下可重新结合恢复双螺旋结构。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 (三) 分子杂交

在变性的DNA溶液中加入外源DNA单链分子或RNA单链分子（与原DNA具有同源性），去掉变性条件后复性形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 探针：用于杂交的异源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，经特定标记的一条链。 分子杂交的种类

Southern Blot：DNA-DNA杂交 Northern Blot：DNA-RNA杂交 Western Blot：抗原-抗体进行杂交 原位杂交：活体组织上进行杂交 Southern Blotting

Southern印迹，1975年英国E. M. Southern首创；

DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 →固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影；

变性（NaOH 0.5mol/L），转膜（NC膜，尼龙膜），固定（80℃，4-6h），杂交（高盐浓度，68℃，几小时）；

Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。

Northern印迹杂交 与Southern杂交类似。将RNA分子从电泳凝胶转移到印迹膜进行核酸杂交的一种实验方法； 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（甲醛）；

检测目的RNA的存在与否及含量，用于RNA的定性定量分析。 Western印迹杂交

将待检测蛋白质（或酶）经聚丙烯凝胶电泳（PAGE）电泳后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。 用于蛋白质定性

定量及相互作用研究。 原位杂交

用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法。 一、核酸的分离纯化和定量

尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。

抑制核酸酶。

第五节 核酸的分离、纯化和表征 （一）DNA分离纯化

真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。

DNP可用水饱和的酚抽提去除蛋白质，还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3mol/L NaAC-70%乙醇沉淀。 （二）RNA的制备 核蛋白的提取：将细胞破碎制成匀浆，再用0.14mol/L NaCl溶液将细胞质的核糖核蛋白体抽提出来，留下含DNA的细胞核组织，核糖核蛋白可在pH4.5溶液中沉淀析出。 核酸和蛋白质的分离：含水的苯酚能沉淀蛋白质，核酸和多糖则溶于水层。 在特定盐浓度下，水层中的RNA可被异丙醇选择性沉淀得RNA。 （三）核酸的定量

紫外分光光度法、定磷法、定糖法 紫外分光光度法：利用核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性，在260nm下，每1μg/ml DNA的消光值为0.020，每1ug/ml RNA的消光值为 0.022，由未知溶液的消光值可计算出其中的核酸含量。

定磷法：将核酸用浓硫酸或过氯酸消化，使核酸磷转化成为无机磷酸。磷酸能与钼酸铵反应生成磷钼酸铵，它在还原剂存在下，可被还原生成钼蓝，可测定无机磷酸的含量。通常RNA平均含磷9.4%，而DNA含磷9.9% ，这样可从含磷量推算出核酸的含量。 定糖法

RNA与浓硫酸共热会降解，生成的核糖进而转化为糖糠，它与地衣酚在CuCl2或FeCl3催化下反应生成鲜绿色物质，在670nm处呈现最大光吸收。

DNA经加热酸解后，水解所得的脱氧核糖转变为ω-羟-γ-酮戊醛，再与二苯胺生成蓝色物质，在595nm处呈现最大光吸收。

RNA和DNA在20-200μg/ml浓度时，光密度与核酸的浓度呈正比。 二、核酸的沉降特性与超速离心

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。 应用

研究核酸的构象：RNA＞DNA，变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大。

纯化RNA或不同构象的DNA。 三、核酸的凝胶电泳

琼脂糖电泳：琼脂糖作为支持介质的凝胶电泳，用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。

PAGE电泳：用于小片段DNA的分析，精度非常高 影响迁移率的因素：

核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比； 凝胶浓度；

DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢； 电压不大于5V/cm。

四、限制性核酸内切酶与DNA物理图谱构建

限制性内切酶（ Restriction Endonuclease，RE）：是一类能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。

限制修饰系统：限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。 核酸内切酶有I、II、III三种类型。 II型限制性核酸内切酶的特点：

限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分； 辅助因子镁离子；

位点序列旋为转对称（反向重复）。

1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： 限制性内切酶的命名

属名 种名 株名

Escherichia coli R 大肠杆菌 EcoRI，EcoRV

同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 限制酶切图谱

同一DNA分子用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶酶的切割位点图。 五、DNA序列分析

DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP。 DNA的化学合成

DNA固相合成（亚磷酸三酯法）； 合成方向：端；

5’-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护，碱基上氨基用苯甲酸保护； 3’-OH用氨基磷酸化合物活化 六、DNA合成 DMT：二甲氧基 三苯甲基

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：在体外特异性地扩增某段核酸序列。 技术原理 反应体系

模板：DNA或RNA

引物：sense 和 antisense Taq酶：耐热DNA聚合酶 dNTP Mixture 底物

PCR buffer： 10mmol/L Tris-HCl pH8.4(20℃) 50mmol/L KCl、Mg2+ 0.1mg/mL乙酰BSA

特异性强：PCR使用专门合成的DNA引物，延伸过程是在高温下进行； 敏感性高: 理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！ 快速: 整个PCR过程约3小时即可完成。 PCR的特点

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