百合的组织培养技术综述

组培经典3

78湖北农业科学　HUBEI　AGRICULTURAL　SCIENCES　No11,2004

文章编号:0439-8114(2004)01-0078-05

百合的组织培养技术综述

蒋细旺1,司怀军2

(11江汉大学医学与生命科学学院,湖北武汉　430056;21甘肃农业大学农学院,甘肃兰州　730070)

摘要:对20世纪90年代以后的百合组织培养技术进行了综述,包括百合外植体的准备、百合的快速繁殖技术等。还对百合种质资源离体保存和百合的组织培养技术在百合育种中的应用作了论述。关键词:百合;组织培养;育种

中图分类号:S68211;Q94311;Q81311+2　　　　文献标识码:A

百合(Lilium.spp)是全世界著名的观赏花卉之

一。中国是世界百合种质资源的分布中心,约有47个种、18个变种,占世界百合属总数的一半以上。其中36个种、15个变种是我国特有的珍稀种类[1]。百合除具有观赏价值外,大多数可以食用、药用,是上等的滋补佳品。但由于人类、非人类的影响,使一些分布地区窄或生态适应性弱的百合种的生存受到严重威胁球、分珠芽鳞片扦插、繁殖,,常造成种性退化,,量。,能够迅速去除病毒和更新品种,加快了百合的快速繁殖速度,缩短了百合的生育周期。在百合杂交育种中也存在着基因库贫乏、种间杂交不亲和等局限性,而组织培养中的胚培养、花药培养等技术则可克服这些弊端。自1957年Robb[2]首次发表了百合的组织培养文章后,到现在

百合诱导分化的能力依次为种子>鳞片>花丝>花瓣>叶片。112　外植体灭菌

常用的药剂有乙醇、升汞次氯酸钠及漂白粉等。,使用浓度75～60s。升汞的1灭菌时间为10min左2010g L-1的次氯酸钠溶液浸泡min,灭菌时要不断摇动[9,10];漂白粉的使用浓度为饱和溶液,灭菌时间为10～20min[11,12]。材料灭菌后再用无菌水冲洗5次左右。另外也有将2种灭菌剂同时使用的,如先用1%次氯酸钠溶液浸泡6min,取出后放入011%升汞溶液中浸泡8min,无菌水冲洗6～7次[13]。

2　百合良种的快速繁殖

211　百合快速繁殖的途径与特点

成功的百合组织培养方法已有40多种[3]。本文将

20世纪90年代以来百合的组织培养研究现状并结合我们的一些经验进行综述。

1　外植体的准备

111　外植体的选择

利用植物组织培养技术进行百合快速繁殖时,

常通过5种途径诱导分化产生小植株。第一是器官型,即通过腋芽发育和不定芽的产生、形成丛生芽块的过程[14～16]。第二是器官发生型,即外植体脱分化形成愈伤组织再分化出器官的方式[4,17,18]。第三是胚状体发生型,即外植体按胚胎发生方式形成胚状体或先形成愈伤组织、再经愈伤组织形成胚状体再生植株的过程[16,19]。第四是鳞茎型,即鳞片近轴面或在边缘直接形成带根的小鳞茎[20,21]。第五是孢子型,即用成熟或未成熟的孢子进行培养。它包括花药培养和花粉培养[22～24](表1)。212　百合无病毒苗的培养

百合主要靠小鳞茎进行分株繁殖,但长期的营养繁殖,使得病毒积累日趋严重,造成百合生长发育不良和品种退化。已报道的14种百合病毒病中,LSV(百合潜隐病毒,Lilysymtomlessvirus)、LMV

百合的许多器官、组织都可作为外植体,如鳞

片、根尖、叶片、子房、种子、花梗、花瓣、珠芽、花柱、花丝、花药、胚、腋芽、芽尖等。用百合鳞片作外植体比较多,但不同部位的鳞片对分化有差异,王刚等[4]认为兰州百合鳞片产生芽的能力从强到弱依次为外层、中层、内层。外植体在培养基上的不同放置方式对百合鳞片的诱导也有影响,其诱导出芽能力的从强到弱依次为:鳞片内侧向上平放>鳞片竖直插入>鳞片内侧向下平放[5]。不同外植体诱导分化的能力也不同,罗凤霞等[6]研究认为,新铁炮

收稿日期:2003-11-12

作者简介:蒋细旺(1964～),男,湖北黄陂人,博士,副教授1

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表1　组织培养成功的百合的种类

种类

东方百合(Liliumacapulco)布朗(野)百合(L.brownii)

龙牙(万载)百合(L.browniivar,viridulum)毛百合(L.dauricum)

紫红花滇百合(L.bakerianumvar.rubrumstearn)药(鹿子)百合(L.speciosum)湖北百合(L.henryi)卓巴百合(L.wardii)

卷丹(宜兴百合)(ncifolium)渥丹(L.concolor)

细叶百合(山丹)(L.pumilum)大卫(川)百合(L.davidii)兰州百合(L.davidiivar.unicolor)假百合(Notholirionhyacinthinum)麝香(铁炮)百合(L.longiflorum)新铁炮百合(L.×formolongo)硫花百合(L.sulphurenum)通江百合(L.sargentiae)金百合(L.trompeten)卡萨布蓝加百合(L.casblenca)

外植体类型

鳞片、花葶、鳞茎根鳞片、叶片、幼胚鳞片:顶芽、茎段、叶片杂交胚鳞片鳞片鳞片鳞片

茎尖、珠芽、花药幼叶鳞片鳞片鳞片、叶鳞片

小鳞茎;叶片;花药;花丝;

茎尖;茎节;花柱;花梗种子;鳞片和叶片;花丝、珠芽鳞片

芽丛芽丛芽丛、体细胞胚芽丛和愈伤组织芽丛和小鳞茎愈伤组织愈伤组织芽丛或小鳞茎芽丛、小鳞茎、愈伤组织愈伤组织

小鳞茎;芽丛;芽丛小鳞茎芽丛芽丛、愈伤组织

由愈伤组织成小鳞茎:芽丛

继代繁殖材料

文献

[25～27][4,28][11,21][15][29][2][19][30][14][31][32][33]

79

[4,17,33,34][35][9,10,24,

36～39][6,8,13,40][12][41][18]

[42]

()、CMV(黄瓜花叶

结鳞茎率和鳞茎直径、再生幼苗的株高和生根率呈降低趋势,且芽基部愈伤组织退化严重,其中结鳞茎率和生根率以不加6-BA的为最高[12,20,27,34,40]。常用的6-BA浓度为014～210mg L-1。

适量的NAA对成苗有一定促进作用,常用浓度为011～015mg L-1[12,16,20,27,34,40]。王刚等[4]报道,对于兰州百合,BA浓度在017～110mg L-1之间,NAA浓度相对应地在0107和0120mg L-1时有较好的芽诱导率,即BA∶NAA介于5∶1到10∶1之间时芽诱导率较高,为75%～100%;对于野百合,BA浓度在014～016mg L-1,NAA浓度相应地在011～015mg L-1有较高的芽诱导率。

据李景原等[32]报道,高浓度的2,4-D对山丹有毒害性,使山丹的鳞片外植体受毒害死亡;低浓度的2,4-D虽能诱导山丹鳞片形成愈伤组织,但愈伤组织质地疏松呈水浸状,继代培养不能产生鳞茎,这个结果与于晓英等[28]和刘选明等[16]的一致。但

龙牙百合体胚发生与2,4-D浓度(410mg L-1)及2,4-D的培养时间(5d)密切相关[16]。

病毒,Cucumbervirus-lilystrain)是常见的病毒病原[43]。一旦百合感染上这些病毒,则株矮花小,在叶片上出现黄白斑甚至坏死,严重影响百合的观赏价值和经济价值。

百合脱毒研究最早是Philli(1962年),他利用

百合茎尖培养脱毒成功。浅野等人(1978年)利用麝香百合的花丝进行组培,也得到了无病毒的小鳞茎,赵祥云等[12]将带有烟草斑病毒(TRSV)的淡黄花百合(L.sulphureum)珠芽生长点进行脱毒,他认为用013～018mm长的珠芽外植体诱导成愈伤组织的最适培养基为MS,附加6-BA015mg L-1+2,4-D0125mg L-1诱导率为9218%;适合幼芽分

化的培养基为MS,附加6-BA115mg L-1+NAA011mg L-1+KT011mg L-1,分化率为7114%。

席梦利等[14]以宜兴百合为试材,对3种脱毒方法(茎尖培养、热处理结合茎尖培养、花药培养)进行研究。结果表明,珠芽经(50±1)℃热水处理40min,培养30d后,切取018～110mm茎尖培养的脱毒效果最好,脱毒率达100%。(38±1)℃热空气处理后切取茎尖培养也能提高脱毒效果。213　激素对百合组织培养的影响

东方百合在KT和NAA浓度均为0105～0150mg L-1,即KT和NAA适宜搭配时,其芽、根的诱

激素种类和激素浓度显著影响百合属植物组织培养的成败。随着6-BA浓度加大,新芽诱导率、成苗率、繁殖系数、每个外植体上再生芽的平均数、

导率较高,且均健壮;当KT浓度过高时(2100mg

L-1),苗生长缓慢,叶柄粗短,出现变态现象,同时高浓度的KT对根的诱导有明显的抑制作用[27]。

研究表明TDZ(ThidiazuronN-苯基-N’-

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果最佳。叶基部易分化成苗,结鳞茎率较高,鳞茎

直径较大;叶片中部较难成苗,结鳞茎率低,鳞茎直径较小;而叶尖则不分化结鳞茎[20]。GA3为210mg L-1时对龙牙(万载)百合的诱导率和分化鳞叶

1,2,3-噻二唑-5-脲)为2μg L-1时,即可诱导

渥丹愈伤组织完成器官发生(频率达4716%),这表

明TDZ等也可在单子叶植物中表现出很高的细胞分裂素活性[31]。

IAA对诱导鳞片形成愈伤组织有促进作用,而它对不定芽分化有强烈的抑制作用[16]。

因此,对于不同基因型的百合,激素的浓度和搭配比例与芽的诱导和增殖有密切关系,所以,在选择出最佳的外植体后,激素的浓度和配比是百合组织培养中的关键因素。214　培养基类型对百合组织培养的影响

一般用于百合组织培养的培养基类型为MS培养基。其利于山丹形成愈伤组织并形成再生鳞茎和成根;而LS培养基则只有少量水浸状愈伤组织形成,且质地松、生长慢[32]。罗凤霞等[6]认为,MS培养基优于SH培养基。杨柏云等[44]用3种培养基,即MS、改良MS(将MS中的NH4NO3去掉,KNO3加倍)、B5,以鳞片研究切花百合(L.browniiviridulum)的液体振荡增殖培养,上的平均小鳞茎数有促进作用[7]。罗丽萍等[7]认

为,液体振荡培养对次级小鳞茎的增殖效果明显优于固体培养。是否低温处理对鳞片分化小鳞茎也有影响,王家福等[45]将百合鳞片接种后,先经过低温

),再在(25±处理2周(温度为4℃1)℃常温条件下

培养,结果发现经低温处理的百合鳞片分化率提高5010%。216　继代次数对分化能力的影响

在龙牙百合再生获得的小鳞茎上切取小鳞片转到MS+011mg L-1KT+0115mg L-1NAA的继代培养基上进行继代培养,d转移1次,每次2～3次时,,,代到第6次时,分化率为]杜捷等也发现兰州百合愈伤组织在继代5次后无分化能力[17]。217　再生植株的染色体数量变异百合属植物离体条件下会发生体细胞变异。周朝鸿等[46]利用硫花百合、通江百合、百合等的植株上部叶腋间的珠芽为外植体,经愈伤组织形成再生植株,通过观察再生植株体细胞发现均不同程度地出现了染色体数量的变异。它们正常体细胞染色体数均为2n=2x=24。变异包括倍性变异和非倍性变异。倍性变异发现于硫花百合和百合细胞中,前者的变异类型为3倍体和4倍体,后者的变异类型为3倍体。非倍性变异在3个种中都出现,且变异范围一致,即2n=22(2x-2)、23(2x-1)、25(2x+1)、26(2x+2)。杜捷等[17]也对兰州百合组培过程中的染色体行为进行了研究,发现随着其继代次数的增加,愈伤组织细胞染色体数目变异随之增加。产生变异的原因是组培中物理和化学(激素、培养基成分)因素影响调控细胞分裂的基因表达的结果[17,46]。虽然这种变异是组培中出现的正常现象,但将导致百合新基因型的植株出现,给百合属植物的进化和细胞育种带来较大影响。218　组织培养苗的生根和移栽

一般的生根培养堪用1/2MS培养基,并附加015～110mg L-1的NAA,或附加0125mg L-1的IBA[12],或附加110mg L-1的IAA[16]。据袁芳

MS,NH4+态氮改变为NO3响不大。卢其能等[11]以龙牙百合的鳞片切块,通过

比较MS、B5、White3种培养基分化出小鳞茎或芽的效果发现,分化最好的是MS培养基,其次是B5,最差的为White。Arzate等[9]用MS、N6、B5、1/4MS、White、White+鳞茎提取液共6种培养基研

究麝香百合带花药的花丝外植体的诱导和再生,发现N6培养基结合光培养或暗培养和B5培养基结合暗培养的效果很好。215　影响鳞茎诱导的因素在百合组织培养中,通过诱导小鳞茎的形成是实现再生和快繁的重要途径。不同部位的百合鳞片分化小鳞茎的能力不一,一般认为其分化能力大小依次为下部>中部>上部[2,4,7,27,40,45]。金英善等[42]认为,卡萨布蓝加百合外部鳞片很少形成小鳞茎,内部鳞片上形成小鳞茎较多;外部鳞片的顶部和中部不产生小鳞茎,基部可以产生一些小鳞茎;内部鳞片的中部和基部可形成50%以上的小鳞茎。不同季节鳞片与百合小鳞茎的形成有关,王家福等[45]认为,各季节分化能力高低的顺序为:春季>秋季>夏季>冬季。蔗糖浓度对百合鳞茎形成影响明显,蔗糖浓度为3%时,没有小鳞茎形成,蔗糖浓度为10%时,结鳞茎率最高[45];多效唑对百合根、叶生长有抑制作用,浓度越高抑制越明显,浓度为10mg L-1对鳞茎的形成起促进作用,其结鳞茎率最高,效

亭[38]研究麝香百合时发现,在生根培养基中再添加1010mg L-1的多效唑有促进生根和壮苗的作用;同时他们认为当试管苗根长1cm时移栽至珍珠岩

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基质中易成活。罗凤霞等[6]认为,以不附加任何激

素的MS培养基为新铁炮百合的最佳生根培养基,移栽基质以细河沙∶草炭(2∶1)为最好。为了提高龙牙百合的成活率,卢其能等[11]将直径5mm以上的生根小鳞茎进行冷处理,温度为6～8℃,处理时间以25d左右为宜。王刚等[4]、丁兰等[40]认为添加011%活性炭有利于兰州百合及野百合、新铁炮百合生根。

81

为粉红色、株矮,可供盆栽,花粉不育。后者杂种F1花色淡粉红,诱导成多倍体后花粉可育。412　花药培养与单倍体育种

在百合的花药培养方面,最早获得成功的是Sharp等[22],他们用麝香百合的花药培养获得了单

倍体植株,在N6培养基上,冷处理过的麝香百合早、中期单核小孢子经过暗培养均产生了愈伤组织,其中单倍体和二倍体细胞均有。在亚洲百合杂种系‘ConnecticutKing’的花粉培养中,1716%的中、晚期单核小孢子也产生了愈伤组织,根尖染色体鉴定表明有5/11为单倍体植株。为了得到纯粹的配子体起源的愈伤组织,CPRO-DLO离体培养亚洲百合杂种系品种‘Whilito’的花粉粒,诱导出了多核小孢子的雄核发育[51]存在着基因型差异,4个亚洲百合1、1个东方百[24]。

,百合的组织培养技术已较成,、遗传转化中广泛使用[52,53]。目前我们正在开展百合的转基因研究,将抗干旱、抗盐碱基因导入百合,旨在获得抗干旱、抗盐碱的转基因百合。

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3　百合种质资源离体保存

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法。中国农业科学院作物品种资源所将诱导出的115～210cm高的组培苗转入16～18℃、光照1000lx、8h的低温种质库冷冻保存,结果表明附加2%甘露醇的MS培养基离体保存百合种质效果最好,一年后的存活率高达9219%[47]。CPRO-DLO(荷兰农科院植物育种繁殖研究中心)将百合活体在-2℃条件下贮存了3年,仍未丧失活力[48]。

4　411　,由于百合不同种之间的杂交为远缘杂交,常有杂种胚发育不良或中途败育现象,为防止杂交胚与母体胚乳间的不亲和性,克服受精后的障碍,可以利用百合幼胚进行离体培养。在百合幼胚离体培养中,6-BA对胚真叶的分化有抑制作用[15]。王亚斌等[49]利用百合品种间杂交获得的胚龄为30～50d的种胚进行组织培养研究发现,pH值对百合幼胚的萌发及成苗有一定的影响,以pH值510为最好;培养基中加入氨基酸的幼胚萌发率及苗生长情况均比对照好,排列顺序为:谷氨酰胺>肌醇>谷氨酸>水解酪蛋白>水解乳蛋白>对照,其中加入肌醇的培养基萌发率为93175%,加入谷氨酰胺的培养基苗分生好,苗生长状况最好。加入维生素类物质和加入活性炭对胚的影响不大。授粉后35d胚龄的铁炮百合幼胚,当培养基中蔗糖含量为6%～8%时,最有利于它的胚性生长;在其愈伤组织的诱导中,2,4-D、NAA、BA都可以诱导愈伤组织的产生,但以011mg L-1NAA和110的BA单独或混合使用,诱导的愈伤组织分化不定芽的频率较高[28]。

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Summaryontechnologyoflilytissueculture

JIANGXi-wang1,SIHuai-jun2,

(11CollegeofMedicineandLifeScience,JianghanUniversity,Wuhan430056,China;21Collegeofagronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730076,China)

Abstract:Theauthorsummarizedadvancesofresearchontissueculturetechnologyoflilyinrecentyears,includedtoprepareex2plants,rapidpropagationtechnology,etc.Discoursedalsoupontopreservegermplasmresourceinvitrooflilyandapplytissueculturetechnologytobreedingoflily.

Keywords:lily;tissueculture;breeding

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