综述

动物源食品中β-内酰胺类抗生素残留分析方法研究进展

谢会玲 胥传来

摘要：全面系统的总结了牛奶中β-内酰胺类抗生素的检测方法，包括微生物法、理化检测法、免疫分析方法及其他SPR生物传感器、微阵列芯片等技术。

关键词：牛奶；β-内酰胺类抗生素；残留检测

Detection ofβ- lactam antibiotic in milk

Huiling xie Chuanlai xu

Abstract: Outline the detection of residues of β- lactam antibiotic in milk comprehensively and systemly,including microbial assays、Chromatography assays、immunoassays and Surface plasmon resonance Biosensor assay、microarray system etc.

Keywords:milk; β- lactam antibiotic; the detection of residues 引言

生活水平提高的重要标志之一是乳制品的消费水平。随着乳制品消费量的增加，乳中抗生素残留问题逐步引起国际社会的关注，β-内酰胺类抗生素在牛乳及动物组织中残留检出报道最多，其中青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、苯唑青霉素、头孢氨苄、头孢吡啉等抗生素，由于廉价广谱的抗菌性而被广泛、频繁、超剂量使用于医治奶牛乳腺炎。国内对乳品中β-内酰胺类抗生素残留问题非常关注。

β-内酰胺类抗生素是指化学结构中含有β-内酰胺环的一类抗生素, 主要包括青霉素类和头孢菌素类, 其作用特点是能够抑制细菌黏肽转肽酶的活性,从而阻止细菌细胞壁的合成, 呈现杀菌活性。在动物生产中, β-内酰胺类抗生素广泛用于控制奶牛的乳房炎, 治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因, 均可造成它在畜产品中的残留, 给人类健康带来严重危害, 如产生过敏反应、破坏胃

肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。其中青霉素在食品中的残留会对青霉素过敏的人产生健康危害,更为重要的是,抗生素被过量食入健康人肠道,会破坏健康人的正常菌群环境,导致人体免疫力的降低。

为了保障人民食品安全,适应WTO的要求,增强国内牛奶及乳制品业的国际竞争力,必须将牛乳中抗生素残留的检测纳入常规检测中去。2001年和2002年,农业部又先后公布了《无公害食品生鲜牛乳》(NY/T5045 - 2001) 、《无公害食品灭菌乳》(NY5141 - 2002)和《无公害食品巴氏杀菌乳》(NY5140 - 2002)等行业标准,规定了“抗生素不得检出”,检验方法采用GB /T5049 - 85《牛乳的检验方法》中的TTC (氯化三苯四氮唑)法,但此法的检测限仅为0. 04 u /mL,和欧美国家检测方法差一个数量级。因此开发原料乳质量现场快速测定技术，建立常用抗生素、农药残留、霉菌毒素的现场快速检测方法及相应的技术标准是非常必要的。

近年来，牛奶中β-内酰胺类抗生素的残留检测备受关注，为满足检测需要现已建立了许多残留检测方法，主要有：微生物检测法、理化检测法、免疫分析法及其他一些结合免疫分析法的检测方法，如SPR生物传感器技术、微阵列芯片技术、胶体金、毛细管电泳、免疫亲和色谱等。 一． 微生物法

微生物法是应用较广泛的方法，主要有微生物拭子检测法（STOP） 和磺胺实验法(CAST),快速抗生素筛选实验法(FAST),德国三碟法、欧盟四碟法以及活体拭子检测法（LAST） 等(Boison等，1995;Okerman等，1998 ；Korsrud等，1998)。我国和日本采用国标TTC法，这些方法的主要优点是价廉,易操作和适合于大量样品的筛选,主要的缺点是不能对具体药物残留进行鉴别欧洲国家常采用。AOAC纸片法，荷兰Delvotest系列试剂盒在很多国家也广泛应用。 许多发达国家都有一套用细菌抑菌实验快速检测在可食性动物

组织和食品中微生物药物残留的方法。藤黄微球菌法( Sarcina lutea test)是美国FDA官方采用的用于检测牛奶和奶制品中青霉素残留的检测方法。此法的灵敏度可达到0. 006 μg/mL 青霉素G,可使用青霉素酶对阳性结果进行确认。Jaglan等(1992)报道了查氏嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法(BsDA),该法不仅用于检测β-内酰胺类抗生素,并能暗示还存在其它抑菌物质,检测限可达0.008IU/ Ml(8μg/kg)以下。CHARM I是专用于牛奶中β-内酰胺抗生素残留检测方法,也是美国AOAC承认的第一个快速测定法,这个方法非常快速和灵敏, 一个奶牛样品分析只需15 min时间,可以使奶牛场的生鲜牛奶在没有进入牛奶加工厂前就能对β-内酰胺类抗生素残留进行检。charmⅡ7600/6600是现有的快速放射性检疫检测技术中最为成功的例子。该检测系统就是利用细菌的专一性受体来识别、结合同一类抗生素族中的母环为工作原理而建立起来的、较为快捷的生物放射检测技术，能同时检测同一抗生素族在样品中的残留情况。charmⅡ7600/6600筛选水平青霉素为3.5μg/kg[5]。 二． 理化检测法：

理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如气相色谱法、高效液相色谱法、比色法、荧光分光光度法等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高。 药物残留检测最为常用的理化检测方法是高效液相色谱法和联用技术。常规HPLC 往往仅适宜于测定比较纯的产物,对于具有复杂组分的生物培养基中的抗生素,特别是痕量的抗生素,往往由于高背景干扰而难于定量分析。 E.Verdon , P. Couedor曾报道用柱前衍生- 离子对高效液相色谱法测定牛奶中的异恶唑青霉素残留,但前处理步骤过于复杂,操作难于控制,其准确性和选择性较差。D. MHolstege等采用LC - MS 测定了牛奶中5 种β-内酰胺类抗生素残留。Sonja Riediker 和Yuko Ito 也用LC - MSPMS 测定牛奶中的青霉素含量,准确性较好,但灵敏度不高。

刘媛等（2003）建立了反相高效液相色谱分析鸡肉、猪肉、猪皮、猪脂肪等动物组织

样品中阿莫西林残留量的方法。对8种动物组织样品采用磷酸盐缓冲溶液提取、三氯乙酸沉淀蛋白、固相萃取净化和富集、1，2，4-三唑-氯化汞衍生化。研究了样品在C18柱上的保留行为和阿莫西林的衍生化条件。衍生物采用高效液相色谱法分离，外标法定量分析，标准曲线的线性相关系数为0.9997，线性范围为8.6-860μg/L。动物组织样品中阿莫西林的加标回收率为70.9%-86.8%，相对标准偏差为3.2%-16.4%，最低检出限低于10μg/kg。该分析方法具有良好的重现性，批内、批间定量结果的相对标准偏差均小于10%〔2〕。

Lambertk等（2000）报道了HPLC 用于牛奶中头孢噻呋的残留检测,牛奶通过离心脱脂、乙腈提取、药物固相柱对提取物进行净化、 化合物通过离子对梯度HPLC 色谱柱分离，在270nm处进行紫外检测、对头孢噻呋的检测限是7.0μg/kg。在 20～200μg/kg的浓度范围对头孢噻呋的回收率是84%～88%〔17〕。Fabre H,Heller D N等(1998)将电化学检测器用于检测头孢菌素,由于其固有的高灵敏度,荧光检测法在多数的LC分析中要优于紫外检测法。 用其测定头孢噻呋的残留量，不仅提高了方法的选择性，而且灵敏度可1μg/L。Bruno F(2001)报道用液质联用(8)的方法可明确定性定量的检测牛奶中10种广泛应用的抗生素,具体过程是样品通过提取、溶解、去除溶剂、过滤和透析，经脱色处理后注入液相色谱-质谱（LC-MS）装置，该装置带一个电喷雾（ESP）离子源和一个单四级杆。 在液相运行过程中，电喷雾/质谱(ES/MS)系统首先检测正离子点,其次是负离子点,这用于检测在质子加合离子过程中由于周围基质干扰而导致的显著的信号差异。质谱数据的获得是通过三离子选择数据采集模式完成的，在5ng/mL的水平上，对头孢噻呋的回收率是11% 。检测限低于美国和欧盟目前规定的限量。 三． 免疫分析法

目前用于药物残留分析的免疫分析（IAS）方法主要分为两大类: 一是相对独立的分析方法,即免疫测定法（IAS）,如RIA、ELISA、固相免疫传感器（solid phase immunosensor）

等；二是将免疫技术与常规理化分析技术联用,如利用免疫分析的高选择性作为理化测定中的净化手段,典型的方式为免疫亲和色谱(IAC)、胶体金免疫分析法、毛细管电泳免疫分 析法。另外还有人用将免疫分析法与微滤孔芯片、SPR生物传感器技术联合用于残留检测。

有关ELISA 法检测β-内酰胺类抗生素残留的研究报道较多, 其中又以间接竞争EL ISA 法为主。U sleber 等(1994) 使用直接竞争ELISA 方法检测牛奶中邻氯青霉素和双氯青霉素残留, 最小检测限分别为10 和30 ng/m l。St rasser 等(2003) 〔12〕 采用戊二醛法，通过氨苄青霉素的氨基与牛血清白蛋白偶联，免疫兔子制备出具有较高簇特异性的多克隆抗体，并采用直接竞争ELISA 法检测牛奶中青霉素类抗生素残留, 检测范围为2～ 32 ng/m l。Sam sonova 等(2005) 用间接竞争ELISA 检测牛奶中氨苄青霉素残留, 最小检测限为5.0 ng/m l。Cliquet 〔11〕等(2001)利用青霉素化反应合成完全抗原，免疫小鼠，筛选出3株单克隆抗体，采用间接竞争EL ISA 法可同时检测到氨苄青霉素、青霉素G、羟氨青霉素、苯唑青霉素、双氯青霉素, 检测灵敏度都在欧盟最大残留量(MRL ) 限度内。Sh

〔13〕irazid 等(1991) 使用同样的方法检测牛奶和畜产品中β-内酰胺类抗生素残留, 最低

检测限度为2. 5～ 5 ng /m l。Ro se 等(1996) 用筛选出的2 株抗头孢噻呋单抗建立了检测头孢噻呋的间接竞争EL ISA 方法,两个克隆株的检测限分别是32μg/kg和0.3μg/kg〔9〕。陆彦等〔1〕(2005) 通过碳化二亚胺(EDC) 法将氨苄青霉素上的- COOH 与血蓝蛋白(KLH ) 偶联, 突出其侧链, 免疫小鼠后制备抗氨苄青霉素单克隆抗体,以间接竞争ELISA法为原理, 检测牛奶中氨苄青霉素, 检测灵敏度为0. 4 ng/m l。张建群等〔3〕（2006）采用戊二醛法和物理方法，合成免疫原和包被原，并对ELISA方法进行了优化，其检测极限为4.17 ng/m l。另外，吴建祥等〔4〕（2006）用与细胞色素C 交联的氨苄青霉素(Amp-Cy) 免疫的BALB/c 鼠脾细胞与SP2/0 鼠骨髓瘤细胞融合, 经筛选、克隆, 获得3 株能稳定传代并

分泌抗青霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞(1C1, 2C11K 和2G7) , 间接竞争酶联免疫吸附试验(C I-EL ISA ) 显示, 3 株单克隆抗体对青霉素类和先锋霉素类抗生素有特异性反应, 而对链霉素、卡那霉素、氯霉素、土霉素、四环素、新霉素其他抗生素没有交叉反应, 可用于青霉素类抗生素残留的检测。何丹(2004)、李青(2002) 和韩剑众等( 2000) 用同样的方法检测畜产品中氨苄青霉素残留, 检测灵敏度或检测范围分别4. 17 ng/m l、0. 02～0. 1μg/m l、6. 0～ 150 ng/m l。

Okerm an 等(2003) 〔7〕 也曾用固相荧光免疫法测定奶及牛和猪肾组织中头孢噻呋残留。头孢噻呋可以被定性的检测1000μg/kg，此水平相当于或低于肾组织中头孢噻呋的最大残留限量（MRLs）.还有人建立了一种flow-through免疫体系〔6〕,是适用于牛奶中头孢菌素残留检测的自动完整的体系，此方法的检测限可达1μg/L。低于欧盟规定的牛奶中头孢菌素100μg/kg的限量。

将免疫技术与常规理化分析技术联用的有Richard等〔10〕（1998）采用戊二醛方法将氨苄青霉素与匙孔戚血蓝蛋白（KLH）偶联,筛选出两株单克隆抗体，检测限分别为11.7 ng/m l和16.6 ng/m l，制成免疫亲和色谱柱吸附容量分别为6.6μg/m l和5.4μg/m l，羟胺苄青霉素、氨苄青霉素等的回收率为67-100%。 四． 其他分析方法

SPR生物传感器技术也是残留检测研究的一个方向。SPR生物传感器技术是一种用表面等离子体共振（SPR）技术为基础的生物传感器检测技术。D illon 〔15〕等(2003) 使用表面等离子共振(SPR ) 免疫传感器检测牛奶中头孢氨苄残留。首先将头孢氨苄-BSA 联接到传感膜表面的葡聚糖凝胶上, 然后通过微射流取样操纵系统将待测样品连续注射通过传感膜表面, 抗原抗体特异性结合后,传感膜表面复合物浓度发生变化, 再利用SPR 检测器把抗原抗体反应的情况实时反应在传感图上, 检测范围在0.24～ 3.9μg /m l。Valérie

Gaudin等

[ 18]

（2001）采用SPR生物传感器技术检测经过酶解和酸解开环的青霉素类抗生素，

氨苄青霉素的检测限分别为33μg/L和12.5μg/L.且与头孢类抗生素没有交叉反应。 2004年, Giuseppe等[19]采用SPR生物传感器检测牛奶中残留抗生素β-内酰胺。通过离心等前处理避免基质干扰所检测苄青霉素可以达到欧盟所规定的最大残留限量（MRL）标准（4μg/kg）。另外，Knecht B G等[16] （2004）将微阵列芯片技术与免疫分析法相结合用于奶中抗生素的检测，采用间接竞争ELISA模式进行多残留免疫分析，结合PASA系统进行十种抗生素的检测，所有液体样品处理都是自动完成，每个分析物所需时间不超过5min,其中头孢类抗生素检测限可达到0.12μg/L。PASA系统被认为是第一个可用于大量抗生素同时检测的免疫化学生物传感器平台。

结语

目前, 抗生素残留分析方法主要有微生物检测法、理化检测法和免疫检测法等,微生物方法虽然灵敏度、准确度差，但由于其简便、易操作至今仍然被大量采用；理化检测法由于高的灵敏度和检测限，作为确证方法必不可少，但因为其需要昂贵的仪器和专业的操作人员且前处理复杂也难以普及; 其中免疫检测法具有简便、快速、准确、灵敏等特点而倍受研究学者们的关注。试剂盒在测定牛乳、肉类组织、血清及尿液中抗生素残留时，具有易于使用，不需昂贵设备等特点，检测结果与GC-MS 分析有良好的相关性。与传统方法相比，如以纸片法、TTC法等为主的MIT 法，灵敏度高5-10 倍；近年来，应用免疫化学和酶联免疫用于检测β-内酰胺抗生素残留已成为一种趋势， 而且目前还有将HPLC方法与免疫化学筛选试剂盒结合用于检测β-内酰胺类抗生素的残留的趋势。另外，还有将SPR生物传感器技术、微阵列芯片的PASA系统等技术用于奶中抗生素残留检测。但不论采用哪种方法，快速、便携、高灵敏度、高通量是现代抗生素残留检测的目标。总之，我国各种药物的残留检测技术与发达国家存在一定差距，还远不能达到要求，亟需提高。

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