细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤

围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结

实验一：细胞传代培养

材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10?S的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等

步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）

1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10?S的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。

3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。

4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。

5、弃上清液，加入少量10?S的1640培养基使成细胞悬液。

6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。

7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。

总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。

2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。

3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。

4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。

实验二：细胞冻存

材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等

步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3） 1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；

FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好，汇合度达到95%左右），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次。

3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2~3min。

4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。

5、取冻存管一个，往里面分别加入100ul DMSO（须避光保存）、200ulFBS、700ul 1640，用移液枪轻轻吹打混匀。标记好细胞类型，时间等。 6、弃上清液，加入冻存液使成细胞悬液。

7、细胞悬液加入冻存管后，放在降温盒中，置于-80°C冰箱过夜，第二天再放入液氮罐中保存。

总结：1、常用细胞保护剂有甘油和二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓

慢解冻过程中，能够使细胞内水分在冻结前透出细胞外。

2、细胞冻存和复苏应遵循缓慢降温、快速复苏的原则。细胞冻存中DMSO浓度一般为5%—15%，常用10%。冻存液中血清可促进细胞复苏后的存活率。 2、细胞置于-80°C可保存半年左右，液氮长期保存。

3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中，这个操作应该在2min内完成。（冻存管会以10°C/min的速度升温，若温度上升超过-50°C，细胞会迅速恶化）

实验三：细胞复苏

材料：15ml离心管、枪（头1ml）、无菌吸管、培养瓶、RPMI—1640(OVCAR-3)、FBS、PBS等

步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3） 1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、快速（2min内）从低温冰箱中取出OVCAR-3细胞置于37°C水浴箱内解冻。

3、往培养瓶中加入1640 10ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。

4、弃上清液，加入新的培养基，用移液枪轻轻吹打混匀成悬液。 5、按照1:2分装到培养瓶中，做好标记。 6、置于CO2培养箱中培养观察。

总结：1、细胞在-5°C—0°C最易受损，故复苏时应快速置于37°C水浴箱

中（尽量2min内完成）。

2、由于DMSO突然稀释会给细胞造成严重的渗透性伤害，稀释细胞存活率降低，复苏后应该缓慢稀释细胞悬液，

3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中，这个操作应该在2min内完成。（冻存管会以10°C/min的速度升温，若温度上升超过-50°C，细胞会迅速恶化。）

4、倘若细胞冻存状态不是很好，可用含血清培养基稀释DMSO至终浓度为1%，或者低速离心800rpm左右。

实验四：细胞铺板及siRNA转染

材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、EP管、6孔板、siRNA、10?S的RPMI—1640(SKOV-3)、M5A(OVCAR-3)、PBS、trypsin、SiRNA转染试剂等

步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）

（本实验采用OVCAR—3，VRoche ： M siRNA=5:1，培养基V=1ml） 1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；1640、trypsin、FBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、取一个生长良好的OVCAR—3细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次。

3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2~3min。（细胞突起消失，渐变圆形，细胞间隙增大停止消化）

4、加入1640 1ml配成悬液，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000r/min，5min。

5、弃上清液，加入1640混成1ml悬液；细胞计数。

6、取6孔板分别标记为CTL、NC、S2，孔板先加培养基1ml/孔，然后细胞100ul/孔。倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记日期，姓名，细胞种类等。

7、取6个无酶EP管，分别标记为CTL、CTL1、NC、NC1、S2、S2a。CTL

管、NC管、S2管分别加入无血清的Opti-MEMI培养基100ul，然后用移液枪往三管中各加入10ul的SiRNA转染试剂（Roche）； CTL1管、NC1管、S2a管分别加入无血清Opti-MEM I 培养基100ul，然后NC1管、S2a管依次加入7.58ul的NC、7.58ul SiRNA（S2）。最后，CTL1移入CTL、NC1移入NC、S2a移入S2，用移液枪吹打混匀。

7、按CTL组每孔105ul CTL管液；NC组每孔108.79ul NC管液、S2组每孔108.79ul S2管液，依次加入。

8、充分混匀后，放入CO2培养箱中培养48h，western blotting用。

实验五：western印迹法

材料：EP管、15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、高速离心机、分光光度仪、—20°C低温冰箱、摇床、垂直板电泳转移装置、96孔板、PBS（0.01mol/L PH7.3）、细胞裂解液（RIPA+PMSF+磷酸酶抑制剂）、碧云天SDS-PAGE试剂盒、甲醇、PVDF膜、4xSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、丽春红染液、考马斯亮蓝溶液、脱脂奶粉、TBST、抗体、显影液等 液体配制：

1×电泳缓冲液：Tris 3.03g + 甘氨酸14.4g + SDS 1g 加蒸馏水至1L（溶解后常温保存，可重复使用3—5次）

10×电泳缓冲液：Tris 30.3g + 甘氨酸144g 加ddH2O，定容至1000ml（此储存液可长期常温保存。配置时，可先加入700ml去离子水，待全部溶解后，加水至1000ml）

转膜缓冲液：Tris 5.8g + 甘氨酸2.9g + SDS 0.37g + 甲醇 200ml 加蒸馏 水1L（溶解后常温保存，可重复使用3—5次）

封闭液（5%）：脱脂奶粉5g +TBST 100ml（溶解后4°C保存） TBST ：20x TBS 25ml+ 蒸馏水475ml+ Tween-20 500ul（0.05‰~1‰）

细胞蛋白提取

步骤：

1、准备材料，配备好细胞裂解液（RIPA : PMSF : 磷酸酶抑制剂=100:1:1），置于4°C冰上待用。

2、将六孔板的培养基去掉，用预冷的PBS 1ml/孔，洗2次。

3、加入预冷的细胞裂解液，70ul/孔；置于冰上30min，裂解过程中经常弹

一弹使细胞充分裂解。EP管标记为CTL、NC、S2。

4、用细胞塑料刮将贴壁细胞轻轻地刮下。用移液枪将已裂解的细胞分别移入预冷的已标记好的EP管中。

5、将分装标记好的EP管置于—80°C保存待用。

蛋白含量测定

步骤：

1、取已冻存的蛋白液室温融化后，4°C离心12000rpm，30min。 2、将EP管置于4°C冰上，弃去沉淀， 吸取上清液于新的预冷EP管中，分别标记为CTL1、NC1、S2a。

3、取 一个96孔板，采用其中6孔作为标准孔分别加入各种试剂（ul）。 编号 1 2 3 4 5 6 ddH2O 25 20 15 10 5 0 BSA 0 5 10 15 20 25 (Total volume：25ul ) 4、往三个加样孔中分别加入22. 5ul ddH2O（DDI），CTL1、NC1、S2a三管中各取2.5ul蛋白液分别加入到三个加样孔中。按照反应液A∶B=50∶1，三个样品孔和六个标准孔中分别加入200ul AB混合液。 5、混匀后，放在37°C培养箱中30min。

6、在生物分光光度计上比色分析，制作标准曲线。随后得到样品蛋白质浓度。按照上样蛋白35ug计算蛋白上样体积，加入蛋白上样缓冲液制成电泳上样品，100°C金属浴10min左右即可，—80°C保存备用。

总结：1、当反应液和待测蛋白放在37°C培养箱中30min后，尽快测定蛋白浓度(随反应时间推移，所测蛋白浓度会增高)。

SDS-PAGE电泳

步骤： 1、清洗玻璃板

玻璃板两面先用洗衣粉或者清洁剂轻轻擦洗，然后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后置于烤箱中烘干。

2、灌胶与上样

（1）玻璃板对齐放入夹中卡紧（以免漏胶），然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （2）目的蛋白为：CSTB14KD β－actin43KD，按照碧云天的操作说明，根据蛋白分子量选定分离胶浓度为12%。加入10%AP和TEMED后立即摇匀灌胶（操作过程中避免产生气泡），待胶面升至绿带中间线位置即可停止灌胶，注入适量异丙醇或者蒸馏水（加入时要慢，以免胶被冲变形，确保分离胶在一条水

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