毕赤酵母表达系统简介

巴斯德毕赤酵母及启动子

1.1 毕赤酵母表达系统简介

随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。 1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件

由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和 polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或 Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5′端和启动子的3′端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。目前所采用的表达体均为穿梭质粒，先在大肠杆菌保存、复制、扩增，然后线性化后被导入宿主母细胞。

常用的表达载体包括胞内表达载体及分泌表达载体如下表：

表1 常用表达载体及其选择标记

表达方式

载体名称 pPICZA,B,C

胞内表达

pPIC6A,B,C PGAPZA,B,C

启动子 AOX1 AOX1 GAP

选择标记 Zeocin blasticidin Zeocin

pPIC3.5K PAO815 PFLD pPICZαA,B,C pPIC6αA,B,C

分泌表达

PGAPZαA,B,C pPIC9k pFLDα

AOX1 AOX1 FLD AOX1 AOX1 GAP AOX1 FLD

His4 kanmycin ampicillin His4 ampicillin Zeocin ampicillin Zeocin blasticidin Zeocin

His4 kanmycin ampicillin Zeocin ampicillin

1.1.2 毕赤酵母表达系统的优势

自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，它还具有以下的优势:

（1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；

（2）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；

（3）外源蛋白基因遗传稳定。外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够到高表达菌株；

（4）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

1.2 AOX启动子序列分析现状

启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上的重要作用，不仅决定了基因的表达水平，也决定了基因表达的时空顺序[7,8]，可以说启动子活性的高低在很大程度上影响着基因表达最终产物的表达水平。所以找到一个转录启动功能较好的启动子，对于外源蛋白高效表达的研究具有重要的意义。目前，已有不少的启动子被克隆和功能鉴定[9]。

新型疫苗主要包括亚单位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重组活载体疫苗等，尽管大多数被认为较为安全，但往往都需要免疫刺激性强的佐剂来提高免疫效果。菌蜕疫苗可通过发酵大量生产且无需加入佐剂即可获得坚强的免疫效果。

目前，毕赤酵母表达系统中较常用的表达载体有两类[10]：种是分泌型表达载体(如pPIC9K) ，另一种是组成型表达载体(如pGAPZB) 。前者(以pPIC9K为例) 含有的醇氧化酶启动子pAOX1，可以在甲醇的诱导下高效表达。该载体自身携带有α 分泌信号肽，可以将外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB 为

例) 含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pGAP，可以在多种碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸条件下表达外源蛋白，且不需添加诱导物[11]。

在启动子功能的研究中，多数是利用报告基因的表达量来达到功能研究的目的，常用的报告基因有绿色荧光蛋白GFP( green fluorescent protein) 、红色荧光蛋白RFP( red fluorescent protein) β-葡糖醛酸糖苷酶GUS(β-glucuronidase) 和氯霉素乙酰转移酶CAT( chloramphenicolacetyltransferase) 等[12,13]。在前期的工作中，克隆了启动子pScgpd，并在巴斯德毕赤酵母中研究了AOX1 启动子的功能[14]。实验以人血清白蛋白(HSA）作为报告基因，在Pichia pastoris GS115中表达。

到目前为止，利用AOX启动子表达的蛋白有很多，例如：在AOX1 ( 醇氧化酶) 启动子调控下，类似天然抗菌肽大小的magainin 及cecA-mil 蛋白获得分泌表达[15]；人前列腺特异性抗原的表达[16]；重组木糖异构酶的分泌和表达[17]；人骨唾液酸蛋白的表达等[18]。

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