超高效液相色谱的应用现状和发展前景

生物分离工程课堂报告之——

超高效液相色谱的应用现状和发展前景Speaker:黄妙珍 09生物技术三班 2011.11.3

常见的分离方式蒸馏

过滤

离心

色谱电泳 超滤色谱分离精度高，设备简 单，操作方便，根据各种 原理进行分离的色谱法不 仅普遍应用于物质成分的 定量分析和检测，而且广 泛应用于生物物质的制备 分离和纯化。是目前最好 的生物纯化技术。

色谱分类色谱

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柱状色谱 纸色谱

色相色谱

薄层色谱高效液相色谱 超高效液相色谱

色谱典型的仪器配置色谱泵及控制器 数据处理及控制

色谱柱

检测器W a te rs 486

进样器

色谱条件的优化

分离度

速度

容量

开发液相色谱方法 分辨率是色谱分离中主要考虑的因素 在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下几个因素 都要考虑。

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灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗

超高效液相色谱自20世纪70年代以来，随着高效液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)技术的不断发展，美国Waters公司于 2004年的匹兹堡会议上推出了最新研制的 Click to add title in here ACQUITY超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC),其采用1.7 Ixm细粒径的新型固定相，可获得高达2万块/m 理论塔板数的超高柱效，并以系统整体设计的创 新技术，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和 分离度，造就了液相色谱性能上的飞跃和进步并 形成分离科学的一个新兴领域。

超高效液相色谱 (UPLC)的原理UPLC的理论基础为：

范德米特(Van Deemeter)方程

HETP=AdP+B v+CdP2 Click to add title / in hereHETP:理论塔板高度 A:涡流扩散系数 dlP:填料粒径 B:分子径向扩散系数 C:传质因子为流动相线速度由该方程可得出结论： 颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱 效的流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方 向移动，而且有更宽的线速度范围所以降低颗粒度不但提高柱 效，同时也提高速度。

van Deemter曲线的提示如果填料的颗粒继续演变……

Click to add title in hereClick to add title in here

未来的色谱:更小的颗粒度小颗粒分离的理论与科学基础

液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直 接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。由上图可知：随 着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。

更小颗粒度所面临的挑战

小颗粒带来生产力

--------UPLC的优点

基于1.7 m小颗粒技术的UPLC与人们熟知的高效液相色谱(HPLC)技术，具有相 同的分离原理。不同的是，UPLC不仅比HPLC具有更高的分离能力，而且结束了 人们多年不得不在速

度和分离度之间取舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速 度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果

超高分离度由右图可见：UPLCTM 可以大大提高分离度， 同时色谱峰强度也得 到了提高。 Click to add title in here图3: UPLCTM与HPLC:分离度比较

小颗粒带来生产力超高速度

--------UPLC的优点

图5:

UPLC美国药典有关物质分析实例

图4: UPLC与HPLC:速度比较

原有HPLC分析需要4个不同的方法、 三根不同的色谱柱，至少需要65分 钟才能完成；UPLC使用了一根色谱 柱、一种简单方法，在1分钟内即可 完成。

小颗粒带来生产力超高灵敏度速度

--------UPLC的优点UPLCTM使用小颗 粒技术可以得到更 高的柱效(因而改 善了分离度)、更 窄的色谱峰宽，即 更高的灵敏度。

图6: HPLC到UPLCTM:灵敏度的改善无需折衷

UPLC仪器构造

UPLC仪器构造

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UPLC仪器模式图

UPLC数据采集软件Empower软件Empower 具有基于图标和图形的用 户界面，可用于采集、处理、管理、 报告和存储色谱数 据。

MassLynx软件MassLynx 为高性能质谱应用 程序，用于采集、分析、管理 和分布 UV 及质谱数据。它提 供 了智能仪器控制，可以采集额 定质谱、完全质谱、MS/MS 和完全质谱 MS/MS 数据。

UPLC的样品瓶和样品板

超高效液相色谱的局限性尽管UPLC能显著减少复杂样品的分析分离时间，提高检测的灵敏度和分离度，但 目前UPLC的使用仍然存在局限性，其普及应用可能仍然需要一些时间。 色谱柱要能够耐受由于粒径减小而带来的高 反压，而且粒径的减小也给色谱柱充填技术 带来了挑战。

与UPLC匹配 的色谱柱比较少

峰面积的重复性欠佳

UPLC分析样品时峰面积的重复性略逊 于HPLC,特别是低浓度样品时更加明 显，其峰面积重复性的RSD约为HPLC 的2倍。 UPLC分离样品色谱峰扩展很小，通常峰底宽 度只有几秒钟，低浓度的样品峰则更窄。 O’Connor等 发现，使用UPLC测定低浓度 样品时，准确度、精密度都比较差。

对高频检测仪器的需要

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