热量限制对心肌细胞的影响

作者】周卉芬； 【导师】王伟；

【作者基本信息】汕头大学，心血管内科学， 2010，硕士

【摘要】目的:1.研究SIRTs(SIRT1-7)在大鼠心脏组织及H9c2心肌细胞的定位;2.初步探讨热量限制对心肌细胞SIRT1-7表达的影响。方法:3个月龄健康雄雌SD大鼠20只,随机分成两组:①正常对照组(ad libitum,AL)(n=10):随意进食;②热量限制组(Calorie Restriction,CR)(n=10):喂养量为对照组的60%,分别称体重。饲养3周后称体重,用质量分数2 %的戊巴比妥麻醉后处死,取出心脏,称重,沿心脏纵轴平均分为三份,心尖及心底部用于Western blot,对比两组SIRT1-7蛋白表达水平的变化;中间部分心脏用于免疫组织化学,定性检测SIRT1-7在大鼠心脏组织的定位。大鼠心肌细胞株H9c2在含葡萄糖4.5g/L的DMEM培养基中培养48h后传代随机分为两组:①正常对照组(Control,Con):继续在含葡萄糖4.5g/L的DMEM中培养;②热量限制组(CR):弃去旧培养液,加入含葡萄糖1g/L的DMEM。两组细胞在5% CO2、37℃条件下继续培养24h后终止。免疫细胞化学法定性检测SIRT1-7在H9c2的定位; RT-PCR法检测SIRT1-7 mRNA表达水平的变化。结果:1.实验前两组大鼠两两体重的差别无统计学意义。心脏质量指数(HMI)=心脏重量/大鼠体重。实验后CR组大鼠体重及HMI均显著低于AL组(p<0.05)。2.免疫组织化学法检测SIRT1-7在大鼠心肌细胞定位,结果表明:SIRT1在细胞核及细胞质均有大量表达,以细胞核表达为主;SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5主要在细胞质表达;SIRT6、SIRT7在细胞核及细胞质均有表达,主要在细胞核表达。3.免疫细胞化学法检测SIRT1-7在H9c2细胞表达定位,结果表明:SIRT1、SIRT2、SIRT7在细胞核及细胞质均有表达,以细胞核表达为主;SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6在细胞质表达为主。4. Western Blot法检测热量限制对大鼠心肌细胞SIRT1-7蛋白表达水平的影响,结果表明:CR组SIRT1,2,3,4,7蛋白表达水平与AL组比较显著增加(p<0.05);SIRT5,6的蛋白表达在两组中没有差异。5. RT-PCR法检测热量限制对H9c2细胞SIRT1-7 mRNA表达水平的影响,结果表明:其变化与大鼠心脏SIRT1-7蛋白表达水平的变化一致。SIRT1,2,3,4,7 mRNA表达水平与正常对照组比较明显增加(p<0.05),SIRT5,6 mRNA的表达在两组中没有差异。结论:1.在心肌细胞中,SIRT1在细胞核及细胞质均有大量表达,以细胞核表达为主;SIRT2,3,4,5主要在细胞质表达;SIRT6、SIRT7主要在细胞核表达。2.热量限制可同时激活心肌细胞SIRT1,2,3,4,7,而对SIRT5,6的表达没有影响;初步推测热量限制对心肌细胞的作用可能与SIRT1,2,3,4,7表达的上调有关。 更多还原 【关键词】热量限制；SIRTs；心肌细胞； 【文内图片】

四组大鼠实验后HMI：

免疫组织化学法检测SIRTs在大鼠心肌细胞的表达情况（颗粒呈棕褐色为阳性，×1000）

免疫组织化学法检测SIRTs在H9c2心肌细胞的表达情况（颗粒呈棕褐色为阳性，×1000）

AWesternBlot法检测SIRT1-7蛋白的表达

Figure-3ATheproteinexpressionofSIRT1-7inhearttissuesofratsbyWesternBlotanalysis

BSIRT1-7蛋白表达灰度值分别与β-actin比值的变化

ART-PCR法检测SIRT1-7mRNA表达的凝胶电泳成像

BSIRT1-7mRNA灰度值分别与18SrRNA比值的变化

? 【网络出版投稿人】汕头大学

中文摘要

目的：

1. 研究 SIRTs（SIRT1-7）在大鼠心脏组织及 H9c2 心肌细胞的定位； 2. 初步探讨热量限制对心肌细胞 SIRT1-7 表达的影响。

方法：

3个月龄健康雄雌SD大鼠20只，随机分成两组：①正常对照组（ad libitum，AL）（n=10）： 随意进食；②热量限制组（Calorie Restriction，CR）（n=10）：喂养量为对照组的60%，分 别称体重。饲养3周后称体重，用质量分数2 %的戊巴比妥麻醉后处死，取出心脏，称重， 沿心脏纵轴平均分为三份，心尖及心底部用于Western blot，对比两组 SIRT1-7蛋白表达水 平的变化；中间部分心脏用于免疫组织化学，定性检测 SIRT1-7 在大鼠心脏组织的定位。 大鼠心肌细胞株H9c2 在含葡萄糖4.5g/L的DMEM培养基中培养48h后传代随机分为 两组：①正常对照组（Control，Con）：继续在含葡萄糖 4.5g/L 的 DMEM 中培养；②热量 限制组（CR）：弃去旧培养液，加入含葡萄糖 1g/L 的 DMEM。两组细胞在 5% CO

2

、37

℃条件下继续培养 24h 后终止。免疫细胞化学法定性检测 SIRT1-7 在 H9c2 的定位； RT-PCR 法检测 SIRT1-7 mRNA 表达水平的变化。

结果：

1. 实验前两组大鼠两两体重的差别无统计学意义。心脏质量指数（HMI）=心脏重量/ 大鼠体重。实验后 CR 组大鼠体重及 HMI 均显著低于 AL 组（p<0.05）。

2. 免疫组织化学法检测 SIRT1-7 在大鼠心肌细胞定位，结果表明：SIRT1 在细胞核及 细胞质均有大量表达，以细胞核表达为主；SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5 主要在细胞质 表达；SIRT6、SIRT7 在细胞核及细胞质均有表达，主要在细胞核表达。

3. 免疫细胞化学法检测 SIRT1-7 在 H9c2 细胞表达定位，结果表明：SIRT1、SIRT2、 SIRT7 在细胞核及细胞质均有表达，以细胞核表达为主；SIRT3、 SIRT4、 SIRT5、SIRT6汕头大学医学院硕士学位论文 在细胞质表达为主。

4. Western Blot 法检测热量限制对大鼠心肌细胞 SIRT1-7 蛋白表达水平的影响，结果表 明：CR 组 SIRT1，2，3，4，7 蛋白表达水平与 AL 组比较显著增加（p<0.05）；SIRT5，6 的蛋白表达在两组中没有差异。

5. RT-PCR 法检测热量限制对 H9c2 细胞 SIRT1-7 mRNA 表达水平的影响，结果表明： 其变化与大鼠心脏 SIRT1-7 蛋白表达水平的变化一致。SIRT1，2，3，4，7 mRNA 表达水 平与正常对照组比较明显增加（p<0.05），SIRT5，6 mRNA 的表达在两组中没有差异。

结论：

1. 在心肌细胞中，SIRT1 在细胞核及细胞质均有大量表达，以细胞核表达为主；SIRT2， 3，4，5 主要在细胞质表达；SIRT6、SIRT7 主要在细胞核表达。

2. 热量限制可同时激活心肌细胞 SIRT1，2，3，4，7，而对 SIRT5，6 的表达没有影响； 初步推测热量限制对心肌细胞的作用可能与 SIRT1，2，3，4，7 表达的上调有关。

关键词热量限制；SIRTs；心肌细胞 - 1 -

第1章前言

中国正迈入老龄化社会。伴随着老龄人口的增加，心血管疾病对人类的威胁将持续增 加。近年来，随着居民生活水平的不断提高，饮食习惯的改变和自然环境的不断恶化，我 国心血管疾病的发病率和死亡率都呈逐年上升的趋势。随着人口老龄化，心力衰竭在增多， 严重危害人类健康。因此，如何对抗衰老和延缓年龄相关性疾病，尤其是对如何减少心血 管疾病的发病率和死亡率，引起了科学家们广泛的关注，也有着非常重要的现实意义。 在延缓衰老的众多实验研究中，热量限制是唯一经过广泛的科学实验验证，除遗传操

作以外最强有力的延缓衰老和年龄相关性疾病的方法。1935年，美国科学家McCay等人首 次发现，通过限制食物的摄入，可使啮齿类动物的寿命延长 【1】

。此现象激发了人们的研究

热情，限制食物摄入这种实验方法被许多科学研究者应用到包括从酵母到灵长类动物等各 种物种中 【2，3】

。典型的热量限制（Calorie Restriction，CR）膳食是指满足机体对蛋白质、

维生素和矿物质等必需营养素的同时，通过减少糖类或脂肪的摄入，使得食物提供的总能 量为随意饮食（ad libitum，AL）的60%-70% 【4】

。CR的啮齿类动物不仅出现了寿命的延长，

还有体温、血糖、胰岛素水平、胰高血糖素水平、脂肪和体重的下降，伴随着胰岛素敏感 性、器官体积（除脑外）的增加 【4】

。而人类通过CR饮食也可使血糖、血压、胆固醇水平都 有改善 【5，6】

。Weindruch等人通过DNA微矩阵技术证明了CR可以延缓小鼠骨骼肌和脑组织 中衰老引起的基因改变 【7】

。最近的大量研究也发现，CR可以减少啮齿类动物及哺乳类动 物的年龄相关性疾病如肿瘤、心血管疾病的发生率 【8】 。

在过去的数十年中，许多的实验都证明了沉寂信息调节因子2（Silence information

regulator 2，Sir2 ) 家族在CR的低级动物，如酵母、果蝇及线虫的衰老过程都扮演了非常重

要的角色。Lin等人通过改变酵母培养基中糖的浓度（从正常的2%降到0.5%）制作一个CR 的模型，母酵母分裂次数增加了30%-40%，并且证明了CR的延寿作用是通过增加酵母的呼 吸而激活Sir2 【9】

。进一步的研究观察到了CR酵母的NADH水平下降 【10】 。NAD +

/NADH比值

的增加对Sir2的激活起作用 【10】

，并不是由于NAD +

的增加，而是由于NADH的减少 【2，9，10】 ，

NADH是Sir2的竞争性抑制剂，NADH的减少可上调Sir2的表达。Anderson等人的实验结果 则从另一方面证明了CR与Sir2的关系。烟酰胺酶I基因（pyrazinamidase/nicotinamidase 1， PNC1）编码的酶可使Sir2的抑制剂烟碱（NAM）脱氨基，而CR可使PNC1增加，NAM减 少，也是酵母CR的延寿作用所必须的

医学院硕士学位论文 - 41 -

[6]. Ingram DK, Anson RM, de Cabo R, Mamczarz J, Zhu M, Mattison J, Lane MA, Roth GS. Development of calorie restriction mimetics as a prolongevity strategy, Ann. N Y Acad. Sci, 2004, 1019:412-423.

[7]. Kaeberlein M, McVey M, Guarente L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote

longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev, 1999,

13:2570–2580.

[8]. Lin SJ, Kaeberlein M, Andalis AA, Sturtz LA, Defossez PA, Culotta VC, Fink GR, Guarente

L. Calorie restriction extends Saccharomyces cerevisiae lifespan by increasing respiration.

Nature, 2002, 418(6895):344-348.

[9]. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P,

Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Small molecule activators of sirtuins

extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature, 2003, 425(6954):191-196.

[10]. Michan S, Sinclair D. Sirtuins in mammals: insights into their biological function. Biochem J, 2007, 404:1-13.

[11]. Tannenbaum A. The initiation and growth of tumors.Introduction.Effects of underfeeding. Am J Cancer, 1940, 38: 335–350.

[12]. Kritchevsky D. Caloric restriction and experimental carcinogenesis. Hybrid Hybridomics, 2002, 21: 147–151.

[13]. Verdery RB, Ingram DK, Roth GS, Lane MA. Caloric restriction increases HDL2 levels in rhesus monkeys (Macacamulatta). Am J Physiol, 1997, 273: E714–E719.

[14]. Edwards IJ, Rudel LL, Terry JG, Kemnitz JW, Weindruch R, Zaccaro DJ, Cefalu WT.

Caloric restriction lowers plasma lipoprotein (a) in male but not female rhesus monkeys.

ExpGerontol, 2001, 36: 1413–1418.

[15]. Jung SH, Park HS, Kim KS, Choi WH, Ahn CW, Kim BT, Kim SM, Lee SY, Ahn SM,

Kim YK, Kim HJ, Kim DJ, Lee KW. Effect of weight loss on some serum cytokines in

human obesity: increase in IL-10 after weight loss. J NutrBiochem, 2008, 19(6):371-375. [16]. Pereira MA, Swain J, Goldfine AB, Rifai N, Ludwig DS. Effects of a low-glycemic load diet on resting energy expenditure and heart disease risk factors during weight loss. JAMA, 2004, 292: 2482–2490.

[17]. Walford RL, Harris SB, Gunion MW. The calorically restricted low-fat nutrient-dense diet 汕头大学医学院硕士学位论文 - 39 -

的产生，从而减缓了随年龄增加而削弱的DNA的修复等 【24，25，26】

。Zainal等人通过对恒河猴

的研究也发现，CR可延缓其骨骼肌中随年龄增长的氧化损伤 【27】 。

2.4 CR 延缓动脉粥样硬化斑块进程

研究发现，CR 可减弱啮齿类动物动脉粥样硬化的形成。剔除小鼠的载脂蛋白 E 基因 （apolipoprotein E gene）（ApoE -/- ），分别以自由饮食（ad libitum，AL）和热量限制饮食（CR）

喂养，观察主动脉近端粥样硬化斑块的形成情况，发现 CR 的小鼠斑块形成更小，且为更 早期的动脉粥样硬化，如泡沫细胞和脂质条纹阶段（Ⅰ-Ⅱ型）；而 AL 小鼠斑块病变多为 纤维帽和细胞外脂质融合（Ⅳ-Ⅴ型）。另外，CR 小鼠主动脉的脂质过氧化氢、过氧化物和 过氧化氢都有明显下降 【28】

。这些结果都提示了 CR 在ApoE -/-

小鼠的抗动脉粥样硬化作用

可能与 CR 的抗氧化应激有关。相关的研究也证明，在灵长类动物包括人类，CR 也有同样 的心血管保护作用。虽然 CR 在成年人或年老的灵长类动物的动脉粥样硬化和斑块形成的 作用尚不明确，但 CR 确实可以提高灵长类动物的胰岛素敏感性，从而影响心血管疾病 【29】 。

Walford等人通过对健康人群进行为期 2 年的 CR 后，观察到其生理生化改变与在动物实验

结果类似 【30】 。

2.5 CR 与心力衰竭

心力衰竭是各种心脏病的严重阶段和最终结局，其病理基础是心脏不能充分泵血，满

足机体需要。最早出现的是心肌的肥厚，随后出现心肌细胞凋亡增加并最终导致脏器衰竭。 最近的研究表明，SIRT1在减少不可再生性的心肌细胞的肥大和凋亡或可改善或延缓心力 衰竭起到不可忽视的作用。Alcendor等人报道，SIRT1可影响心肌细胞的生长和凋亡，抑制 SIRT1在心肌细胞的活性可引起凋亡速率和心肌基因相关性肥大的增加 【31】

。使用Sir2抑制

剂NAM使肌细胞体积和分裂相减少，而p53显性负突变却未观察到类似的现象，SIRT1活性

的下降与细胞调节因子 p53乙酰化水平升高相关，而p53显性负突变则消除了这种由 SIRT1活性下降引起的作用 【31，32】

。另一方面，SIRT1的上调对于心肌细胞有保护作用，因 SIRT1可对抗异丙肾上腺素诱导的心力衰竭 【33】

。再者，SIRT1的高表达还可抑制半胱氨酸

蛋白酶3 的活性，从而提高了心肌细胞抗凋亡或衰老的能力，达到保护心肌及其活力的目

的。以上实验表明，SIRT1是心肌细胞生长和应激条件下都起到重要作用。Cohen等人已经 证实，在CR可使大鼠的大脑、内脏脂肪、肾脏和肝脏的 SIRT1 的表达增加 【34】 ，提示CR

可通过使SIRT1活性上调从而从另一方面保护心脏。 3．CR 在人类中的应用

尽管 CR 在各种实验中都被证明可延长物种寿命，且可以延缓年龄相关性疾病的发生，汕头大学医学院硕士学位论文 - 42 -

in Biosphere 2 significantly lowers blood glucose, total leukocyte count, cholesterol, and

blood pressure in humans. ProcNatlAcadSci U S A. 1992, 89: 11533–11537.

[18]. Lefevre M, Redman LM, Heilbronn LK, Smith JV, Martin CK, Rood JC, Greenway FL,

Williamson DA, Smith SR, Ravussin E; Pennington CALERIE team. Caloric restriction

alone and with exercise improves CVD risk in healthy non-obese individuals. Atherosclerosis, 2009, 203(1):206-213.

[19]. Adler A, Messina E, Sherman B, Wang Z, Huang H, Linke A, Hintze TH. NAD (P) H

oxidase-generated superoxide anion accounts for reduced control of myocardial O2

consumption by NO in old Fischer 344 rats. Am J Physiol Heart CircPhysiol, 2003, 285: H1015–H1022.

[20]. Raitakari M, Ilvonen T, Ahotupa M, Lehtimaki T, Harmoinen A, Suominen P, Elo J,

Hartiala J, Raitakari OT. Weight reduction with very-lowcaloric diet and endothelial

function in overweight adults: role of plasma glucose. ArteriosclerThrombVascBiol, 2004, 24: 124–128.

[21]. Sasaki S, Higashi Y, Nakagawa K, Kimura M, Noma K, Hara K, Matsuura H, Goto C,

Oshima T, Chayama K. A low-calorie diet improves endothelium-dependent vasodilation in obese patients with essential hypertension. Am J Hypertens, 2002, 15: 302–309.

[22]. Mattagajasingh I, Kim CS, Naqvi A, Yamamori T, Hoffman TA, Jung SB, DeRicco J,

Kasuno K, Irani K. SIRT1 promotes endotheliumdependent vascular relaxation by activating endothelial nitric oxide synthase. ProcNatlAcadSci U S A, 2007, 104: 14855–14860.

[23]. Ungvari ZI, Orosz Z, Labinskyy N, Rivera A, Xiangmin Z, Smith KE, Csiszar A. Increased mitochondrial H2O2 production promotes endothelial NF-kB activation in aged rat arteries. Am J Physiol Heart CircPhysiol, 2007, 293: H37–H47.

[24]. Murdoch CE, Zhang M, Cave AC, et al. NADPH oxidase-dependent redox signaling in

cardiac hypertrophy, remodeling and failure. Cardiovasc Res, 2006, 71 (2): 208–215.

[25]. Crow MT, Mani K, Nam YJ, et al. The mitochondrial death pathway and cardiac myocyte apoptosis. Circ Res, 2004, 95 (10):957–970.

[26]. Kujoth GC, Hiona A, Pugh TD, et al1 Mitochondrial DNA mutations, oxidative stress, and apoptosis in mammalian aging Science, 2005, 309 (5733) : 481-484.

[27]. Sohal RS, Weindruch R. Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science, 1996, 273: 汕头大学医学院硕士学位论文 - 45 -

个人简历

姓名周卉芬性别女

民族汉族出生年月 1985 年 11 月 政治面貌共产党员培养方式国家任务

毕业院校汕头大学医学院学历硕士（七年制） 主修专业内科学研究方向心血管内科 学制年限七年籍贯广东五华

1997.9——2003.7 深圳市深圳大学师范学院汕头大学医学院硕士学位论文 - 43 - 59–63.

[28]. Guo Z, Mitchell-Raymundo F, Yang H, Ikeno Y, Nelson J, Diaz V, Richardson A, Reddick

R. Dietary restriction reduces atherosclerosis and oxidative stress in the aorta of

apolipoprotein E-deficient mice. Mech Ageing Dev,2002,123: 1121–1131.

[29]. Cefalu WT, Wang ZQ, Bell-Farrow AD, Collins J, Morgan T, Wagner JD. Caloric

restriction and cardiovascular aging in cynomolgus monkeys (Macacafascicularis): metabolic, physiologic, and atherosclerotic measures from a 4-year intervention trial. J

Gerontol A BiolSci Med Sci, 2004, 59:1007–1014.

[30]. Walford RL, Mock D, Verdery R, MacCallum T. Calorie restriction in biosphere 2:

alterations in physiologic, hematologic, hormonal, and biochemical parameters in humans

restricted for a 2-year period.JGerontol A BiolSci Med Sci, 2002, 57(6):B211-224.

[31]. Alcendor RR, Kirshenbaum LA, Imai S, Vatner SF, Sadoshima J. Silent information

regulator 2alpha, a longevity factor and class III histone deacetylase, is an essential

endogenous apoptosis inhibitor in cardiac myocytes. Circ Res, 2004, 95(10):971-980.

[32]. Pillai, JB, Isbatan A, Imai S and Gupta MP. Poly (ADP-ribose) polymerase-1-dependent

cardiacmyocyte cell death during heart failure is mediated by NAD+ depletion and reduced Sir2α deacetylase activity. J. Biol. Chem, 2005, 280:43121–43130.

[33]. Zhou B, Wu L-J, Li L-H, Tashiro S, Onodera S, Uchiumi F, Ikejima T. Silibinin protects

against isoproterenol-induced rat cardiac myocyte injury through mitochondrial pathway

after up-regulation of SIRT1. J PharmacolSci, 2006, 102:387–395.

[34]. Cohen HY, Miller C, Bitterman KJ, Wall NR, Hekking B, Kessler B, et

al. Calorie

Restriction Promotes Mammalian Cell Survival by Inducing the SIRT1 Deacetylase.Science,2004,305(5682):390-392. 汕头大学医学院硕士学位论文 - 44 -

致谢

首先衷心感谢我的导师王伟教授两年来对我的悉心栽培和教诲！在过去的两年里恩师 对我的成长倾注了无尽的心血，感谢您在学业上不断的指导和生活上无微不至的关怀！恩 师渊博的知识和高尚的人格，对工作和事业持之以恒孜孜以求、大胆创新的态度以及平易 近人的为人等无一不是学生终身学习的榜样，永远激励着我积极向上、努力进取、勤奋踏 实、真诚待人地学习、工作和处事。恩师教会我的不仅仅是科研的方法和临床的能力，更 重要的是一种思想品格的熏陶，对我今后的工作和学习将产生深远的影响。谢谢您！ 特别感谢细胞衰老实验室傅玉才教授为我提供实验场所与指导。衷心感谢林锐波、余

伟、黄宝丰、陈振国、武君等师兄师姐在实验上给我的热情帮助和指导。衷心感谢王东明、 陈宋明、王欣主任医师、曾欣、黄贤生、李吉林、杨宝军医生及心血管内科的其他全体医 护人员在平时临床学习和工作的悉心教导和帮助！是您们，我的临床经验才得以不断丰富， 临床技能才得以不断提高，谢谢您们！感谢汕头大学医学院第一附属医院各位领导对我学 习、工作的关心和支持。感谢教育培养我的汕头大学医学院的各位老师和曾经帮助过我的 所有老师和同学。

感谢03本硕班的所有同学，7年的相处培养了我们深厚的感情，离别在即，衷心祝愿 各位前程似锦！

衷心感谢大学期间给予热心帮助的所有老师、朋友，在此一并谢忱！

深深感谢我最亲爱的家人和男朋友，他们给了我最无私的支持和默默的帮助，因为有 了他们的关心和爱护，我才能在求学路上走得更远。最后，感谢答辩委员会全体老师付出 的辛勤劳动！

周卉芬

2010年5月

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/y7b3.html