HBsAg--主要生产工艺及反应体系

乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法) 生产工艺研究及反应体系的建立研究资料

目录

A、研究择要--------------------------------------------------------------------------------------------------第2页 B、缩略语------------------------------------------------------------------------------------------------------第5页 C、正文

一、.主要生产工艺描述及确定依据---------------------------------------------------------------第6页 二、反应体系的组成----------------------------------------------------------------------------------第16页 三、被测样本的要求----------------------------------------------------------------------------------第17页 四、试剂用量--------------------------------------------------------------------------------------------第19页 五、体系的反应条件---------------------------------------------------------------------------------第20页 六、体系的有效性确定方法(校准、质控方法) ---------------------------------------------第21页 附图1 乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒（胶体金法）生产工艺流程图---------------第

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A、研究择要

本检测试纸是由固相有纯化的高特异性鼠抗HBsAg单克隆抗体A(检测线)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(对照线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体B的无纺布膜、玻璃纤维、吸水纸等其它辅料因此粘贴制成，用于定性的检测人血清/血浆中乙型肝炎病毒表面抗原。

当进行检测时，若为阳性标本，样本中的HBsAg与金标记的抗HBsAg抗体B结合形成复合物，此复合物由于层析作用沿试纸条向前移动，则与检测线区固相的抗HBs抗体A形成“固相抗HBsAg抗体A -HBsAg-金标记抗HBsAg抗体B” 双抗体夹心复合物而凝聚显色；若为阴性标本，在检测线区域不能形成双抗体夹心复合物，因此不显色。

无论HBsAg是否存在于测试样本中，一条有色条带都会出现在对照线区内。对照线区内所显现的有色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。若无对照线出现，则实验无效。

通过对样本用量、试剂用量、反应温度、质控方法等研究，建立制造工艺和质控方法，确定本检测试纸的操作步骤、结果判定以及注意事项等，最终建立生产工艺和反应体系。

B、缩略语

编号 1 2 3 4 名词 乙型肝炎病毒五项标志物 乙型肝炎病毒表面抗原 鼠抗HBs单克隆抗体 羊抗鼠IgG多克隆抗体 缩略语 HBV HBsAg 鼠抗HBs抗体 GAM 第 2 页 共 23 页

C、正文

1、主要生产工艺过程 1.1金标抗体反应膜制备 1.1.1参数设置

表1 胶体金标记参数

A104 0.8％ 胶体金－CG(单位：μg/ml) 原料名称 鼠抗HBsAg单克隆抗体B (Y－002/ HBsAg) 最适标记量 15 0.4% 35 7.5±1 A103 最适OD值 配对宽度（mm） 1.1.2金标反应膜制备

表2 金标反应膜清单

物料编码 F-002-3 Y-002/ HBsAg 辅料名称 无纺布 鼠抗HBsAg单克隆抗体B 规格 38cm×27cm / 批配料量（1000板） 30张 120mg 注：(1)Y-002/ HBsAg的包装规格可以不同，但是总量一定。

(2) 此规格每张有效长度均以34cm计，折合34板(每板宽度1cm)。

1.1.2.1胶体金溶液制备

在加热煮沸的3800ml纯化水中快速加入A102溶液80ml，待溶液再次沸腾后，迅速加入A101溶液80ml，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可。待溶液冷却至室温后，加入纯化水补充至4000ml。共制备2瓶。

备注：每1000板需要该比例胶体金溶液的体积为8000毫升。 1.1.2.2胶体金-抗体结合物制备：

标记原料：鼠抗HBs 单克隆抗体B (Y-002/ HBsAg)

每4000ml胶体金溶液，首先加入32ml A104，混匀，将上述胶体金溶液按照15μg/ml的比例加入Y-002/ HBsAg (即每1000ml需要Y-002/ HBsAg的重量为15mg)，混匀，静置5分钟，然后加入A103溶液16ml，混匀，静置5分钟。经3次30分钟的离心，离心速度为：5000rpm、7000rpm、9000rpm，合并三次收集的沉淀(体积V1)。

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1.1.2.3金标反应膜制备

合并沉淀体积为V1，取30ul沉淀100倍稀释测524nmOD值A(A>0.5)，按100A*V1=35*V2加金标结合物稀释液稀释沉淀至体积V2即制得金标抗体溶液；将制得的金标抗体溶液按每张无纺布涂布10ml均匀涂布，室温晾干18－20小时即可。 1.1.2.4分切

将晾干的金标反应膜按照中间体配对确定的宽度进行分切(通常7.5±1 mm)，记做生产中间体条组分S4。铝箔袋密封，室温存放。 1.2硝酸纤维反应膜制备

表3 包被参数

检测线－T(单位：mg/ml) 原料名称 鼠抗HBsAg单克隆抗体A Y－001/ HBsAg 稀释浓度 1.5 对照线－C(单位：mg/ml) 原料名称 羊抗鼠IgG多克隆抗体 Y－003/GAM 稀释浓度 1.0 表4 硝酸纤维素膜固相准备

物料编码 F-001-3 HBsAg 01 辅料名称 硝酸纤维膜 HBsAg 01包被液 规格 27cm×16cm 1.5mg/ml 批配料量（1000板） 125张 60mg HBsAg 03 HBsAg 03包被液 1.0mg/ml 40mg 注：(1) 每ml包被液可以包被25板；每1000板需要40ml包被液； (2) 每张硝酸纤维膜计为8板；

(3) 硝酸纤维反应膜沿膜上密虚线标志线分切。

1.2.1包被

(1) 抗HBs单克隆抗体A(检测线)、羊抗鼠lgG多克隆抗体(对照线)使用B101分别稀释至1.5mg/ml、1.0mg/ml，分别加入喷点包被机的1号杯、2号杯；

(2) 调试自动喷膜机，喷液量设定为1.4μl/cm，导轨速度6.0cm/sec。喷嘴1与2间隔5mm.。

(3)包被后的硝酸纤维素膜过夜晾干。 1.2.2封闭

(1) 按每100ml B102+900ml纯化水浸泡5张（折40板）膜计，将包被好的膜浸入封闭2小时；

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(2) 将膜取出沥干，过夜晾干，即制得硝酸纤维反应膜，存干燥盒转入中间站待验，待检合格后沿膜上密虚线标志线分切。 1.2.3 分切

按照膜面标志线分切，每张8板。记做生产中间体条组分S1。铝箔袋密封，室温存放。

2、建立的反应体系 2.1样本要求

1) 样本采集前对受检者无特殊要求，不需禁食，按照常规的实验室程序收集血清/血浆标本。

2) 样本收集后应尽快分离血清/血浆以避免融血。严重溶血和乳糜样本不能用于检测，以免引起误判；已经进行加热处理的样本及已被微生物污染的样本不能用于检测。 3) 血清样本应收集在不含任何抗凝剂的试管中，血浆样本应收集于含有正常使用量柠檬酸钠、肝素、EDTA等抗凝剂的容器中。如果需要，样本中可加入0.1%叠氮钠作为防腐剂。

4) 样本收集后应尽快检测，不能将样本在室温放置太长的时间。如果收集的当天不使用，应当冷藏2-8℃保存，超过7天应当冷冻于-20 ℃保存。应尽量避免反复冻融，使用前不得超过2-3次。

5) 检测前应将样本恢复至室温，冷冻的样本应等完全融化后方可使用。 2.2检验方法

检测试剂、待检样品和其它检测用材料等测试前需平衡至室温： 1) 打开铝箔袋，取出检测试剂。

2) 试条：持试条将有箭头标志线一端插入样本收集容器中，确保样本液面直到标记线且浸没时间至少10秒(注：深度不可超过标志线横线)，然后取出平放或粘切在测试卡 (可用记录纸代替)；或者直接在试纸条/板样品垫端加样处滴1-2滴(60-80μl)待测样本，开始计时观察测试结果；

试盒：用塑料滴管在试剂盒加样区中心缓慢滴加2-3滴血清或血浆样本（约60-100μl，开始计时观察测试结果。

3) 等待红线出现，应在10-20分钟时观察反应结果，30分钟结果判定无效。 2.3检验结果的解释

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表14 硝酸纤维反应膜清单

物料编码 F-001-3 HBSAG01 HBSAG03 辅料名称 硝酸纤维膜 HBsAg 01包被液 HBsAg 03包被液 规格 27cm×16cm 1.5mg/ml 1.0mg/ml 批配料量（1000板） 125张 60mg 40mg 注：(1) 每ml包被液可以包被25板；每1000板需要40ml包被液；

(2) 每张硝酸纤维膜计为8板；

(3) 硝酸纤维反应膜沿膜上密虚线标志线分切。

3.4.1包被

(1)抗HBs包被抗体(检测线)、羊抗鼠多克隆抗体 (对照线)使用B101分别稀释至1.5mg/ml、1.0mg/ml，分别加入喷点包被机的1号杯、2号杯；

(2)调试自动喷膜机，喷液量设定为1.4μl/cm，导轨速度6.0cm/sec。喷嘴1与2间隔5mm.。

(3)包被后的硝酸纤维素膜过夜晾干。 3.4.2封闭

(1) 按每100ml B102+900ml纯化水浸泡5张（折40板）膜计，将包被好的膜浸入封闭2小时；

(2)将膜取出沥干，过夜晾干，即制得硝酸纤维反应膜，存干燥盒转入中间站待验，待检合格后沿膜上密虚线标志线分切。 3.4.3 分切

按照膜面标志线分切，每张8板。记做生产中间体条组分S1。铝箔袋密封，室温存放。

二、反应体系的组成

2.1试剂条主要部分的组成成份

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表15 试剂条主要组成成分

序号 1 2 3 4 5 组成部分 样品垫 金标反应膜 主要成份 无纺布、玻璃纤维 无纺布，胶体金标记的抗HBs抗体B 硝酸纤维反应膜 硝酸纤维素膜，鼠抗HbsAg抗体A（T线）羊抗鼠IgG多克隆抗体（C线）吸收垫 衬板 吸水纸 PVC片 表16 乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法)组成及规格

编号 名称 数量 参数（规格） 01 检测条(或装入塑卡内） 1条

02 塑料滴管 1支 滴液量25±5ul/滴 03 硅胶干燥剂 1袋 0.5克/袋 04 铝箔袋 1个

2检测条组成及结构

2.1检测条由样品垫、胶体金膜、包被膜、吸收垫、塑料板等组成。 2.2结构示意图如下：

包 被 膜

1 2 3 5 1 - 样品垫 2 – 金标反应膜 3 –硝酸纤维反应膜 4 - 吸收垫 5 - 塑料板

加样 样品垫 胶体金膜 检测线T 质控线C 吸收垫 液体层析方向 检测线T 质控线C 4 第 17 页 共 23 页

三．被测样本的要求

样本收集后应尽快分离血清或血浆以避免溶血，检测时应尽量使用新鲜的样本。如不及时测定可在2-8℃冷藏 3 天。 1、待检样品中抗凝剂对检测结果的干扰 (1) 检测单独抗凝剂对HBsAg金标试剂条的干扰

分别取4份内质控参考品（每份包括N1、P4及不同浓度的最低检出限参考品），其中的1份为对照，另外3份中依次加入柠檬酸三钠6.2 mg/ml、EDTA1.5 mg/ml 、肝素 5mg/ml，用润和乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法)进行检测，测试结果如下：

表17 单独抗凝剂对HBsAg金标试剂条的干扰

不同干扰物 检测样本 N1 P4 HBsAg1ng/ml HBsAg2.5ng/ml HBsAg4ng/ml 对照 － ＋ － ＋ ＋ 柠檬酸三钠 6.2 mg/ml － ＋ － ＋ ＋ EDTA 1.5 mg/m － ＋ － ＋ ＋ 肝素 5mg/ml － ＋ － ＋ ＋ 试验结果表明，加入不同抗凝剂的样本检测结构和对照结果完全一致，同时测试后试纸的背景干净。

2、溶血、黄疸及血脂的样品对本试剂的检测结果的干扰

分别取4份内质控参考品（每份包括N1、P4及不同浓度的最低检出限参考品），其中的1份为对照，另外3份中依次加入血红素0.02mg/ml、甘油三酯 1.5mg/ml、血红蛋白4mg/ml，使用本公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法)进行检测。结果如下，

表18 溶血、黄疸及血脂的样品对本试剂的检测结果的干扰

不同干扰物 检测样本 N1 P4 HBsAg1ng/ml HBsAg2.5ng/ml HBsAg4ng/ml 对照 － ＋ － ＋ ＋ 血红素0.02mg/ml － ＋ － ＋ ＋ 第 18 页 共 23 页

甘油三酯 1.5mg/m － ＋ － ＋ ＋ 血红蛋白4mg/ml － ＋ － ＋ ＋

实验结果表明，加入不同物质分别模拟溶血、黄疸及脂血，测试结果和对照完全一致。即在测试浓度水平，轻度、重度溶血、黄疸及脂血的样品对本试剂盒的检测结果基本没有干扰。但仍推荐使用清澈、无溶血及黄疸的血清或血浆样品进行检测。 3、纵上所述，该试剂对检测样本的要求有：

3.1样本采集前对受检者无特殊要求，不需禁食，按照常规的实验室程序收集血清/血浆样本。

3.2样本收集后应尽快分离血清/血浆以避免融血。严重溶血和乳糜样本不能用于检测，以免引起误判；已经进行加热处理的样本及已被微生物污染的样本不能用于检测。 3.3血清样本应收集在不含任何抗凝剂的试管中，血浆样本应收集于含有正常使用量柠檬酸钠、肝素、EDTA等抗凝剂的容器中。如果需要，样本中可加入0.1%叠氮钠作为防腐剂。

3.4样本收集后应尽快检测，不能将样本在室温放置太长的时间。如果收集的当天不使用，应当冷藏2-8℃保存，超过7天应当冷冻于-20 ℃保存。应尽量避免反复冻融，使用前不得超过2-3次。

3.5检测前应将样本恢复至室温，冷冻的样本应等完全融化后方可使用。

四．试剂用量

1、样本量

因为本试条的加样方法为直接将有箭头标志线一端插入装有血清样本的容器，要求深度不可超过标志线，所以插入的深度与插入后的吸附时间均对吸附的样本量有关系。在这里主要讨论插入的深度，以样本在试条上的移行速度、背景的干净纯度和是否能观察反应为依据进行以下不同反应时间的比较试验。

在这里只讨论插入的深度距标志线低于10mm大于5mm，因为只要能够满足上述深度的最佳吸附试剂，就一定能够满足插入的深度距标志线小于5mm，不超过标志线的情况。

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表19 样品吸附时间的确定

时间 2秒 5秒 8秒 11秒 14秒 移行速度 很慢 慢 较慢 快 快 30min反应结果 有红色，不清晰、集中，不能观察反应 略有红色，不清晰、集中，基本能观察反应 背景干净，色带清晰，略有不集中，基本能观察反应 背景干净，色带清晰、集中，能正常观察反应 背景干净，色带清晰、集中，能正常观察反应 试验结果表明，待检样品吸附时间过短，样品在测试条上的迁移速度慢，不能在规定时间内观察反应结果，且影响检测的灵敏度，容易造成弱阳性样本的漏检；待检样品加样量过多，试剂条显色条带易扩散，且容易出现假阳性条带。

持试条将有箭头标志线一端插入样本收集容器中，确保样本液面直到标记线且浸没时间应大于10～15秒(注：深度不可超过标志线横线)，然后取出平放或粘切在测试卡 (可用记录纸代替)开始计时观察测试结果。

五．体系的反应条件

1、反应时间

为确定反应结果的最佳观察时间，需要考虑膜条褪白情况，用最低检出限参考品进行检测确认，结果如下

表20 最低检测线样本观察结果

反应时间(min) 检测样本 1ng/ml 2.5ng/ml 4ng/ml 2 / / / 5 / / / 7 / / / 10 － － － 15 － － ＋ 20 － － ＋ 30 － ＋ ＋ 60 － － ＋ 从上述结果可以看出，当时间小于10分钟时，不能正确观察结果；大于10分钟时，膜面完全褪白，15分钟时，3ng/ml显阳性，30分钟时2.5ng/ml显阳性，60分钟时，由于膜面变干等原因，2.5ng/ml显阴性。

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表21 反应时间的膜面褪白时间确定试验

反应时间 1 min 2 min 5min 10 min 15min 20min 30 min 60 min 反应结果 样品将测试条观察部分整个浸湿，质控线隐约可见，背景为微红色 质控线已经比较清楚，检测线隐约可见，背景为微红色 质控线、检测线均已经比较清楚，微红色背景逐渐褪去 质控线、检测线均已经比较清楚，观察部分背景基本干净 质控线、检测线清晰、集中，观察部分背景基本干净 质控线、检测线清晰、集中，观察部分背景干净 质控线、检测线清晰、集中，观察部分背景干净 质控线、检测线颜色变深，条带略有扩散，观察部分背景干净 上述试验结果，对待检样品反应结果的观察以质控线、检测线的清晰与集中程度，以及背景的干净程度判断，最佳目测判断结果的时间应在10－30分钟读取，30分钟后条带颜色和集中程度开始变化。强阳性标本可以在2分钟显色，弱阳性样本会在10～30分钟显色，为了判断结果的准确和一致，结果判定以30分钟内为准。

2环境变化对检测结果影响 (1)温度

为确定最适反应温度，用最低检出限参考品按照不同实验温度2－8℃、16℃、25℃、30℃、37℃、45℃下进行检测，持试条将有箭头标志线一端插入装有血清标本的容器10秒钟，然后取出平放30分钟观察结果。主要考察测试条灵敏度和特异性，其次考察条带的集中和清晰程度以及样品的移行速度。

试验结果表明，2－8℃显色条带变浅，显色条带集中，但是灵敏度和样品的移行速度略有降低；37℃以上试验样品的移行速度加快，显色条带略有扩散，颜色略有变深；相反16℃、25℃、30℃的试验均正常。

因此，我们选择最佳的实验温度为15－30℃。 (2)湿度

为确定最适反应湿度，用最低检出限参考品进行不同湿度的对照20%、40%、60%、80%下进行测定。主要考察测试条的移行速度，其次考察条带的集中和清晰程度。

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试验结果表明，随着湿度的升高，试条的移行速度变慢。但是20%试条显色条带的不整体，略有扩散和变深；80%的显色条带略有变浅；40%、60%反应体系很正常，显色条带清晰、集中。因此，我们选择最佳的试验环境湿度为30%－70%。

六．体系的有效性确定方法(校准、质控方法)

1、内控标准

本公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法)有一个内在的质控指标，即对照线作为内在的过程控制。如果操作过程正常，样品体积足量、样品和测试试剂在硝酸纤维素膜层析正常、以及待测样本、对照线和胶体金标记具有活性，一条直观的有色条带总在对照线区域出现。

另外，如果试剂的有效、装置工作正常，结果观察窗口的背景将变白，同时提供一个直观的结果。这将被看作为一个内在的过程控制。

如果对照线区域不能出现有色条带，将测试无效，应当重新进行测试。应当联系供应商进行咨询。 2、外控标准

本试剂不提供对照标准品。推荐用户定期使用外控标准对产品的性能进行确认，如果和预期的结果不符，应当停止使用该产品，同时联系供应商。

对于怎样取得对照样本等，可以和生产商进行联系，也可以按照测试实验室建立的标准、国家标准、行业标准等建立。

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附图1乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法)流程图

(1)鼠抗HBsAg单克隆抗体A IgG多克隆抗体 (2)羊抗鼠配 液 试剂 硝酸纤 维膜 辅料 内包装材料 外包装材料

包 被 胶体金溶液制备 鼠抗HBsAg单克隆抗体B 封 闭 金标抗体制备 干 燥 涂布、干燥 无纺布 硝酸纤维反应膜 金标抗体反应膜 组装、切条 中间体条 内包装 单人份条 外包装 入库 物料 工序 检验 入库 中间站 关键工序 特殊工序 第 23 页 共 23 页

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/y7ap.html