WB操作-郭子龙

鉴于实验技术方法的改进以及试剂商品化程度的提高，本操作指南中的部分内容目前仅作参考学习，在实际实验过程中可能不会用到。 一、实验原理

在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。

二、蛋白样品制备（根据样品及检测要求选适当提取方法，蛋白样品制备是WB的第一步，更是决定WB成败的关键步骤。） 1. 样品与试剂 组织(Storage: -80℃)；

RIPA裂解液(强) (谷歌生物；beyotime:P0013B Storage: -20℃，一年有效。大瓶装买回来后及时用10ml EP管分装，尽量避免过多的反复冻融。在分装的Ep管上标明分装当日日期，每使用一支要在EP管上做个标记，用完一支再启封新的。如果不嫌麻烦，初次分装RIPA裂解液时分装于10ml Ep管中，用于组织裂解；用于上样蛋白配制的分装一部分于1.5ml Ep管中。

PMSF (谷歌生物；Solarbio: Cat.No.P0100 Lot.No.20150716 Storage: -20℃。100mM)

10×SDS样品缓冲液

量取下列试剂，置于10ml塑料离心管中 1M Tris-Hcl，PH6.8 2.5ml SDS 0.5g BPB 50mg 甘油 5ml 加去离子水溶解后定容至10ml。 小份（500μl/份）分装后，于室温保存。

使用前将50μl的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。 2. 仪器与耗材

组织蛋白：玻璃匀浆器；手术剪；冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；

10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。

细胞蛋白：冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。 3. 试验步骤 A. 提取组织蛋白 1) 台式离心机提前4℃预冷。

冰上预冷PBS，

冰上解冻RIPA裂解液（150-250ul裂解液/20mg组织）和PMSF 需要冰上预冷几个EP管或离心管？

2) 手术切除的组织块迅速置于预冷的PBS中，洗去表面的血迹，将组织称量后

切成几个较小的组织块（0.1-1g），置于组织匀浆器中。

注意：组织不要剪太碎，一整块更容易匀浆。如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过振荡器强烈vortex使样品裂解充分。

3) 根据所需的量解冻RIPA裂解液，混匀，PMSF:RIPA=1:100，使PMSF的最

终浓度为1mM，现配现用。（裂解液有毒）

4) 按照每20mg组织加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充

分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。）

5) 用玻璃匀浆器匀浆5-20min直到组织充分破碎，然后冰上放置10-20min后，

再匀浆5-20min，将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。

注意：如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过振荡器强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续试验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如匀浆器裂解充分。

6) 充分裂解后，10000-14000g4℃离心5min，取上清，-80℃冻存，避免反复冻

融。（如需马上使用可以放于4℃或，-20℃可存放2-3月。

7) 蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓

度。（注意：由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford

法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。)

样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，常用蛋白浓度为3ug/ul。（注意：上样量一致跑出来的条带颜值高）

B. 提取细胞蛋白（以六孔板培养的细胞为例） 1) 台式离心机提前4℃预冷。

冰上预冷PBS，

冰上解冻RIPA裂解液（150-250ul裂解液/20mg组织）和PMSF 需要冰上预冷几个EP管或离心管？

2) 将冰提前堆砌成一定坡度形状，细胞培养板斜置于冰上，用移液枪吸取六孔

板中原培养基上清弃置，若需收集上清则用移液枪吸取大部分细胞培养基到相应EP管，3000rpm, 5min去除死细胞。（原则上要换tip头，相同细胞不换的话要打干净，且按照从低浓度到高浓度孔使用。）

3) 用塑料吸管加预冷PBS到孔板中，盖上盖子摇晃轻柔冲洗2-3遍，用移液枪

吸净残留PBS弃置。

4) 根据所需的量解冻RIPA裂解液，混匀，PMSF:RIPA=1:100，使PMSF的最

终浓度为1mM，现配现用。（裂解液有毒）

5) 快速加入RIPA蛋白裂解液（样品处理前3-5分钟加入PMSF至终浓度1mM

混匀）120μl（视细胞数目而定，细胞少每孔可加100μl，最多不超过150μl）。加完后缓慢摇晃细胞板。

6) 用细胞刮刮板，用200ml量程的移液枪吹打，吸取移至全新EP管中，

12000rpm×5min离心，取120μl上清计量，余下的约5μl测浓度。 7) 准备沸水

8) 将已计量上清与5×上样缓冲液按4:1充分混匀，煮沸10min后取出，室温

冷却后1000rpm瞬离30s， -20℃待用。

可以自己配置10×上样缓冲液，用于样品蛋白浓度过低，迫切需要扩大上样样品体积、缩减上样缓冲液体积的状况。请查找，附在相应的试剂配制处。 4. 注意事项

1) RPIA裂解液的配方很多，关于裂解液的选择，一方面可以参考碧云天的相

关网页选择合适的裂解液；另一方面也需要通过一些预试验来摸索最佳的裂解液。

2) 用RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测

定试剂盒（P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S）测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

3) RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属于正常现象。

该透明胶状物质为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续试验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，就可以检测到这些转录因子。

4) 离心力与转速需要换算。

5) 尽可能提取完全或降低样本复杂度，只集中于提取目的蛋白（通过采用不同

提取方法或选择不同的试剂盒产品）；

6) 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH、盐浓度、表面活性剂、还原剂

等的选择）；

7) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，低温操作，所有步骤冰上进

行，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂；

8) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策

略）；

9) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

三、制胶

1. 相关试剂的配制：（相关试剂已全部实现商品化） 1) 10%的SDS（戴口罩称取）：

称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。4℃保存，如在长期保存中出现沉淀，可在30℃温水浴融化后仍可使用。 2) 1.5M Tris/HCL（pH8.8）

Trisbase 18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，4℃下保存。 3) 0.5M Tris/HCL（pH6.8）

Trisbase 6.06g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至6.8，最后定容至100ml，4℃下保存。

4) 30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亚甲丙烯酰胺

丙烯酰胺（Acr） 甲叉双丙烯酰胺

75g 2g

加双蒸水150ml，37℃加热溶解后，定容至250ml，查证该溶液pH应不大于7.0，4℃棕色瓶保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

???丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 5) 10%AP溶液

过硫酸铵 0.1g 双蒸水 1ml

配好后4℃保存，一个星期内有效。 2. 制胶

1) 取长短玻璃板，提前充分洗净后干燥箱中烘干。注意不要用清洁球之类的粗

糙物品清洗玻璃板，可用洗洁精泡约2h，用自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗干净，置于架子上晾干或干燥箱中烘干；

2) 试剂提前从冰箱拿出平衡恢复到室温，否则凝胶过程产生的热量会使低温时

溶解于储存液中的气体析出而导致气泡；

3) 将长短玻璃板对齐后嵌入玻璃板槽中固定，后将固定好的玻璃板槽置于制胶

架密封垫上，固定玻璃板槽，防止漏液。短板朝外，密封垫下滤纸的高度要合适，刚好齐平下面的凹槽最好。一般漏胶是因为长短板没有对齐，而不是因为下面垫的高度。

分离胶15% 分离胶12% 分离胶10% 分离胶8% 浓缩胶5%

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