《分子生物学》实验指导书
更新时间:2024-03-28 19:24:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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《分子生物学》实验指导书
实验学时:32学时 适用专业:生物科学、生物技术
实验目录
实验一 质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定…………..…..1 实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段………………..….3 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化…4 实验四 植物基因组DNA提取及电泳………………………6 实验五植物基因组RNA提取及电泳……………7
实验一 质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定
实验项目类型:综合性 一、实验目的
1. 学习质粒的相关基本知识,掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。 2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 ,并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。 二、实验原理
碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。在pH12-12.5时,线性DNA被彻底变性,但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂,但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时,溶液恢复中性,质粒DNA迅速复性,染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕,不能复性,从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。 三、实验仪器与材料
1. 材料:含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。 2. 溶液或试剂:LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II(0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合)、溶液Ⅲ、分离液:酚/氯仿/异戊醇=25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具:微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、 涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
1
四、操作步骤
质粒DNA的提取步骤:
1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上,保存菌种,并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。
2. 将1.5 ml菌液倒入EP管中,7,000 rpm离心2 min。
3. 去掉上清液,沉淀悬于100 μl Solution I 中,室温放置10 min。 4. 加入200 μl Solution II, 混匀,冰浴5 min。
5. 加入150 μl Solution III(冰上预冷), 混匀,冰浴5 min。 6. 12,000 rpm离心10min,将上清转至另一离心管中。
7. 向上清中加入等体积氯仿(去蛋白),反复混匀,12,000 rpm离心5min,将上清转移到另一个离心管中。
8. 向上清液中加入预冷的2体积无水乙醇,混匀后,室温放置5~10min。12,000 rpm离心5min,倒去上清,把离心管倒扣在吸收纸上,吸干液体。
9. 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,倒去上清,空气中干燥。 10. 加20μl TE缓冲液, 使DNA完全溶解,-20℃保存。
11.电泳检测质粒,在10 μl反应体系中加入8μl质粒DNA,2 μl 10×Loading Buffer, 1%琼脂糖电泳 (5V/cm) 检测。
酶切: 配制如下体系,37℃酶切质粒3 h后,电泳检测酶切结果。 10×K 1μL 质粒DNA 1μL EcoRⅠ/BamHⅠ1μL 无菌水 7μL 五、实验报告
绘出质粒DNA电泳图、酶切电泳图 六、思考题
酶液中甘油的用途是什么?
实验二 聚合酶链式反应扩增DNA片段
一、实验目的
通过实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。 三、实验仪器与材料
1. 材料: 0.2mlPCR管、离心管架、EB、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂:DNA模板、种dNTP、物1、引物2、Taq酶、DNA相对分子质量标准物等。
2
3. 其他用具:微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高压蒸汽灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、制冰机、PCR仪等。
四、操作步骤
1. 在0.2ml RCR管内配制25ul反应体系:
质粒DNA 1μl 10×buffer 2.5 μl MgCI2 1.5μl dNTP 2μl 引物1 1μl 引物2 1μl Taq酶1μl 无菌水15μl。 2. 在下列条件下进行扩大增 (1) 94℃变性3min (2) 94℃变性30S (3) 55 ℃退火30S (4) 72 ℃延伸30S (5) 重复2-4共25次 (6) 72 ℃延伸10min
3. 扩增后,电泳检测PCR结果 五、实验报告 绘出PCR电泳图 六、思考题
PCR的原理是什么?
实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化
一、实验目的
1. 学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
2. 学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。
二、实验原理
将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中,使细胞膨胀,同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构,使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域,这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态;此时加入DNA,Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物,并粘附在细菌细胞膜的外表面上;经短暂的42℃热脉冲处理后,细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,随之出现许多间隙,致使通透性增加,DNA分子便趁机进入细胞内。 三、实验仪器与材料
1. 材料: 0.2mlPCR管、离心管架、EB、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂:DNA模板、种dNTP、物1、引物2、Taq酶、DNA相对分子质量标准物等。
3. 其他用具:微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高压蒸汽灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、制冰机、PCR仪等。
四、操作步骤
1. 从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中,37度振荡培养过夜。
2. 取0.5ml菌液转接到一个含有50mL LB 液体培养基锥形瓶中,37度振荡培养2-3小时。
3
3. 将菌液转移到1.5 mLEP 中,冰上放置10min。 4. 离心10min(4000r/min),回收细胞。
5. 倒出培养液,将管倒置1min,使培养液流尽。
6.用冰冷的0.1mol/LCaCl2 300μL悬浮沉淀,立即放在冰上保温30 Min。 7.离心10min(4000r/min),回收细胞。
8. 用冰冷的0.1mol/LCaCl2 50μL悬浮细胞(放在冰上)。
9. 取50μL新配制的感受态细胞,加入质粒DNA 2μL混匀,冰上放置30Min。
同时做两个对照:
受体菌对照:50μL感受态细胞+2μL无菌水
质粒对照:50μL0.1mol/LCaCl2溶液+2μL质粒DNA 10. 将管放到42度循环水浴1-2min。 11. 冰浴2min。
12. 每管加200μL LB 液体培养基,37度培养45min。 13. 将250μL转化的感受态细胞涂布在含氨苄青霉素(100μg/mL)的培养皿中。
14. 倒置平皿37度培养12~16H,出现菌落。 五、实验报告
绘出质粒DNA分子转化结果图 六、思考题
1. 感受态细胞的制备原理?
2.
影响转化率的因素有哪些?
实验四 植物基因组DNA提取及电泳
一、实验目的
1.熟悉常用仪器。
2.学习、掌握植物基因组DNA提取原理、方法和DNA质量检测技术。 二、实验原理
用液氮研磨植物组织,从而破碎细胞;细胞提取液中的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并使蛋白质变性沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚和氯仿抽提的方法去除蛋白质,得到的DNA溶液用乙醇沉淀。 三、实验仪器与材料
1. 材料: Tris,EDTA,KCl,SDS,NaCl,EB,酚,氯仿,异丙醇,β巯基乙醇,乙醇,琼脂糖,50ml离心管,研钵、研杵,吸头,液氮,一次性手套,棉手套等。
2. 溶液或试剂:细胞提取液,5 mol/L KCl,TE等。
3. 其他用具:微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高低温离心机,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,凝胶成像系统,恒温金属浴等。
四、操作步骤
1. 取2g新鲜菠菜叶片,在液氮中研磨成粉末状(越细越好)。将粉末移到50 ml离心管中。
2. 加入16 mL细胞提取液,充分混匀,65℃水浴保温20min。
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3. 从水浴锅中取出离心管,加入5 mL 5 mol/L的KCl溶液,混匀水浴20min。 4. 4000rpm/min离心20 min。(以上每小组做一管,以下步骤中每人做一小管)
5. 将上清液转移到1.5 mL的离心管中。
6. 加入等体积酚/氯仿混匀,12000 r/min离心5 min,取上清。 7. 加入等体积氯仿混匀,12000 r/min离心5 min,取上清。 8. 加入0.6-1倍体积的异丙醇(沉淀DNA),混匀。
9. 离心,去上清,获得沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀3次,风干沉淀。 10. 加入500 uL TE缓冲液,溶解DNA。
11. 取3 uL 上清液,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA。 五、实验报告
绘出琼脂糖凝胶电泳检测DNA图
六、思考题
1. SDS、液氮、异丙醇、氯仿等分别有什么作用?
实验五 植物RNA的提取及电泳
一、实验目的
1. 学习植物总RNA的提取方法和RNA的琼脂糖凝胶检测。 2. 掌握RNA提取原理、方法和RNA质量检测技术。
二、实验原理
用液氮研磨植物组织,高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质、破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNA酶。细胞裂解后,DNA、蛋白质和细胞碎片等可通过酚、氯仿等去除,得到总RNA。 三、实验仪器与材料
1. 材料: DEPC,NaAc,LiCl,MOPS,EDTA,异硫氰酸胍,氯仿,酚,乙醇,琼脂糖,50ml离心管,研钵、研杵,吸头,液氮,一次性手套,棉手套,甲醛等。
2. 溶液或试剂:4mol/L异硫氰酸胍;2mol/L NaAc(pH4.8);4mol/L LiCl;3mol/L NaAc(pH5.0);以上溶液用DEPC处理过的水配制。0.1% DEPC水;5×电泳缓冲液;变性琼脂糖凝等。
3. 其他用具:低温离心机,台式离心机,琼脂糖凝胶电泳系统,凝胶成像系统,制冰机,水浴锅,灭菌锅等。
四、操作步骤
1. 取2g新鲜菠菜叶片,在液氮中研磨成粉末状,将粉末移到50 ml离心管中。
2. 依次加入以下溶液,混匀: 异硫氰酸胍溶液 4 mL 苯酚 3mL NaAc(pH4.8) 0.3mL 氯仿 0.6 mL
3. 冰浴30min后,8000rpm离心13 min。(以上每小组做一管,以下步骤中每人做一小管)
4. 弃沉淀,将上清液400 uL转移到1.5 mL的离心管中。 5. 加入2倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h。 6. 4℃,8000 r/min离心13 min,弃上清。
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7. 在沉淀中加入1mL LiCl溶液,使溶解,冰浴2h。 8. 13000 r/min离心15 min,弃上清。
9. 在沉淀中加入400 uL DEPC-H2O,再加入400 uL氯仿,混匀(去蛋白)。 10. 13000 r/min离心6 min,取上清,加入0.1倍体积NaAc(pH5.0),2倍体积无水乙醇,-20℃放置0.5h。
11. 13000 r/min离心13 min,弃上清。
12. 将沉淀RNA 用70%乙醇洗涤3次,风干沉淀。 13. 加入100 uL DEPC水溶解RNA。 14. 用琼脂糖凝胶电泳检测RNA。 五、实验报告
绘出琼脂糖凝胶电泳检测RNA图 六、思考题
1. 异硫氰酸胍、LiCl和DEPC等分别有什么作用?
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7. 在沉淀中加入1mL LiCl溶液,使溶解,冰浴2h。 8. 13000 r/min离心15 min,弃上清。
9. 在沉淀中加入400 uL DEPC-H2O,再加入400 uL氯仿,混匀(去蛋白)。 10. 13000 r/min离心6 min,取上清,加入0.1倍体积NaAc(pH5.0),2倍体积无水乙醇,-20℃放置0.5h。
11. 13000 r/min离心13 min,弃上清。
12. 将沉淀RNA 用70%乙醇洗涤3次,风干沉淀。 13. 加入100 uL DEPC水溶解RNA。 14. 用琼脂糖凝胶电泳检测RNA。 五、实验报告
绘出琼脂糖凝胶电泳检测RNA图 六、思考题
1. 异硫氰酸胍、LiCl和DEPC等分别有什么作用?
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