circRNA

环状RNA:非编码RNA中的一颗明星

摘要：circRNAs是一种共价闭合环状RNA,高频率出现于真核生物转录本中。最近在哺乳动物细胞中发现了成千中内源的circRNAs。circRNAs由内含子或外显子序列产生，，反向重复序列和RBPs对于circRNAs的形成是必要的。绝大多数circRNAs在不同物种间具有保守性、稳定性，对RNas P具有抗性，常表现组织或发育阶段表达特异性。最近研究已经表明circRNAs可以以miRNA 海绵发挥作用，调控剪切或转录及亲本基因的表达。已有研究证明circRNAs在 动脉粥样硬化血管疾病、神经紊乱、玩病毒感染疾病和癌症中具有重要作用，在直肠癌和胰腺管恶性肿瘤中异常表达，这暗示circRNAs可以作为预测或检测某些疾病的生物标记分子。与miRNA和lncRNA相似，circRNAs已经成为RNA研究领域的一大热点，广泛参与到生命的各个反应中。本人简要介绍了一下circRNAs的形成机制、性质、功能以及它们在疾病中的重要意义。 关键词：环状RNA;选择性环化;MicroRNA 海绵;基因表达调控;生物标记

Circular RNA: A new star of noncoding RNAs

Chunlai Yu

Abstract: Circular RNAs (circRNAs) , unlike linear RNAs, are a covalently closed continuous loop and are highly represented in the eukaryotic transcriptome. Recent studies have discovered thousands of endogenous circRNAs in mammalian cells. CircRNAs are largely generated from exonic or intronic sequences, and reverse complementary sequences or RNA-binding proteins (RBPs) are necessary for circRNA biogenesis. The majority of circRNAs are conserved across species, are stable and resistant to RNase R, and often exhibit tissue/developmental-stage-specifc expression. Recent research has revealed that circRNAs can function as microRNA (miRNA) sponges, regulators of splicing and transcription,and modifiers of parental gene expression. Emerging evidence indicates that circRNAs might play important roles in atherosclerotic vascular disease risk, neurological disorders, prion diseases and cancer; exhibit aberrant expression in colorectal cancer (CRC) and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC); and serve as diagnostic or predictive biomarkers of some diseases. Similar to miRNAs and long noncoding RNAs (lncRNAs), circRNAs are becoming a new research hotspot in the field of RNA and are widely involved in the processes of life. Herein, we review the formation and properties of circRNAs, their functions, and their potential significance in disease.

Keywords: Circular RNA; Alternative circularization; MicroRNA sponge; Gene expression regulation; Biomarker

引言

环状RNA(circRNAs)是最近才发现的一种新型的内源性的非编码RNA(ncRNA)，是最近的RNA研究的一大热点。与线性RNA不同，circRNAs没有5′帽子及3′尾巴，无5′-3′极性及多聚腺嘌呤尾，对核酸酶具有抗性，而是一种稳定的共价闭合环状结构。

1970年代就在RNA病毒中发现了circRNAs，但此后近三十年中只有发现了少数circRNAs。曾经一度认为这类RNA是低表达的异常RNA剪切产物或意外产物，但随着RNA深度测序技术和生物信息生物学的发展，最近发现在哺乳动物细胞中存在一大类群具有保守稳定性的内源性circRNAs，而且，R. Ashwal-Fluss、Q. Vicens、S.J. ConnR.A. Dubin等人发现IRAlus和外显子跳跃等反向互补序列及RNA结合蛋白对于circRNAs的形成具有重要调控作用。

近年的研究发现，circRNAs可以拥有miRNA海绵的作用，参与调控选择性剪切，调节父本基因的表达，也可能在动脉粥样硬化的血管疾病、神经失调、玩病毒疾病和癌症发挥作用，并有可能成为检测一些结肠直肠癌、胰管恶性肿瘤、胃癌等疾病的生物标记分子。这些发现表明circRNAs在生物发育、疾病的起始和发展具有重要调控作用，将成为临床诊断和预防的标记，为疾病的治疗带来新的曙光。

本文简单介绍了miRNA的种类、形成、特点，讲述了其潜在功能及与一些疾病的关系。

1.miRNA的种类

miRNA表达水平很低，一度认为是由剪接体介导的剪切错误的副产物，或是介导内含子套索结构降解逃逸。因此，极少关注miRNA，且不认为在生物学过程中具有重要作用。2010年前，几乎无新miRNA被发现，miRNA起源研究进展极小。由于高通量深度测序和计算机分析的快速发展，从古生菌到人类跨物种的几千中circRNA被发现，更有甚者，一些基因的circRNA的转录量至少是其线性转录本的10。下表表1是最近在人中发现的circRNA，图1是人和线虫不同细胞中发现的circRNA的种类。

表1 近年来在人中鉴定到的circRNA

[1]

图1 在人和线虫不同细胞中发现的circRNA

[2]

2. circRNA的生物起源

最近的一些研究揭示，与普通的线性RNA剪切形成不同，circRNA是由套索嵌接剪切形成。而且，最近取得了一些关于套索剪切和线性剪切的竞争性调控的新进展。Jeck et al.提出了两个circRNA形成的模型。模型1名为套索驱动的环化或外显子跳跃(图2 a)，模型2为内含子驱动的环化或直接后剪切(图2 b)。Kelly和他的同事也发现外显子环化广泛存

在，且与TNFα或GFβ处理过的人脐静脉内皮细胞的外显子跳跃有关。尽管有证据显示内含子配对介导的环化可能比套索驱动的环化发生频率更多，已有证据证明内含子配对驱动的环化模型，并表明IRAlus等反向互补序列对于circRNA的形成很重要。很快，在人细胞就发现一类新由内含子产生的circRNA，将其称为环内含子RNA(ciRNAs)。ciRNAs的形成依赖于包含在5′剪切位点附近7-nt GU-rich元件和在分支位点的11-nt C-rich的元件的一

[4]

致性基序(图2 c)。最近也发现外显子可以与滞留在外显子间的内含子发生环化，将这类

[5]

circRNA称为外显子-内含子circRNA或则EIciRNAs，并发现它们可随其侧翼互补序列过表达。但是EIciRNAs的形成机制目前并不清楚，这也说明了人类转录组的复杂性。

另外，研究者已经发现盲肌蛋白可以结合到circMbl的侧翼内含子上，作为RNA结合蛋白将两侧的内含子连接拉近，引起circRNAs的形成。有研究者报道了另外一种circRNAs形成的机制，RNA结合蛋白（RBPs）作为连接两侧内含子的桥梁，使得剪切供体和受体靠近从而促使circRNAs的形成(图2 d)。如RBP Quaking (QKI)就调控circRNA的形成，RNA编辑酶ADAR1可以结合到双链RNA上，通过消除茎环结构来抑制circRNA的形成。这表明在一些条件下，RBPs可以作为抑制或激活circRNA的形成。

[6]

提出了与选择剪切相似的选择环化模型(图3) 。在单侧内或两侧内含子中的互补序列引起的竞争性RNA配对，对选择剪切和外显子的环化具有重要影响。在单侧内含子的互补序列可足够促进线性mRNA的形成，相反，在两侧的互补序列则有利于外显子的环化。反向互补序列之间的竞争性可使一个基因加工得到引起多种circRNA转录本(Fig. 2)。但是，由于在物种间互补序列分布的不同，选择性环化具有物种特异性，且互补序列的存在对于外显子的环化是必要非充分条件。这一模型表明，选择性环化的机制是很复杂的，且有可能受其他因子调控，如RBPs。

[3]

图2 circRNA发生模型

图3 选择性环化模型

3. circRNAs的性质

根据最近的研究表明，后剪切产生的circRNAs有几项值得注意的性质。首先，这些circRNAs为共价闭合环状结构，无5′–3′极性和多聚腺嘌呤尾巴，这也使得它们比线性RNA更加稳定，不易受RNA外核酸酶或RNase R影响，如在从健康人体无细胞的唾液坚定到的大于400 circRNAs。这些结果对circRNAs在任意的细胞液中都存在给出了实验证据。第二，circRNAs种类繁多，在一些案例中，circRNAs分子的丰度是对应线性RNAs的十倍多。第三，circRNAs大多由外显子组成，主要存在于细胞质，可能包含miRNA反应元件。而且， circRNAs可有效地避免所预测miRNA靶位点多态性减少。一些由滞留在外显子间的内含子和内含子或外显子组成的circRNAs，主要存在于主真核生物的细胞核中，可能调控基因的表达。第四，circRNAs经常表现组织或发育阶段特异性。比如hsa_circRNA_2149在CD19+细胞可以检测到，在CD34+细胞neutrophil及HEK293细胞中未检测到。一些线虫的circRNAs在卵巢表达但在1- or 2细胞胚胎中不表达。第五，大量的circRNAs是内源的哦非编码RNAs，只要一部分是外源circRNAs被翻译，如Hepatitis δ (HDV)和有IRESs的设计的circRNAs。第六，circRNAs在不同物种间具有进化保守性，但是，一些circRNAs并不完全具有进化保守性。总而言之，这些性质表明，circRNAs在转录和转录后水平具可能有重要潜在作用，在疾病诊断可作为理想的生物标记分子。

4. CircRNA的功能

4.1 CircRNA具有竞争性内源性RNAs 或miRNAs功能

竞争性内源性RNAs(ceRNAs)含有共享的MREs，比如mRNAs、假基因和长非编码RNA (lncRNAs)，可以竞争性miRNA结合。因此ceRNAs的拥有与否会影响miRNA调控基因的活性。最近一系列证据表明，circRNAs可以miRNAs或有效的ceRNA分子起作用，可以减少microRNA结合位点的多态性。例如，外显子circRNAs ciRS-7/CDR1as（miR-7 ）/ CDR1的反义环状RNA）和Sry都可以结合到miRNA上（图4）[7]，并不发生降解，这说明其有极好的ceRNA活性。Hansen et al.发现小脑退化相关蛋白1(CDR1)基因可转录出一种天然反义环状抗小脑退化相关蛋白1转录本(CDR1as)，CDR1as可以和miRNA作用并被miR-671切割。miR-671的结合位点表现几乎完美的互补性，且在物种间极少变异。进一步的研究表明CDR1as有超过70个保守的miR-7互补的子片段，且与Argonaute紧密相结合，而子匹配片段互补的限制性保护其结合miR-7后不被降解。CDR1as的沉默或miR-671的过表达都可引起miR-671

靶基因的表达下调，例如SNCA、GFR 和RS2，而R1as的过表达可防止miR-671靶基因的表达下调。而且，CDR1as在神经组织中更高的表达，在 缺失cdr1位点的斑马鱼胚胎中过表达，可显著降低中脑大小，减少miR-7缺失的导致的中脑形态学缺陷。相似的，鼠科性别决定区Y(Sry)是负责哺乳动物性别决定，并可产生一种子特异性的环状转录本，该单外显子circRNA有16个miR-138结合位点，circRNA Sry表达载体和pJEBB-138共感染的HEK293 cells中，可与Argonaute 2 (AGO2)共沉淀。

但是，circleSeq鉴定的一大群外显子circRNAs中，哺乳动物细胞中几乎没有超过十个同一miRNA的结合位点，许多只包含几个假定的miRNA结合位点。幸运的是，E3泛素化连接蛋白跨几个外显子形成的cir-ITCH，具有miR-7、miR-17和miR-214的作用。因此，环状miRNAs的存在是否是一种普遍现象，circRNAs、miRNAs 和ceRNAs网络如何维持细胞稳定性调控需要进一步研究。

图4 ciRS-7以miRNA海绵作用作用于miR-7

图5 ceRNA 调控网络

4.2 circRNAs调节选择性剪切或转录

此前已有有研究表明circRNAs参与选择性剪切或转录调控。circMbl由剪切因子MBL的第二个外显子产生，这与premRNA的剪切是相互竞争的。circMbl侧翼的内含子及circMbl有保守的MBL结合位点，可以与MBL紧密结合，MBL水平的改变显著影响circMbl的形成，

[8]

效应取决于侧翼内含子序列的MBL结合位点（图6）。这说明通用剪切因子，如MBL，可能对于选择性剪切具有重要作用，参与调控circRNA形成和传统剪切的平衡。显然，包含翻译起始位点的circRNA可发挥mRNA trap功能，产生一个非编码线性转录本，从而降低Fmn的表达水平。Jeck和Sharpless在人纤维原细胞中发现了大量包含翻译起始位点的单外显子

[9]

circRNAs（图7）。这些发现表明，circRNAs可以通过隔离翻译起始位点行使mRNA捕获器功能，来调控蛋白表达。

图6 circMBL调控 图7 发现的circRNA

4.3 circRNAs调控亲本基因的表达

最近的研究已经揭示circRNAs可以调控亲本基因的表达。比如，ciRNAs的形成依赖于侧翼RNA元件，这些元件可能对内含子套索结构逃逸降解是必须的。这些ciRNAs基本不含microRNA靶位点，这表明它们有不同作用。已有更详细的研究表明这些ciRNA在核仁中含量高，可与polymerase II (Pol II)机器作用，可以反式作用调节宿主的转录活性。在人细胞中新发现名为EIciRNAs的circRNAs与RNA Pol II相结合，比如circEIF3J 和circPAIP2就主要存在于核仁中，与U1 snRNPs相互作用，以反式作用增强父本基因的转录。cir-ITCH和ITCH的 3′- UTR共享一些miRNA结合位点。cir-ITCH 和miR-7、miR-17及miR-214相互作用可以增强ITCH的表达。

图8 三种circRNAs调控亲本基因的模型

4.4 circRNAs的其他功能

极好circRNAs可以被翻译。目前已经证明，在体外或体外，人工设计在蛋白的起始密码子上游插入IRES的circRNAs可以翻译。类似的，Perriman 和 Ares研究已经证明，在大肠杆菌中，含有GFP开放型阅读框的环状circRNAs可以直接表达GFP。这可能暗示circRNAs也可以作为翻译的模板，但就目前而言，在哺乳细胞中，只发现天然存在于HDV的circRNAs可以翻译出蛋白，未有证据证明有其他天然存在的circRNAs可以翻译蛋白，。有研究者推测circRNAs可能还有其他功能，如根据MBL 蛋白和circMb可紧密相互作用，可以参与RBP工厂装配或参与其异构，推测circRNAs具有RBP海绵作用。circRNAs还可以通过部分配对靶标于mRNA。但是对于这些功能还需要进一步的研究。

5. circRNAs与疾病

circRNAs可能成为检测一些疾病起始和发展的生物标记分子。比如，在HEK293 细胞过表达PrPC时，诱导ciRS-7/CDR1as而非 CDR1的表达。如例如CircMbl及侧翼内含子序列可以与MBL结合，MBL表达水平的异常将显著影响circMbl的形成，circMbl和mRNA的形成相互拮抗，MBL缺陷将导致一种严重的肌强直性营养不良退化疾病，故我们推测circMbl参与到肌强直性营养不良病症的起始和发展。

很明显，circRNA参与到几乎所有的细胞功能中。circRNA可以与miRNA作用从而调控其靶基因的调控，故其也可能与cmiRNA相关疾病有关。例如CDR1as就很可能与miR-7相关的疾病相关，已有研究表明发现CDR1as参与帕金森症、阿尔茨海默病、脑部发育疾病及癌症。在食管扁平上皮癌中，cir-ITCH比邻近组织表达下调，cir-ITCHmiR-7通过与 miR-17、 miR-214等作用介导Dvl2泛素化降解和原癌基因c-myc的下调，可能参与抗癌作用。而且，研究发现，circRNA在CRC组织中下调；hsa_circ_002059在胃癌中表达下调，可能成为检测胃癌的新生物标签；cANRIL与动脉粥样硬化血管疾病有关。

6. 总结 此前，一直认为circRNA是剪切错误的结果，由于高通量测序技术和生物信息学的发展，隐于众多ncRNAs的 circRNAs引起了许多科学家的关注，而且circRNAs日渐成为RNA研究中的热点。circRNAs数据库（http://www.circbase.org/）和Circ2Traits 相关circRNAs 疾病数据库(http://gyanxet-beta.com/circdb/)可以帮我们更好地研究circRNAs。circRNAs可以和许多miRNA作用，我们可以建立一个人工设计的circRNAs数据库。

circRNAs的功能和发生机制可能比目前的更加多种多样，参与到许多生物学过程，与许多疾病相关，有望成为一种新的检测和跟踪疾病的生物标记。但就目前的研究成果，主要集中于circRNAs的发生机制，对于已经发现和预测的许多circRNAs，其定位和降解过程，以及具体功能并不清楚，都需要进一步的研究。

参考文献

[1] Shibin Qu1, Xisheng Yang1, Xiaolei Li1, Jianlin Wang, Yuan Gao, Runze Shang, Wei Sun,Kefeng Dou, Haimin Li *.Circular RNA: A new star of noncoding RNAs. Cancer Letters, 2015,365 :141–148.

[2] Sebastian Memczak, Marvin Jens, Antigoni Elefsinioti, Marvin Jens, Antigoni Elefsinioti. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature, 2013, 495: 333–338

[3] W.R. Jeck, J.A. Sorrentino, K. Wang, M.K. Slevin, C.E. Burd, J. Liu, et al., CircularRNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats, RNA 19 (2013)141–157.

[4] Y. Zhang, X.O. Zhang, T. Chen, J.F. Xiang, Q.F. Yin, Y.H. Xing, et al., Circular introniclong noncoding RNAs, Mol. Cell 51 (2013) 792–806.

[5] Z. Li, C. Huang, C. Bao, L. Chen, M. Lin, X. Wang, et al., Exon-intron circular RNAsregulate transcription in the nucleus, Nat. Struct. Mol. Biol. 22 (2015) 256–264.

[6] X.O. Zhang, H.B. Wang, Y. Zhang, X. Lu, L.L. Chen, L. Yang, Complementarysequence-mediated exon circularization, Cell 159 (2014) 134–147.

[7] W.R. Jeck, N.E. Sharpless, Detecting and characterizing circular RNAs, Nat.Biotechnol. 32 (2014) 453–461.

[8] R. Ashwal-Fluss, M. Meyer, N.R. Pamudurti, A. Ivanov, O. Bartok, M. Hanan, et al.,circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing, Mol. Cell 56 (2014)55–66.

[9] C.W. Chao, D.C. Chan, A. Kuo, P. Leder, The mouse formin (Fmn) gene: abundantcircular RNA transcripts and gene-targeted deletion analysis, Mol. Med. 4 (1998)614–628.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/y4a.html