实验五 有关物质的色谱检查

实验课顺序：5

实验名称 实验班级 实验课时间 课分时数 组 实验五 有关物质的色谱检查 07级药学本科 4.30 4 10组 实验目的：

1、掌握HPLC法测定原料药中有关物质的原理与限量计算方法。 2、掌握TLC法测定原料药中有关物质的原理与测定方法。 3、熟悉高效液相色谱仪的工作原理和操作方法。 4、熟悉粘合薄层板的制备与活化。

5、了解高效液相色谱仪的主要部件和日常维护

实验原理： 实验器材：

试药：硅胶H，硅胶GF254，对二甲氨基苯甲醛，盐酸普鲁卡因注射液，马来酸氯苯那敏及氧氟沙星原料药。

仪器：高效液色谱仪，二极管阵列检测器，ODS 柱，层析缸，玻板，喷雾器，点样用微量注射器或微量吸管。

实验内容与方法：

（一）盐酸普鲁卡因注射液中对氨基苯甲酸检查

本品为盐酸普鲁卡因加氯化钠适量使成等渗的灭菌水溶液。为无色的澄明液体。 [检查] 对氨基苯甲酸 精密量取本品，加乙醇制成每1mL中含盐酸普鲁卡因2.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取对氨基苯甲酸对照品，加乙醇制成每1mL中含30μg的溶液，作为对

照品溶液。照薄层色谱法（附录A）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于含有羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇（14：1：1：4）为展开剂，展开后，取出晾干，用对二甲氨基苯甲醛溶液（2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100mL，加冰醋酸5mL制成）喷雾显色。供试品溶液如显与对照品溶液相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液的主斑点比较，不得更深。 （二）马来酸氯苯那敏有关物质检查

本品为N，N-二甲基-g（4-氯苯基）-2-吡啶丙胺顺丁烯二酸盐。

[检查] 有关物质 取本品，加氯仿制成每1mL中含50mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加氯仿稀释成每1mL中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录A）试验，吸取上述两种溶液各10mL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-稀醋酸（5：3：2）为展开剂，展开后，晾干，在紫外光灯（254nm）下检视。供试品溶液除显氯苯那敏与马来酸两个斑点外，如显其他杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。 （三）氧氟沙星有关物质的检查

本品为（±）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并恶嗪-6-羧酸。为白色或微黄色结晶性粉末。 [检查] 有关物质 照高效液相色谱法测定（附录B）。

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L枸橼酸溶液-乙腈（79：21）用三乙胺调节pH值至4.0为流动相；流速约为每分钟1.2mL；检测波长为293nm。理论板数按氧氟沙星峰计算应不低于2500。

测定法 取本品，加流动相制成每1mL中含1mg的溶液，作为供试品溶液；量取适量，加流

动相稀释成每1mL中含0.05mg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%；再取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液色谱图上各杂质峰面积的和不得大于对照溶液色谱图主峰面积的1/5。并用二极管阵列检测器检测样品峰的纯度。

实验注意事项：

1.薄层色谱分析中为使斑点集中，点样应分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干。

2.薄层板放入层析缸时，薄板底边应水平浸入展开剂中，待展开至溶剂前沿距玻板顶端2～3cm时，取出薄层板。

3.展开缸必须密封，为使缸内展开剂饱和，薄层板放入前可在层析缸内壁贴滤纸条，让滤纸条一端浸入展开剂中，密封层析缸，待系统平衡后再将薄层板放入，展开。 4.HPLC测定中流动相使用前必须经过滤膜过滤和超声脱气。

5.HPLC测定完毕后，必须用水冲洗系统30分钟以上，然后再用甲醇冲洗。更换流动相时必须先停泵，待压力降至零时，将滤头提出液面，置另一流动相溶液中。

实验报告：

实验结束后，书写实验报告。

实验指导要点:

1. 粘合薄层板的制备，根据玻板的大小，取一定量固定相，按比例加适量粘合剂（或水）研磨均匀，去除气泡，倒在玻板上，充分震荡，使成一均匀薄层。置水平位置晾干，110℃干燥30分钟，置干燥器内备用，注意保存时勿使薄层表面损伤。使用前检查表面光洁、均匀程度。

2. 点样斑点要集中，应分次点样，待前一滴干后再点第二滴，对照与样品应点在同一水平位置上，距底边2.0 cm，距薄层边约1.5cm。两斑点间距约1.5cm。

3. 展开剂量不宜太多，以不浸没样点为宜。展开距离为10～15 cm，使溶剂前沿距薄层顶边约2 cm。

4. TLC中杂质限量控制的几种方法与限量计算。 5. HPLC测定有关物质的几种方法和限量计算。

6. HPLC仪的主要部件及其作用原理和操作注意事项，包括：进样阀、定量环、平头微量注射器、注射进定量环的测定液量对重复性的影响，流动相处理（过滤、脱气）、高压泵的维护（使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用水冲洗系统30分钟以上，然后用甲醇冲洗，切忌用盐酸、硫酸、硝酸等强酸作为流动相成分，以免腐蚀不锈钢管路。检测器灵敏度、波长设置。

7. 选择1～2个实验内容进行实验

附录

A．薄层色谱法 1、仪器与材料:

(1)、玻板 用5cm×20cm或10cm×20cm的规格，要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

(2)、固定相 常用固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。其颗粒大小，一般要求直径为10~40 m。取各品种项下规定的固定相一定量，按\薄层板制备\方法制备薄层板。

(3)、薄层涂布，一般可分无黏合剂和含黏合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻板上，后者系在固定相中加入一定量的黏合剂，一般常用10%~15%煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃加热4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5%~0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。

(4)、展开室 应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，底部应平整光滑，便于观察。

2、操作方法:

(1)、薄层板制备 根据各品种项下规定，取1份固定相和3份水（或黏合剂）在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，用倾注法或平铺法或涂布器法，在玻板上 涂布成厚度为0.2~0.3mm的薄层板，将涂好薄层的玻板置水平台上，于室温下晾干后在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。

(2)、点样 用微量注射器或微量吸管吸取规定量样品溶液，点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径为2～4mm，点间距离约为1.5～2.0cm，点样时必须注意勿损伤薄层表面。

(3)、展开 展开缸如需预先用展开剂饱和，可在缸中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封缸顶的盖，使系统平衡。

将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封缸盖，待展开至规定距离（一般为10~15cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。

B．高效液相色谱法 1、色谱条件的一般要求:

色谱柱的填充剂和流动相的组分应按药品标准中的规定。柱温一般为室温，检测器为紫外吸收检测器，所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。各药品标准中规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体药品并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。

2、系统适用性试验（见实验二附录）

试验目的：用规定的对照品对仪器进行试验和调整，分析测试色谱柱的理论板数、分离度、重复性和拖尾因子，以达到规定的要求，保证分析的精确性。

测试内容与方法：

(1)、色谱柱的理论板数（n）:在选定的条件下，注入各品种项下规定的供试品溶液或内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间（tR）和半峰高宽（Wh/2），按n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于规定的

理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。

注意：测得的各项参数可以采用时间或长度计，但必须取相同单位。

(2)、分离度:要求被测物色谱峰与其他峰或内标峰之间的分离度应大于1.5或各品种项下规定的值。分离度（R）的计算公式如下：

式中tR1和tR2为相邻两峰的保留时间，W1及W2为此相邻两峰的峰宽，保留时间和峰宽可以采用时间或长度计，但两者必须取相同单位。

(3)、进样重复性:取对照溶液，连续进样5次，其峰面积测量值的相对标准偏差应小于2.0%。也可按校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应小于2.0%

(4)、拖尾因子 取对照溶液或样品溶液进样，记录色谱图，计算拖尾因子（T），要求T在0.95~1.05之间。

式中 W0.05h为0.05峰高处的峰宽；d1为峰极大至峰前沿之间的距离。

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