细胞图像分析处理系统的开发

2007届研究生硕士学位论文 学校代码：10269

学 号：51041300069

细胞图像分析处理系统的开发

院 系： 生命科学学院

专 业： 生物化学与分子生物学

研 究 方 向： 细胞生物学

指 导 教 师： 张 红 锋 副教授

硕士研究生： 刘 欢

2007年5月

Master’s Degree Thesis of University Code: 10269

2007 Grade Postgraduate Register Number: 51041300069

East China Normal University

The Development of Cell Image Analysis and

Processing System

Name： Supervisor：

Department：

Major：

Specialty：

May, 2007

Shanghai, China

学位论文独创性声明

本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。

作者签名：

日期：

学位论文使用授权声明

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学位论文作者签名： 导师签名：

日期：日期：

刘欢硕士学位论文答辩委员会成员名单

摘要

在生命科学研究中涉及到大量二维细胞图像的分析问题，包括如何处理、精确表达细胞图像中的有用信息，这已经成为众多学者共同致力的焦点。在过去，在显微镜下观察细胞，只能对细胞数量、长度等信息做大概的观察记录，而对于细胞面积、形状、灰度、复杂度等信息，很难作出精确的测量甚至无法测量，从而无法对实验结果作定量分析；同时，在一些实验中由于细胞或采样数量庞大，如果进行细胞计数和测量，将耗费大量的时间和人力，得到的实验结果很难避免人工处理带来的误差。这就要求一套比较健全的细胞图像处理软件对细胞图像数据进行处理，以提高实验的自动化程度，实现定量检测，确保测量精度，提高工作效率，降低实验成本。

本论文基于实验室现有研究需求，自行研发了细胞图像分析处理软件。具体研究工作包括以下几个部分：

1. 根据图像处理的运算性能要求及系统可扩展性，设计细胞图像处理系统主体结构框架，建立核心数据转换和储存模块，以及图像数据输入输出通用接口。

2. 构建细胞图像基本运算和图像操作模块，使软件具备基本的图像色彩转换、空间转换、缩放、旋转和移动功能，并建立通用ROI类工具，实现图像区域的自由选取和分析统计。

3. 构建细胞图像的增强模块，处理图像中对比度不足、目标图像亮度过低、边缘模糊、细节不够清晰等问题，改善细胞图像视觉效果，突出研究对象的特定信息。其中，通过灰度拉伸增大细胞对象与背景区域的对比；通过图像平滑去除图像噪声；使用灰度直方图实现对图像灰度的统计分析，并对图像灰度进行调整。通过图像增强实现细胞图像的线性灰度检测、灰度点阵和基于灰度分布的简单面积计算。

4. 构建细胞图像的数学形态学处理与细胞图像分割模块。针对实验室研究的细胞对象种类不一，大小形状各异，灰度各有差别的现状，提出了一种通用的面积测量方法。通过噪声去除、细胞边缘检测、Otsu法阈值分割、孔洞填充、迭代腐蚀、形状特征提取与种子填充法测量等一系列流程实现细胞面积的准确测量。

5. 构建细胞图像匹配模块，实现在复杂背景条件下对不同细胞图像的细胞计数。

6. 通过荧光细胞灰度测量、细胞测量、细胞计数等几种细胞实验对系统各方面性能进行了测试，以验证系统的可行性。

此外，本文对传统的ROI类工具进行了改进，很大程度上方便了操作者使用。同时，经过对实验室细胞图像的分析，寻找出了一种有效的方法来消除图像

中的影响因素，得到相对正确的分割结果，提高了在重叠、粘连细胞图像及复杂背景情况下细胞图像的分割能力。另外，提出了使用图像匹配方法对细胞进行计数，并对于传统的图像匹配法进行了改进，提出一种使用9区域预分割计算方法，提高了匹配运算效率，整合出了一种有效地进行细胞图像匹配分析的图像匹配策略方法。同时，实现在使用中可由用户自己对匹配策略进行调整，以方便对不同测量环境下的细胞作出准确判断。

关键词

图像增强

细胞图像处理；荧光灰度测量；突起长度测量； 细胞计数；细胞

ABSTRACT

During the Life Science Research, the analysis of massive two-dimensional images, including how to precisely deal with and express the useful information, has become the main focus of many scientists. In the past, observable/recordable cellular information was limited with number and length through microscope. However, the information on area, shape, grey scale and complexity were hardly measurable. Meanwhile, some experiments may cost massive time and manpower due to large cell/sample number, and manual processing error is unavoidable. Therefore, a rather complete set of cell image processing software is required in order to increase the automation level of the experiments, achieve quantitative detection, ensure accuracy, improve work efficiency, and reduce experiment cost.

In this research, a cell image analysis software is developed based existing research laboratories demand. Detailed work consists of the following aspects:

1. Based on the image processing performance requirements and the system scalability, main structural framework for image processing system is designed, core data conversion and storage modules are established, and the common interface for image data input/output is built.

2. Basic cellular image calculation and operation modules are constructed, in order to provide rudimental functions such as color converting, space converting, scaling, rotating and moving. And ROI tools are developed to achieve free regional selection and analytical statistics.

3. Enhancement module is constructed to solve the problems including inadequate contrast, low brightness of target image, fuzzy edge and fuzzy details, to improve visual effects, and to highlight specific information. For example, increase grey scale to increase the contrast between cells and background, smoothen image to remove noise, use histogram to statistically analyze and adjust the grey scale, enhance image to carry out linear grey-scale image detection, grey lattice and distribution based on the simple grey area.

4. Modules for processing mathematical morphology and cell image segmentation are built. Due to different cellular type, shape and grey scale in the laboratory research, a common method for area measurement is proposed, in which the area of cell is measured precisely through noise reduction, cell edge detection, Otsu Act threshold segmentation, hole-filling, iterative corrosion, feature extraction and seed filling.

5. Cell image matching module is formed to achieve cell count under the condition of complex background.

6. The feasibility of the system is verified through varies tests on grey-scale measurement of fluorescent cells, cell measurement, cell count, etc.

Furthermore, this study presents the improvement of the existing ROI tools for users’ convenience to a great extent. Moreover, through cell image analysis, an effective method to eliminate the noise is found, relatively correct segmentation results are gained, segmentation ability to the images of overlapping, adhesive cells and complicated background. In addition, image matching method is proposed to count cells. This method is an improved version from the existing approach, in which a nine-regional segmentation method is applied to enhance the matching operation efficiency. Meanwhile, matching strategy can be adjusted by users in order to make exact estimation under various measure conditions.

Key words: cell image analysis, Fluorescence intensity measurements, Neurite length measurement, cell count, cell image enhancement

目录

摘要 ............................................................................................................................... 5

ABSTRACT .................................................................................................................. 7

目录 ............................................................................................................................... 9

第一章 绪论 ............................................................................................................... 10

1.1 概述............................................................................................................... 10

1.2 本课题背景................................................................................................... 14

第二章 细胞图像处理系统的构建 ........................................................................... 20

2.1 细胞图像处理系统的总体结构................................................................... 20

2.2 细胞图像的基本信息处理........................................................................... 21

2.3 细胞图像增强模块....................................................................................... 49

2.4 数学形态学处理与细胞图像分割模块....................................................... 58

2.5 细胞图像匹配模块....................................................................................... 77

第三章 系统在实验室细胞实验中的应用 ............................................................... 90

3.1 系统在神经细胞突起检测中的应用........................................................... 90

3.2 系统在测量荧光细胞灰度中的应用........................................................... 92

3.3 系统在细胞计数中的应用........................................................................... 95

第四章 总结与展望 ................................................................................................... 98 附录:在读期间所发表论文 ..................................................................................... 100 参考文献 ................................................................................................................... 101 致谢 ........................................................................................................................... 104

第一章 绪论

1.1 概述

20世纪20年代，人们第一次通过对图像进行编码，开始进行对自然图像数字化的研究[1]。大型计算机出现以后，人们开始利用计算机来改善图像。从图像增强和复原，到较为复杂的数字图像质量处理，再到机器视觉，经过多年的发展，数字图像处理技术在20多年的时间里迅速地发展成为一门独立的有强大生命力的学科。现今计算机图像处理技术已经越来越多地应用到包括空间技术开发、生物医学、X射线图像增强、光学显微图像分析、遥感图像分析、粒子物理、人工智能和工业检测等方面。在生物学方面，从实验的前期数据模拟，到实验中的实时数据检测，以及实验结果的分析计算，生物学计算软件的开发与运用给生物学实验带来了前所未有的高效和突破。近来，在基因组测序和蛋白质鉴定中，生物学家们使用计算机软件来归类、组织和处理实验中获得的大量数据；同时，借助计算机数据库来获得有关蛋白和核酸方面的结构信息；还利用专门的软件来分析DNA芯片杂交图等。可以说，今天计算机在生物领域正起着不可或缺的作用。 细胞图像处理技术是计算机图像处理技术中的一种。其特点是运用计算机编程和数学方法，对细胞图像进行运算和智能化处理，实现对图像中细胞信息的提取、测量和统计。使用计算机处理细胞图像，可以达到对细胞边界的精确定位，实现对细胞面积、灰度、数量等信息的精确和快速检测，从而定性和定量地获取需要的研究数据。

本文研究的主要目的，是对细胞图像处理的理论和方法进行全面、深入的整理和研究，构建能够高效应用于实验室实际分析研究的细胞图像处理软件系统平台。

1.1.1 细胞图像处理的应用及其优点

在生命科学研究中涉及到大量二维细胞图像的分析问题，包括如何处理、精确表达细胞图像中的有用信息，这已经成为众多学者共同致力的焦点。在过去，在显微镜下观察细胞，只能对细胞数量、长度等信息做大概的观察记录，而对于细胞面积、形状、灰度等信息，很难作出精确的测量甚至无法测量，从而无法对实验结果作定量分析；同时，在一些实验中由于细胞或采样数量庞大，如果进行细胞计数和测量，将耗费大量的时间和人力，得到的实验结果很难避免人工处理带来的误差。

现今，在显微镜下观察到的细胞图像可以被抓取并存储为图像文件。我们可以用细胞图像处理软件来分析这些文件，从中获取长度、面积、灰度、形状等细胞图像相关信息。最初的细胞图像处理软件主要基于简单的测量和统计功能，用户可以手动在细胞图像基础上进行操作，获取比较精确的长度、面积等信息。随着数字图像处理及模式识别技术的发展，一系列数学方法和理论体系的形成、成熟和完善，细胞图像处理进入了智能化和模式化的阶段。

在生物医学方面，细胞图像处理能够对医用细胞显微图像进行高效的处理和分析。如针对血液白细胞图像的自动分类记数[2]，改变了过去长时间以来需要大量工作人员对血涂片进行染色、油镜观察、分类和记数的状况，大大减小了医务人员的工作量，提高了工作效率，缩短了诊断周期；针对宫颈癌细胞的自动识别和分类[3]，使用了形态学、灰度特征和色度学等理论，结合了人工神经网络高度智能化的特点，能够提高检查效率，减少人为误差，成为癌症检查中重要的辅助诊断手段。

总的来说，细胞图像处理的优点主要体现在以下几个方面：

1. 高效性。细胞图像处理的一大优点就是能够最大程度地减少研究人员的工作量，缩短人们在实验结果处理中耗费的时间，提高工作效率。以细胞计数为例，使用传统方法，在显微镜下用肉眼对100个左右容易分辨的细胞进行记数将花费工作人员约1分钟时间，而使用软件系统对细胞进行自动计数，只需要几秒钟时间。当存在大量样本需要进行检测的时候，这种高效性就非常明显。

2. 精确性。在工作人员用传统方法对细胞进行分类计数或者测量时，容易在长时间观测后产生疲劳，出现漏数或多数的情况；或者受到传统测量器材精度的限制，使得实验数据的精度较低，不能够灵敏反映实验效果；同时受观测经验的限制，在对复杂条件下细胞的识别中也存在主观判断的问题，受人主观意识影响大，从而可能导致数据的误差。而使用软件系统进行细胞图像处理，能够很好地解决以上问题，忠实地反映细胞的真实情况，确保数据的精确和稳定。

3. 定量性。传统的细胞图像观测和处理方式，大多只能从主观层面上对实验结果进行定性描述和分析，从而很大程度上制约了实验设计，影响了对实验结果的分析。如何对细胞实验结果作定量分析，是迫切需要解决的问题。通过对细胞图像进行定量处理，可以获取面积、位置、灰度乃至细胞类别、温度等一系列精确数据，从而对实验数据分析提供了强有力的支持，扩展了我们的研究领域。

4. 可扩展性。由于细胞图像处理系统基于模块化构建，其核心数据结构和功能模块既能共享，也可以进行更新。当接收到新的处理任务时，我们既可以对当前主要处理模块进行更改，以满足实验需要，也可以根据现有数据接口，添加新的结构和功能模块，与现有模块互相协调运作。这样，系统功能得到了拓展，

使用寿命得到延长，从而确保了系统在使用过程中不断得到完善和优化，避免系统在完成少数几个实验数据处理任务后就丧失了使用价值。

以上细胞图像处理的优点，也是本课题提出的原因之一。

1.1.2 细胞图像处理的最新进展

细胞图像是数字图像的一种。数字图像处理的发展促进了细胞图像处理技术的发展。现今，数字图像处理技术已广泛应用于图像测量与遥感技术、零部件产品的自动检测与计算机视觉、医学图像处理与诊断、文字模式的识别、动态图像处理、图像的高压缩比编码方法与图像的传输等方面。各种技术的日益成熟也为细胞图像处理提供了良好的研究环境。

最初的细胞图像处理涉及简单的面积、灰度等基本信息的获取。而在获取这些信息的过程中，一直伴随着如何最大程度上去除干扰因素，精确获取细胞边缘，正确分割细胞区域的问题。从这些问题出发，研究人员进行了许多探索，综合了统计学、工程学、人工智能、计算机科学、心理学和生理学等学科领域，产生出许多新的方法，衍生出图像增强、细胞图像分割、图像的形态学处理、细胞图像模式识别、人工神经网络等新技术。现今，研究热点主要集中在如何利用计算机对细胞图像进行图像分割、图像边缘提取及目标定位、特征提取与分类、目标识别、计数等工作上。这些任务的实现大致可以归结为图像分割以及模式识别等问题。即在对细胞及细胞核等进行正确分割的基础上，计算出目标的各类特征。

1. 细胞图像的数学形态学处理（Mathematical Morphology）[4]。1964年Matheron和Serra创立了数学形态学，在随后的20多年里形态学得到了迅速的发展。数学形态学是分析几何形状和结构的数学方法，是建立在集合代数基础上，用集合论方法定量描述几何结构的科学。其基本理论和方法在视觉检测、机器人视觉、医学图像分析等诸多领域都取得了非常成功的应用。形态学研究图像几何结构的基本思想是利用一个结构元素去检测一个图像，看是否能够将这个结构元素很好地填放在图像的内部，同时验证填放结构元素的方法是否有效。

数学形态学是由一组形态学的代数运算子组成的。最基本的形态学运算子有：腐蚀（Erosion）、膨胀（Delation）、开（Open）、闭（Close）。用这些算子及其组合来进行图像形状和结构的分析及处理，包括图像增强、分割、恢复、边缘检测、特征提取、纹理分析、颗粒分析、特征生成、骨架化、图像滤波等方面的工作。

由于形态学具有完备的数学基础，这为形态学用于图像分析和处理、形态滤波器的特性分析和系统设计奠定了坚实的基础，尤其突出的是实现了形态学分析和处理算法的并行，大大提高了图像分析和处理的速度。近年来，在图像分析

和处理中形态学的研究和应用在国内外得到不断地发展。

2. 细胞图像分割。图像分割是一种基本的计算机视觉技术，是从图像处理到图像分析的关键步骤。分割的目的是把图像空间分成一些有意义的区域。有效合理的图像分割能够为基于内容的图像检索、对象分析等抽象出十分有用的信息，从而使得更高层的图像理解成为可能[5]。目前对图像分割的研究还在不断深入中，是目前图像处理中研究的热点之一，至今为止，它仍然是一个没有得到很好解决的问题。

近年来，Chengyang Xu等利用活动轮廓模型对经过边缘检测的图像进行了轮廓拟合和分割，尤其是对U型图像取得了较好的效果[6]。Sobel、Laplacian、Canny等算子被广泛用于边缘检测，同时利用区域之间的邻接和相似性进行区域生长和区域合并。Jseg在确定了种子区域以后，采用了全局最优化的规则进行区域生长，然后使用了基于阈值的区域合并完成图像分割。K.Haris采用水线分割算法完成图像的初始分割，然后使用快速的区域合并算法来合并相近区域。对于彩色图像的分割，一般使用K-Mean或者模糊C-Mean等聚类方法，将图像内的象素划分到指定数目的类别之中，然后将属于同一类别并且相互联通的象素分割到同一区域。也有大量学者利用统计学模型等方法分别从不同的角度对细胞图像进行了分割与处理。同时，有大量的应用使用数学形态学对细胞图像进行处理[7]，利用形态学中的开、闭运算以及骨架提取等操作实现对细胞的处理。

3. 细胞图像的纹理分析。纹理在图像处理中起到重要的作用。例如根据卫星摄影和航空摄影的地形和森林的分析，生物组织和细胞的显微镜照片的分析等等。近几十年来，随着计算机技术和图像处理技术的发展，纹理分析作为模式识别理论应用研究的一个重要组成部分，其应用领域不断扩大，各种纹理分析与识别方法也不断地涌现。常见的纹理分析方法主要有自相关函数法、统计方法、Markov随机场模型分析方法、谱方法、结构方法、子波分析法、数学形态学纹理分析法、空间和频域联合分析法等[8]。而总的来说，这些方法又可分为统计方法和结构方法。

统计方法是根据关于象素间灰度的统计性质对纹理规定出特征。结构分析法利用纹理元素的排列规则来描述纹理的结构。1976年，Weszka提出了灰度差分直方图统计方法（Gray Level Difference Method），能够反映图像灰度的空间组织信息。Haralick等人提出了空间灰度共生矩阵法（Spatial Gray Level Co-Occurrence Matrix Method），通过反映图像的空间灰度分布情况，描述了图像的纹理特征，得到了广泛应用。1983年，George R.Cross和K.Anil给出了完整的Markov随机场纹理模型。F.S.Cohen等人利用高斯随机场模型对九种自然纹理分类，识别率达到了99~100%。

4.细胞图像的分类识别。图像分类属于模式识别的范畴，其主要内容是图像经过某些预处理后，进行图像特征提取，从而进行分类。目前研究热点主要集中在使用人工神经网络对细胞图像进行特征提取和目标识别。人工神经网络[9]是一门交叉学科，涉及到生物、数学、物理、电子及计算机技术等，从人脑的生理结构出发研究人的智能行为，采用物理可实现的系统来模拟人脑的结构和功能。目前科学家提出了很多种具有不同信息处理能力的神经网络，开发了包含ART、AVA、BP等在内的30余种网络模型，广泛应用在联想记忆、优化计算决策、分类识别、智能控制和专家系统等领域。另外，二十世纪六、七十年代V.Vapnik等人研究了有限样本下的机器学习问题，建立了统计学习理论（Statistical Learning Theory），在此基础上发展了支持向量机(Support Vector Machines)，其在解决小样本、非线性及高维识别等方面表现出很多优秀的性能，其理论也日渐运用于各个领域。

现今较为优秀的图像处理软件包括：Focus Graphics公司的AVS医学图像处理系统（http://www.77cn.com.cn/）、用于数码显微镜图像处理的Motics Image 2000、MediaCybernetics的影像分析软件Image-Pro Plus（http://www.77cn.com.cn/）以及生物图像处理和凝胶图像处理软件Image Analysis Software（http://www.77cn.com.cn/）等。但这些软件目前对国内用户来说，还存在着使用和价格等障碍。

1.2 本课题背景

虽然现在市场上已经有很多商业图像分析处理软件，但是大都仅限于普通的应用层面，分散为图像处理、图像分析识别、图像测量等几个类别，真正能结合到实际使用中的并不多。实际上，实验室中得到的细胞图像结果比较复杂多变，对于图像的处理方式也有不同的需求，需要从图像输入输出，到图像表示、转换、处理和分析，再到图像特征提取，以及图像的识别、统计，把图像处理、数据测量、图像分析、模式识别、数据采集以及数据的分析和统计等方面结合在一起，根据每个实验的不同，设计集中化而且功能完整的处理系统，能够自定义分析实验结果，提高实验数据的处理效率。

除此之外，相关的软件开发大都集中在国外，国内优秀的细胞图像分析统计系统目前较少，软件设计人员往往缺乏生物学方面背景知识。如果仅从技术角度设计代码，往往会忽略细胞图像的许多生物学特征，并没有考虑到实验环境对生成图像质量的影响，也没有就实验者最关注的数据信息作特殊处理并设置相关分析统计模块。而我们所需要的是从实验的角度出发，将软件开发和细胞实验相结合。

另外，国外的软件系统性能强大，但价格昂贵，并且需要花较长时间去学习如何操作使用。相对而言，国内的相关软件目前并不成熟，功能全面但普遍较为肤浅，缺乏重点和特色。因此，该领域还有很大的空白需要填补。

1.2.1 课题的需求及待解决的主要任务

实验室的日常运作与观察和测量细胞图像密不可分。目前本细胞生物学实验室主要有以下课题需求：

1. 基于神经细胞图像中细胞突起的测量

神经细胞是一种高度分化的细胞，形态上有胞体和胞突之分。神经突起的生长情况反映了神经细胞的生长特征。自1956年，Nakai成功开创了神经细胞离体培养方法以来，人们利用体外培养的神经细胞进行了大量的研究，如建立神经细胞损伤模型并探讨其发生的机理，在此基础上筛选保护神经细胞的药物等。在这些研究中，经常都要把神经细胞突起的生长状态作为一个观察的指标。传统的神经细胞检测方法是在显微镜下面拍照，利用照片上记录的神经细胞的外型特征进行分析和统计。但是，每一个神经细胞上突起的数量、长度和粗细等特性，却很难用这种方式作出准确的表达。如果使用显微镜下的测微尺对少数突起做粗略测量，工作效率低，测量难度大，不能够很好地反映实验结论。而自从使用细胞图像软件对显微镜下采集的细胞图像进行处理，可以快速、精确地对各个细胞突起长度、数量进行测量，尤其是对带有转角和折度的突起进行测量。测量好的数据结果储存在特定的数据结构中，在此基础上，能够对各组间细胞作突起平均长度方差的计算，以及组与组之间均数比较的t检验统计等，极大地提高了工作效率。

2. 细胞培养中基于细胞或其他特定区域的面积和形态测量

在细胞生长过程中，根据需要会随时对细胞进行细胞面积、核面积、细胞质面积、长短轴和直径、形态因子、核浆比及细胞中空洞所占面积比等测量，以获取相应精确的定量信息。同时，细胞实验中还经常涉及到诸如菌斑面积、条带面积、胚胎血管培养中的毛细血管面积等测量，这些数据对于能否精确评估细胞生长及药物作用至关重要。近年来, 高灵敏度、高精度、自动化、多用途的分析仪器和方法已不断应用于细胞分析中，具有代表性的分析方法包括显微荧光光度术、流式细胞术、激光扫描共焦显微术、电化学方法与电泳技术等。但这些技术

和方法在使用和成本上均存在一定障碍。相比之下，细胞图像分析处理成本最低，操作最为简便，费时最少，同时表现出了较高的精确性。另外，传统的测量方法不能实现对一些特殊区域进行面积和形态测量，如菌斑面积测量和毛细血管面积测量等。而图像分析在此领域则具有很大发展潜力。如今，利用图像分析技术来分析测量细胞及其他特定区域已成为实验室数据分析的重要趋势，在此需求下，需要开发相应的图像处理模块以满足一系列实验分析的需要。

3. 基于细胞荧光染色强度的灰度分析

细胞经荧光染色后，其灰度强弱即成为重要的检测依据。如果使用流式细胞仪一类仪器进行灰度测量，存在使用以及价格上的诸多障碍。而且我们往往需要对荧光染色细胞作线性灰度分析，通过测量细胞线性方向上的灰度变化来获取更详细的细胞生长变化信息。在此需求下我们提出使用细胞图像处理系统对于荧光染色细胞图像进行灰度检测和分析。希望能够通过该系统更方便快捷地获取目标图像中的灰度信息，并进行相关统计分析，精确反映实验结论，并节省实验成本，提高实验结果处理效率。

4. 大批量细胞计数

确定细胞数量是细胞实验分析中一项基本而重要的工作。在药物作用下细胞数量的波动通常能够最直接反映药物效果。由于始实验中细胞样品数量往往很大，使用人工计数不仅工作繁杂、耗时长、效率低，而且依靠人工观察带有一定的主观性，误差较大。如一次细胞检测后，往往会有多组数据，总计数百张细胞图像。每张细胞图像中又有数十到上百个不等的细胞待计。如果用传统方法计数，这是非常艰辛和耗时的一项工作。为了提高实验人员的工作效率，缩短数据处理时间，需要使用基于数字图像处理技术的细胞自动计数方法，构建能用于实际实验测量的细胞计数平台。

5. 其他实验需求

由于实验室不断有新的课题和研究对象，需要从不同途径，使用不同方法对不同对象进行分析、处理，因此也要求细胞图像处理软件能够不断满足日益变化的实验环境和新的实验需求。为了便于日后能够节省开发时间，简易添加新的功能，避免各模块之间的冲突，需要在软件系统构建的最初打好良好的基石，设计清晰的软件构架和数据结构，集成关键的核心数据模块，保留相应的数据接口，

使整个系统健壮并易扩展。

基于以上的需求，我们迫切需要一种从实验需求出发，能够高效解决实际问题的细胞图像处理软件。本研究除解决实验室实际实验需求外，也希望通过对本系统创建的实验过程对细胞图像分析处理系统的构建作出有益的探索。

实验室配备的奥林巴斯IX70倒置式荧光显微镜，具有稳定性很高的显微镜镜体，是电生理学实验理想的显微镜[10]。它能高效地用于一切细胞组织的培养及研究用途，其相衬物镜备有用于象差补偿的校正环，能适应不同厚度和折射率的培养皿，对特别薄或很厚细胞的任何标本都能形成分辨率和清晰度较高的显微图像。然而，众所周知，细胞实验图像由于其自身实验环境局限，往往存在以下影响因素：

1. 杂质和污染物的影响。细胞图像中不可避免地会存在杂质，这些杂质往往充斥分布在整个图像中，使细胞轮廓不明晰，整个细胞难以干净地从背景中提取出来。从而影响了细胞的处理效果。

2. 由于细胞有一定的厚度，在拍摄的时候由于焦距或细胞固定状态等原因，细胞有可能出现变形、失真。细胞中常常存在颗粒状内容物，同时细胞由于自身情况或者拍摄原因，也常常存在中空的情况。这些因素都严重影响了细胞的正常识别。

3. 当细胞密度较大时，容易出现细胞的粘连、重叠和聚堆现象。在细胞的分割中，这样的状况产生的影响甚至比杂质的影响更严重。

4. 细胞图像质量一般较差，容易出现图像模糊、细胞灰度浅不明显、与背景的对比不够、整张图像灰度不均一、曝光不均匀等问题。

为了有效解决实验图像中污染物和细胞粘连等因素带来的影响，有效对细胞图像进行分析处理，系统必须解决的几个关键技术问题是：

1. 由于VB编译程序本身在运算速度上并无优势，并且在图像处理方面也缺少特色，由于需要对海量数据作运算，如果使用传统方法，将浪费大量时间在运算上，使程序异常缓慢，严重影响工作效率。而对于一般的实验室电脑设施来说，由于其性能一般不高，在此也需要一种对配置要求相对较低的软件系统。同时需要保持软件在使用中的稳定性。因此，在图像处理中如何保持运算的高效化，如何最大程度优化算法，是需要解决的关键问题之一。

2．如何对细胞图像进行处理以消除图像中的干扰因素。如消除图像噪声，区分对象区域与干扰区域，排除污染物影响等，为对细胞图像作进一步检测，保证数据的精确性打好基础。

3. 在细胞图像分析中常常需要设置一些规则或不规则区域进行处理，或者由用户进行手动圈定。在做比较分析的时候，还需要能够使用相同的选取形状和

大小在细胞图像上进行移动，从而获得区域不同大小形状相同的一批细胞图像数据。因此，我们需要探索如何让用户能够自主选取相关感兴趣区域进行分析，如何能够将其模块化使用。同时，这也是软件是否人性化和实用化的一个具体的衡量标准。

4. 细胞图像分割是迄今为止尚未得到很好解决的一种技术。经过对实验室细胞图像的分析，我们需要寻找一种有效的方法来消除图像中的影响因素，得到相对正确的分割结果。特别是需要解决重叠、粘连细胞图像及复杂背景下细胞图像的分割问题。

5. 寻找一种有效地进行细胞图像匹配分析的图像匹配策略方法。并且在使用中可由用户自己对匹配策略进行调整，以方便对不同测量环境下的细胞作出准确判断。

6. 传统的灰度直方图和线性灰度检测等还有一定使用上的不便。通过对这些传统技术的改进，可以提高工作效率，并提高软件可用性。

7. 从数学方法的提出，到在VB平台进行编程实现，需要克服一些编程中的难点，解决一些关键技术问题。在这方面并没有太多可供借鉴的对象。并且，在系统开发的过程中，需要通过模块化的方法来整合代码，以便于日后系统维护的方便。

针对以上几个关键技术问题本文提出了解决办法。

1.2.2本文的研究工作

本文解决实验室实际需求的同时，从生物细胞图像的实际情况出发，尽量减少各种图像因素所造成的影响，提高检测精度。研究工作主要包括：

1. 根据图像处理的运算性能要求及系统可扩展性，设计细胞图像处理系统主体结构框架，建立核心数据转换和储存模块，以及图像数据输入输出通用接口。

2. 构建细胞图像基本运算和图像操作模块，使软件具备基本的图像色彩转换、空间转换、缩放、旋转和移动功能，并建立通用ROI类工具，实现图像区域的自由选取和分析统计。

3. 构建细胞图像的增强模块，处理图像中对比度不足、目标图像亮度过低、边缘模糊、细节不够清晰等问题，改善细胞图像视觉效果，突出研究对象的特定信息。其中，通过灰度拉伸增大细胞对象与背景区域的对比；通过图像平滑去除图像噪声；使用灰度直方图实现对图像灰度的统计分析，并对图像灰度进行调整。通过图像增强实现细胞图像的线性灰度检测、灰度点阵和基于灰度分布的简单面积计算。

4. 构建细胞图像的数学形态学处理与细胞图像分割模块。针对实验室研究

的细胞对象种类不一，大小形状各异，灰度各有差别的现状，提出了一种通用的面积测量方法。通过噪声去除、细胞边缘检测、Otsu法阈值分割、孔洞填充、迭代腐蚀、形状特征提取与种子填充法测量等一系列流程实现细胞面积的准确测量。

5. 构建细胞图像匹配模块，实现在复杂背景条件下对不同细胞图像的细胞计数。

其中，本文对传统的ROI类工具进行了改进，很大程度上方便了操作者使用。同时，经过对实验室细胞图像的分析，寻找出了一种有效的方法来消除图像中的影响因素，得到相对正确的分割结果，提高了在重叠、粘连细胞图像及复杂背景情况下细胞图像的分割能力。另外，提出了使用图像匹配方法对细胞进行计数，并对于传统的图像匹配法进行了改进，提出一种使用9区域预分割计算方法，提高了匹配运算效率，整合出了一种有效地进行细胞图像匹配分析的图像匹配策略方法。同时，实现在使用中可由用户自己对匹配策略进行调整，以方便对不同测量环境下的细胞作出准确判断。

6. 通过荧光细胞灰度测量、细胞测量、细胞计数等几种细胞实验对系统各方面性能进行了测试，以验证系统的可行性。

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