食品微生物指标检测实验方案

微生物学实验方案

题

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1 意义

食品微生物指标是指某个或某批食品中微生物的存在与否（定性分析）或每个质量、体积、单位面积或每批产品中微生物存在的数目及其毒素（或代

谢产物）的限制（定量分析），用以评价食品的微生物学卫生状况及其安全性。 在我国食品卫生标准中，通常微生物指标包括菌落总数、大肠菌群、致病菌等的检测，其中菌落总数和大肠菌群是必检项目，致病菌不得检出。 食品中微生物菌落总数指食品检样经过处理，在一定的条件下培养后，所得1mL或1g检样中所含菌落的总数，主要作为食品被污染程度的标志，常用倾注平板菌落计数法。大肠菌群是指一群在37℃，24h能发酵乳糖产酸、产气，需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌，它反映了食品是否被粪便污染，同时也间接地指出食品是否有被肠道致病菌污染的可能性，常用的检测方法是最大可能计数法。

2 目的与要求

2.1 了解菌落总数、大肠菌群测定在食品卫生评价当中的意义

2.2学习并掌握细菌分离和活菌计数的基本方法和原理

2.3学习并掌握大肠菌群的检验方法

3 实验器材

3.1食品检样

3.2培养基 平板计数琼脂培养基：将胰蛋白胨 5.0 g、酵母浸膏 2.5 g、葡萄糖 1.0 g、琼脂 15.0 g、蒸馏水 1000 mL、pH 7.0±0.2加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：将胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g、氯化钠 5.0 g、乳糖 5.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）

2.75 g、磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g、月桂基硫酸钠 0.1 g、蒸馏水 1 000 mL溶解于蒸馏水中，调节 pH 为pH 6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压，灭菌15 min。

煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：将蛋白胨10.0 g、乳糖10.0 g溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.0～

7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH为7.2±0.1，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。

3.3 试剂与器皿 3.3.1 试剂

无菌生理盐水：称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。

无菌1 mol/L NaOH：称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min

无菌1 mol/L HCl：移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121 ℃高压灭菌15 min。

3.3.2 器皿

灭菌锅、恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、冰箱：2 ℃～5 ℃、分析天平、振荡器、恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃、均质器、无菌吸管：1 mL（具0.01 mL

刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头、pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸

无菌锥形瓶：容量250mL/3个、500 mL/3个

无菌培养皿：直径90 mm，15个

试管：30个

玻璃小倒管：20个

容量瓶：100mL，2个

4 流程

4.1菌落总数

4.1.1样品的稀释

固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。

液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。

4.1.2 培养

待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h。水产品

30 ℃±1 ℃培养 72 h±3 h。

4.1.3 菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

4.1.4结果与报告

菌落总数的计算方法：若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算:

式中：

N——样品中菌落数

C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n 1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n 2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

示例：

上述数据数字修约后，表示为25000或2.5×104。

若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。

若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

菌落总数的报告：

菌落数小于 100 CFU 时，按"四舍五入"原则修约，以整数报告。

菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用"四舍五入"原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按"四舍五入"原则修约后，采用两位有效数字。

若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。

4.2 大肠菌群

5 进度安排 第一天下午 玻璃器皿的清洗与灭菌；培养基的制备与灭菌；检样稀释与接

种培养

第二天下午 观察产气与否，用产气的菌种接种至BGLB肉汤

第三天下午 菌落计数，计数

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