可用于基因功能研究的基因组学工具——诱变

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 8．可用于基因功能研究的基因组学工具——诱变 Alex和er S. Beliaev亚历山大 柏利耶夫 朱晨光译；魏华初校, 张晓君校对 8.1 引言 随着原核生物研究进入了后测序时代，人们需要用更多的实验方法来促进对细菌基因组的功能研究。时下，许多医学、环境和生物技术领域中重要的微生物研究由于缺乏足够的遗传学方法而受到了限制。尽管DNA芯片技术、用质谱法鉴定蛋白质等研究方法已经或正在被开发以满足此类研究，但这当中诱变法无疑是揭示基因功能的最有效手段之一。 了解一个复杂生物系统中的某个特殊基因的功能，是一个需要系统研究的多步骤的过程。最初，关于一个开放阅读框产物功能的信息可以根据生物信息学工具比较分析核苷酸序列来得到(详细讨论请看第三章)。然而并不是一个基因组中所有基因都可以用序列同源性预测其功能，而且，序列同源性并不自动对应相应的功能。不同基因之间存在复杂的进化和结构功能的关系，所以通过序列相似性推知基因功能这一方法会被误导甚至有时是错误的（Strauss 和 Falkow, 1997）。确定基因功能的第二步是通过DNA芯片技术和质谱法辅助的蛋白质组学等表达谱技术，从复杂的细胞环境中衡量基因和蛋白的表达模式（Lockhart 和 Winzeler, 2000; Pandey 和 Mann, 2000）。采用这些技术，可以获得大量的信息，但大部分产生的数据只是相关性的，关于基因功能的结论也是推导出来的（Dean, 2001）。第三步，也许是功能分析中最关键的一步，就是为了证实或反驳已有的假设，使被研究的基因失活，并进一步得到失活后的结果。当野生型基因被突变或替代后，比较野生型和突变型的表型差异，可推知该基因的功能。 大多数可检测的突变对应着生物体表型的明确而具体的变化。对细菌而言，诱变是一个相对直观的过程，因为细菌是单倍体生物，在单倍体生物中，任何一个单一基因突变都会导致其表达上的改变或者功能上的强弱变化，由此导致细菌的表型也发生可检测的变化。造成突变的方法有许多，诸如化学、物理和遗传学技术。尽管化学和物理因子可以用来构建大量的突变体库，但由于缺乏容易选择

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31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 的标记而无法用于大规模基因组分析。本章目的并不是对各种诱变研究做一冗长的叙述，而只对那些在细菌基因组功能研究中十分有用的策略做一较为深入的描述。因此，本章拟讨论三种主要的基因组水平上的诱变方法：转座子插入失活、等位交换导致基因失活和通过反义RNA分子阻碍基因的表达。我们将重点讨论这些方法的应用、改进和优缺点，并对每一种方法都提供一些具体的研究范例。 8.2 转座子诱变 正如上所述，任何生物的基因功能和代谢网络的研究都包括产生并分析分布于整个基因组的突变。随着全基因组测序工作的可行性增加，转座子诱变法的应用潜力也迅速增长。转座子插入宿主DNA的随机性导致产生大量的突变体，这些突变体可用于分析某特殊功能或过程的丢失、减弱的原因。许多转座系统已被应用于基因组水平的功能研究，尤其被着重用于研究与生物生存十分重要的基因的鉴定和结构分析。在本章，我们将讨论一些应用插入转座子突变来进行复杂的遗传筛选和在给定条件下鉴定生存必需的基因的方法。 8.2.1 细菌中的转座概述 转座因子的分类 转座因子（TEs）是一类能作为不连续的单元转移到基因组其它位置的可移动的DNA序列。这类序列常出现在细菌基因组中。自从上世纪五十年代发现以来（McClintock,1952），来自159种原核生物的500多种TEs已被发现并具体描述，其中相当一部分还被进行了归类（Craig,1996；Mahillon 和 Chandler，1998）。转座因子在大小、结构、插入特异性和转座机制上多种多样，在细菌中主要分为两类：插入序列（IS）和转座子(Tn)。插入序列是最简单的转座因子，由700bp-1300bp的短DNA片段组成，两端各有一个9-40bps的反向重复序列。这些反向重复序列包围着一个转座相关的基因，叫转座酶基因，它编码一个特异的调控转座的DNA结合蛋白。与插入序列相比，转座子的结构更复杂，因为它包含了编码抗生素和重金属抗性或者分解代谢功能的辅助基因，这些基因都与转座无关。许多转座子如Tn5，Tn9，Tn10组织成“复合”分子，在这些辅助基因两侧各有一个正向或反向的插入序列元件。另外一类TEs，可称之为复杂的转座子，包含一个单一的插入序列因子（两端是30-40bp的倒转重复，中间是

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60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 数个编码抗性和转移相关的基因）。值得一提的是溶源性整合增变噬菌体如λ噬菌体和μ噬菌体，尽管它们的结构和基因的组成比典型的转座子要复杂得多，但也被认为是TEs，并归为单独的一类（详见Thompson和Landy，1989；Pato，1989）。 根据是否在转移过程中复制，可将原核生物的转座子分为两个大类。迄今为止，已有两类转移的机制（保守型和复制型）有文献报道。保守型机制，以Tn5和Tn10家族为例，转座子序列从供体分子上切除，然后不经复制就插入靶位点。这个机制的第一步是转座子分子的双链切开暴露出5’磷酸基团和3’羟基末端，切开后，转座子的3’端转移并共价结合到靶位点的5’突出端。紧接着双链转移的是通过复制来修复插入的转座子5’末端和靶DNA的3’末端之间的缺口。在不复制的转座中，DNA合成只局限于短的单链区域，而不是针对整个转座子（参考Berg的综述，1989）。相比之下，可复制转座并不局限于形成链的缺口，还包括转座子序列的复制。首先是形成单链的3’末端切口，这一过程准确发生在转座子序列的末端，第二链不被切割。3’羟基被转移并连接到靶位点的5’磷酸基团，形成一个复杂结构，叫做Shapiro 中间体，通过复制这一结构再转变成一个共整合体。这一步骤重要的是供体分子的双链始终与转座子序列相连，该转座子序列通过DNA合成被复制。与不复制转移类似，自由的3’羟基作为复制时的引物，在整个转座子分子的两个方向延伸，而不是仅仅局限于靶序列。紧接着的步骤是共整合，在两个转座子拷贝以及供体分子之间形成一个融合体，然后解体成一个供体分子和带有一个新插入序列的靶序列（参考Sherrat的综述，1989）。 插入特异性和末端基因表达的影响 与其他导致基因重排的过程相比，转座并不依赖供体和宿主DNA的相似性。转座子可以插入染色体上的多个位点，尽管他们的靶选择通常从此因子到彼因子，是不随机的，其中大多数因子展示了靶位点选择的选择性、严谨性和模式（Mahillon和Chandler，1998）。然而一些转座子将优先插入某些位点，另一些却避免染色体上的特异区域。转座子插入模式依赖于特异位点被作为靶标的频率和插入的可检测性。一些位点的选择机制决定于编码转座因子的转座酶的DNA结合特性（Craig，1997）。通过转座因子的转座酶

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89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 和靶DNA序列进行反应，或者通过转座酶和编码其他因子的相关蛋白反应，可以选择一个靶位点。这两种方法中特异靶位点的进入都受其与供体分子相关的空间定位影响，或者是受靶DNA区域的综合结构特征影响（Craig，1997）。 整合到靶位点后，转座子和插入因子能影响插入位置附近的基因的转录。大多数情况中转录受到影响是当插入作用导致操纵子前端的一基因（或多个基因）失活时，mRNA上的非翻译区的长片段产生终止信号或极性（Galas和Chandler，1989）。极性程度取决于转座子的大小、内部转录终止子的存在、转座子或者靶操纵元内启动子的存在、转座子插入相关靶基因的位置、以及在插入连接处可能形成的新启动子序列（Reynolds等，1981）。此外，染色体上转座子的插入已被发现可以启动隐蔽基因的转录，这一现象最初被解释是因为邻近DNA的构象和序列发生了变化而导致基因表达增强（Berg，1989）。转座子插入对末端基因表达的影响已被用于获取操纵子组成的初步信息，以及判断是否存在内部转录起始位点（Berg等，1979；Berg和Shaw，1981）。 转座子运送系统 为了在生物体内将转座子整合到靶复制元，然后筛选发生转移的个体，相应开发了一系列运载工具，包括一些不能在宿主菌内复制但具有迁移能力和可大范围转移的自杀噬菌体和质粒。 大多数用于转座子运送的基于噬菌体的载体具有整合和复制的缺陷，比如缺乏噬菌体附着位点、或者在复制基因中发生无义突变、阻止潜在的噬菌体DNA在宿主菌中繁殖。一些噬菌体自杀载体可用于运送转座子到异源宿主，尽管这需要对宿主的额外的遗传修饰。通过导入编码合适的噬菌体受体基因，可使受体菌对噬菌体感染敏感。通过这种方法， 和P1类的自杀型噬菌体被用于运送转座子到Klebsiella pneumonia、 Vibrio cholera、 Pseudomonas aeruginosa和其他微生物（Belas 等, 1984; Devries 等., 984; Harkki和Pelva, 1984; Kuner和Kaiser, 1981; Ludwig, 1987）。通常噬菌体运送载体的使用受制于宿主特异性范围，不适用于对细菌噬菌体感染不敏感的亲缘关系较远的微生物。理论上，任何带有转座子的在宿主菌中不能复制的接合质粒可作为运送工具。目前已有以下策略用于开发自杀型载体系统，包括构建条件缺陷型的复制起始位点、使用不能在宿主中复制的质粒、插入到质粒上的共选择标记（看8.2章）。总的来说，一个运送载体的选择

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118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 很大程度依赖于受体菌和转移靶标的特征。 8.2.2 转座子作为突变的工具 因为转座子促使序列重排（比如插入、缺失和倒位），因此在许多分子生物学应用中都非常有用。例如，转座子已被用于基因的失活、基因传递、测序、选择标记的鉴定和其它应用（参看Berg和Berg的综述，1996）。许多同源和异源的转座子系统已被构建，适用于染色体和质粒编码的基因失活。可用于突变的转座子系统的选择大多数依赖靶DNA（染色体、噬菌体或质粒）的特征和转座因子自身的特征（如抗性标记、靶特异性和转移机制）。一个重要的选择合适技术的通用标准是宿主菌遗传系统的可用性。转座子突变法已在许多革兰氏阳性和革兰氏阴性生物中进行体内和体外研究。 体内突变 当进行体内突变时，自杀型转移载体携带的转座子是通过转化或接合的方式导入到宿主菌中的。体内突变可以是直接或间接，前者依赖转座子导入到感兴趣的宿主中，后者在合适的宿主中引发靶DNA的突变（如大肠杆菌），后一方法必须要使用能在中间宿主中复制但不能在终宿主中复制的一个自杀型穿梭载体质粒。采用合适的方法，有效的将转座子饱和插入克隆DNA, 然后将突变克隆转化到原始宿主。在转座子整合到靶位点，丢失自杀载体后，通过将宿主菌涂布预先加有与转座子抗性基因对应的抗生素的平板，可以筛选出突变体。 体内突变的主要优点是宿主不一定要自然的处于感受态。自杀性供体质粒上的转座子分子可以通过不同的转化方式如电转化或接合转移等来导入到宿主中。但体内突变也有许多局限性。转座子必须依赖自杀性载体才能被介导入宿主，转座酶必须在宿主内表达，而且转座酶的表达通常过量，这容易导致潜在的插入不稳定（Goryshin 和 Reznikoff，1998）。 体外突变 为了降低含转座子序列的质粒介导转移的难度，设计了一系列体外转移系统，以允许高水平突变的产生。体外方法主要依赖纯化的转座酶在无细胞环境中在线状DNA分子间催化链转移（strand-transfer）反应的能力（Haniford和Chaconas，1992；Gary 等，1996；Goryshin 等，2000）。在这个方法中，宿主的靶DNA和转座子分子在经过纯化的转座酶存在的情况下混在一起，形成包含位

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147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 置不同的转座因子的靶DNA分子群体。根据不同实验的需求，靶DNA可以由自杀型质粒、粘粒（cosmid）或细菌人工染色体（BAC）载体携带。通过合适的图谱技术筛选到正确的插入（如PCR、Southern blotting、限制性酶切）。通过转化将突变的DNA片段导入宿主，随后在突变基因和野生型等位基因间发生同源重组。 体外突变法最大优点之一就是能使突变达到高饱和水平，这使人们可以在或大或小的尺度上分析靶标。已克隆的DNA靶标的可获得性提供了一种优势，就是根据研究者的目的，选择不同位点的突变。体外突变法的局限性是必须先了解靶序列的初步信息。和许多体外方法一样，体外突变法非常耗时费力，尤其是在制作限制性酶切图谱时。因此限制了可被检测的突变子的数量。尽管如此，在过去的几年里，序列信息的增加已导致不同的体外转移系统的发展（Colegio 等，2001; Gehring 等，2000; Guo 和Mekalanos, 2001; Griffin 等, 1999; Sun 等. 2000; Wong 和 Mekalanos，2000）。 最近开发了一种新的转座方法叫TransposomeTM, 这方法采用Tn5转移系统，结合了体外和体内系统的优点（Goryshin 等，2000）。这种方法包括体外形成转座子-转座酶复合体（transposome），然后将复合体通过转化导入选择的细胞中。在体外转移的早期，当转座酶结合到转座子分子上并进行切除时，Tn5转座子和转座酶复合体就形成了。在这个时期，由于没有阳离子或靶DNA无法激活转座。当TransposomeTM复合体被导入靶宿主中后，宿主内部的盐浓度将引起转座的发生。尽管这类技术依赖转化系统的质量，但它克服了体内转座面临的宿主障碍和对同源重组的依赖（Hamer 等，2001a）。 转座子突变的优点 转座子突变提供了一些比其他技术优越的地方，容易形成突变，插入稳定性和单一的遗传标记易于对转座子的插入进行图谱分析。 1）与各种化学与物理突变相比，转座子突变使外源DNA整合到靶基因内。转座子诱导的突变恢复率通常比单碱基突变低好几个数量级。转座子从靶位点消除通常是低频率的，出现率在10-8以下（Berg 和 Berg, 1996）。 2）通过采用缺乏转座酶基因的小转座子可以进一步进行稳定性研究。为了避免第二次转座事件，可通过定位于自杀型供体分子上的反式作用转座酶来执行

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176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 转座相关功能，自杀型供体分子在转座之后丢失。既然转座子主体编码抗生素抗性和其他直接的代谢功能，它们的插入不仅使靶基因失活，而且使突变体具有抗生素抗性或其他抗性。通过在加有相应抗生素的平板上挑取阳性克隆，可以筛选出带有转座子插入的突变体。 3）转座子的选择标记可被用来鉴定含有转座子的DNA片段。在切断突变体基因组DNA片段后，通过相应的标记可以筛选出带有转座子插入的区域，用PCR鉴定其图谱，或被用作探针来检测野生型菌株的基因组文库中的野生型基因拷贝。既然大多数转座子的末端都是相同的，那么可通过与转座子末端序列互补的寡核苷酸引物扩增染色体DNA并测序，来鉴定分布在Tn插入两侧被中断的DNA序列。 以上这些特征使转座因子成为基因插入失活的有用工具，也显著的提高了通量和分析的方便。基于转座子的系统是基因组水平突变研究的一种极好方法。 8.2.3 依赖转座子来进行必需基因的鉴定 基因的必需性过去一般是通过化学诱变产生条件致死突变体的随机文库来测定的。这种方法已成功的应用于用选择性丰富培养基代替逐级升温，分离大量温敏型酵母和细菌突变体（Kaback 等, 1984; Schmid 等, 1989）。和其它化学突变一样，这些温敏突变体的突变位点图谱制作通常用互补和克隆操作来完成，对任何不具备已开发的遗传系统的生物而言，这类方法很难实施。即便对具有遗传载体的物种而言，几百个突变的互补和图谱制作需要花巨大的精力，因此不能用于高通量模式。而且，温敏突变分析表明，因为某些突变体家族的基因产物尤其容易突变成温敏型等位基因，所以突变体随机筛选可能导致这类突变体家族的重复鉴定，进而造成过度累积。（Kaback 等, 1984; Judson 和 Mekalanos. 2000b）。 转座子诱变是鉴定一个给定基因是否必需基因的一种可选方法。由于许多细菌基因组已有了全序列，这促使我们可以利用转座子研究来检测和鉴定它们的必需基因。Judson 和 Mekalanos （2000b）提出，鉴定必需基因有两种常用方法：1）反向法，分离出非必需的基因组区域，然后假定其它区域都是必需的；2）正向法，通过形成条件突变来鉴定必需基因，在限定条件下观察致死表现型。每种方法依赖靶生物的特征和实验目的而有所不同。在接下来的部分里，我们将简要

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205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 的介绍用于正向和反向鉴定必需基因的技术，并介绍每种方法的优缺点。 体内整体性转座突变 必需基因鉴定的关键在于得到的突变的致死性。围绕这个问题的方法是将一定数量的突变引入非必需的基因，来确定基因组中可有可无的区域。体内负选择技术可用于构建在给定条件下能生长的转座子诱导的突变体大文库（图8.1）。转化到宿主中后，转座子分子不能在细胞中移动，通过合适的筛选方法可被选择出。大多数情况采用正向筛选与某一生理功能的缺失或损伤相关联的转座子所编码的抗性标记来进行。每一个突变体中，转座子末端由测序或PCR技术来确定，每一个插入被图谱分析后正确定位于基因组的一个精确的位置。 用于体内研究基因必需性的高通量分析的一个极好的例子是支原体（Mycoplasma）的最小基因组的确定（Hutchison 等, 1999）。在该研究中，对生殖道支原体(M. genitalium) 和肺炎支原体(M. pneumonia) 进行全饱和诱变，鉴定两个基因组中的非必需基因，然后来确定这些在实验室条件下生长的细菌的最小基因组信息。虽然这些特殊的体内方法对许多微生物来说不方便，由于所采用的两个支原体物种的基因组都很小，它们是该法应用的理想代表，[M.genitalium 为580kb, M. pneumonia为816kb，（Fraser 等，1995；Himmelreich 等，1996）]。 M. genitalium 和 M. pneumonia中的全面突变可通过转座子Tn4001来完成，这类转座子最初从金黄色葡萄球菌中分离到。（Knudtson 和 Minion, 1993）。自杀型质粒pISM2062上的转座子通过电转化被导入到宿主中去，通过Tn4001上的庆大霉素抗性基因筛选突变体。在抗生素选择之前，所有的培养物被分成8个群，每一个群含有200到1000个带有独立转座子插入的支原体。为了确定转座子插入的位置，抽提所有突变体的全基因组DNA，用内切酶消化并环化。以两个与Tn4001末端匹配的引物反向扩增转座子交叉点，扩增产物克隆到pUC18，然后测序。获得的序列与对应的支原体基因组序列比对，准确确定转座子诱导的突变位置。这些接合部决定了1354个不致死的插入位点，同时鉴定出350个生殖道支原体M.genitalium基因组中的潜在的必需基因（Hutchison 等, 1999）。 通过使用高通量微阵列鉴定在给定的条件下所需要的基因来改进体内转座的方法（Sassetti 等, 2001）。在这个修改了的体内技术中，设计了TraSH进行转

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234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 座位点杂交，采用基于mariner家族的Himar1转座子和有效的噬菌体转导系统产生灰色分枝杆菌突变体大文库。获得的突变体再通过丰富培养基和基本培养基来比较生长状况。提取在两种培养基上存活的菌落的基因组DNA，通过合成与每个染色体上转座子两侧序列互补的标记RNA探针，然后杂交，来鉴定插入位点。这些探针与带有灰色分枝杆菌的每一个预测的基因组上ORF片段的芯片杂交，通过比较来源于两种培养基上的突变体的杂交信号，来确定那些在基本培养基上生长所需要，但在丰富培养基上生长不必要的灰色分枝杆菌基因，这些基因是由已知和未知功能的基因组成的（Sassetti 等, 2001）。 尽管体内方法是有力的工具，并可用于研究任何一种其遗传系统已被开发并测序了的微生物，但不适合大多数研究，因为在统计学上要获得关于基因必需性的重要结论，需要大量的转座子插入。而且，并不是每一个转座子插入到一个基因就导致一个无义突变，因为许多靠近3’端的插入只缺失蛋白的不必要的羧基末端部分。当转座子插入到5’端时，转座子上朝外的启动子的存在也能驱动整个ORF的转录。因此，体内反向方法的主要缺点在于体内转移本身的靶特异性和效率。由于每个基因组中存在“热点”和“冷点”，要获得某些区域的高密度突变非常困难。因此，这种方法只能被用于基因必需性的初步预测，由此产生的任何结果都需要进一步的验证。 通过体外转座来分析基因组并进行图谱定位 用体外转座还开发了一种方法，可以允许更大密度的转座子插入并用于必需基因的反向选择（Akerley 等, 1998; Reich等, 1999）。这种方法，也就是通过体外转座来分析和定位基因组（GAMBIT），该法对研究那些自然环境中能够接受突变片段的感受态微生物的基因必需性特别有用。这类方法包括大片段的饱和突变，这些大片段最后整合到宿主基因组中，产生一个转座子突变体的综合文库（图8.2）。PCR扩增的染色体片段用于体外突变，形成每一个ORF都含有多个突变的重组DNA分子群体。随着转入宿主体内之后，突变的等位基因通过同源重组和产生突变整合到染色体上。产生的突变全部通过基因功能进行筛选，然后选择性筛选之前和之后从文库中提取DNA样品，每个样品中的代表突变再用基因组指纹图谱分析（Singh 等，1997），包括用转座子特异和ORF特异引物进行PCR扩增。设计这种方法可以

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263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 使某一特定位置上的突变在常规的凝胶电泳上形成不同大小的条带。对整个文库而言，基因组指纹图谱法形成一个条带梯队，每一条带代表一个特异的转座子插入。虽然不能选择出功能所必需的基因上的突变，GAMBIT还是提供了没发现有转座子插入的区域或窗口的可视化方法。这些区域和微生物基因组序列的比对可以鉴定那些给定条件下生长必需的推测的ORFs（Judson和Mekalanos，2001b）。 体外转移进行基因组测序和图谱定位已被用于在基因组水平鉴定人体病原菌流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）生长和生存必需的ORFs（Akerley 等, 2002）。这项研究中，366个代表1.83Mb流感嗜血杆菌基因组的片段（大约10kb长）通过PCR被扩增。为了能有重复性和可验证性，设计每两个扩增的片段在片段彼此连接处有5kb的重叠。这些片段用于体外饱和突变，这类突变通过基于mariner家族的小转座子和极度活跃的Himar1转座酶来进行（Lampe 等，1999）。随之得到的文库由366个独立的突变体组成。通过一系列指纹图谱分析，确定转座子插入位点。基于这些结果，可估计478个ORFs对流感嗜血杆菌在丰富培养基上生长起关键作用（Akerley 等, 2002）。这些基因当中259个编码未知功能蛋白。流感嗜血杆菌必需基因与其它完整基因组的比较证实了大肠杆菌、生殖道支原体、灰色分枝杆菌和铜绿假单胞菌中存在流感嗜血杆菌必需基因的同源序列（Akerley 等，2002）。 正如上所述，体内全部突变的GAMBIT的主要优点是增加了插入频率，这使一个特殊基因组区域的突变饱和变得相对容易。高度的饱和充分增强了给定基因的必要性这一结论的统计意义。GAMBIT的一个最具吸引力的特征是可对染色体上任意区域进行分析，使这种方法根据实验尺度而变得灵活。尽管感受态对这种技术而言是先决条件，已有用自杀型质粒作为转移载体来对丝状真菌中进行有效的基因组指纹图谱分析的报道（Hamer 等, 2001b）。GAMBIT的主要缺点在于它的工作强度大，需要通过大量的引物进行图谱分析。 基于mariner家族的TnAraOut转座子系统 所有基于转座子的方法的主要局限在于它们只适用于定位非必需基因，因为一个必需基因的插入失活将产生一个致死表型。产生转录融合的转座子克服了这个问题。与反向策略相反的是，正向方法通过产生条件突变和观察给定条件下的致死率来鉴定必需基因。为此，采用了

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292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 一转座子可定位的诱导型启动子，通过体内转移突变来替换基因的自身启动子。带有朝外启动子的转座子插入到靶基因的启动子或操纵子区域，产生转录融合体，这当中诱导型启动子替代了自身启动子的功能（图8.3）（Chow和Berg，1988；Rappleye和Roth，1997；Judson和Mekalanos，2000b）。 最近，这种方法被用于鉴定霍乱弧菌在丰富培养基上生长或生存的必需基因（Judson和Mekalanos，2000a）。一种基于mariner家族的转座子，称为TnAraOut，带有一个阿拉伯糖诱导的启动子（pBAD），被用于产生16个插入突变，这类突变展示了一种依赖阿拉伯糖的生长表型。突变子中的5个在缺乏阿拉伯糖的培养基上展示出了致死表型。对这些转座子插入两侧的未知染色体区域的分析。证实存在着4个已知的必需基因（gyrB, proRS, ileRS, 和 aspRS），而一个TnAraOut插入出现在还未被证实是必需的假设基因上游。另外11个在无阿拉伯糖培养基上生长的突变体，从形成的单菌落变小或细胞密度降低上看，显示其生长速率下降。大部分这些突变体揭示了非必需的编码代谢或生物合成酶的基因的上游存在着TnAraOut的插入，但这些生物合成酶基因表达对宿主在丰富培养基上最佳生长是需要的（Judson和Mekalanos，2000a）。 值得强调的是用来检测基因必需性的条件可能会影响实验结果。最初，有实验表明一些在丰富培养基生长时并不表现完全依赖阿拉伯糖的TnAraOut突变体可能事实上在其他条件下更依赖于阿拉伯糖（Judson和Mekalanos，2000a）。这通过一个带有编码关键的糖分解酶——丙糖磷酸异构酶的阿拉伯糖诱导型tpi基因的菌株而被清楚地证实。尽管TnAraOut-tpi突变体能在缺阿拉伯糖的LB培养基上生长，但它不能在以甘油为唯一碳源和能量的M9基本培养基上生长。因此，这种方法有潜力被用于鉴定那些未知功能的不表达就使宿主可在丰富培养基上生长，但在其他条件下为必需表达的基因（Judson和Mekalanos，2001a）。TnAraOut系统使用起来是简单的，花费也较低，并适用于对阿拉伯糖是可透过的且具有AraC家族调节蛋白的各种细菌。 通常，用于鉴定必需基因的正向方法具有比其它方法优越的地方。首先，每种通过此方法鉴定的必需基因都是有意义的基因，然而那些不必要的基因通过不同的生长条件可被检测到更多。这类方法不需要另外构建质粒和菌株，因为有用于检测生物功能的方法是其与生俱来的。第二，这种方法可鉴定一些必需基因，

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321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 这类基因含有允许转座子插入的非必需的5’区域，因为一个诱导型启动子的出现将会产生一个条件表型。然而，正向方法也具有一些缺点。一个诱导型的启动子在自然启动子失活时不能驱动足够的表达，或者相反，诱导型启动子的基本表达可能水平太高，以致不能实现只需瞬间量的基因表达产物就可做的基因鉴定。而且，和任何类似体内转移的方法一样，一个基因组的饱和突变是很难得到的；插入频率根据基因变化很大，用此法可能很难或者不可能使较小的基因失活(Judson和Mekalanos，2000b)。 8.2.4 研究细菌致病性的特异标签突变法（Signature-tagged Mutagenesis） 虽然体内转座子突变已成为许多分子遗传学家选择的方法，但这项技术依然只局限于个体突变分析，而且不适用于一些高通量的应用。随着一项新的转座子突变技术的开发，许多常规方法的局限性也被解决了，这项技术叫做特异标签突变（STM）,它利用一个DNA序列来标记每一个转座子分子。这项技术最初被用于研究体内细菌病理学（Hensel 等，1995; 看第12章），主要用于鉴定来自植物、动物和人类病原体的致病因子（Mecsas，2002; Shea 等，2000）。值得一提的是，特异标签突变法可被用于任何需要体内反向选择的微生物基因组。特异标签技术的关键是产生一系列的突变体，每个突变体通过一个带独特序列的转座子分子的整合而被修饰。标记片段为一些短的DNA片段，该片段中间为一个多变区，两侧为不变区，便于PCR扩增、分离和单一序列的标记。原则上，通过一个单一序列整合到每一个个体突变子的基因组中，便可将该突变子从其它突变子群体中区分出来。 STM程序 STM技术的运用通常分为两步。第一步，通过一群携带独特序列的转座子分子来产生一个标记了的突变体文库。在最初的方法中（Hensel 等，1995），转座子miniTn5Km2上的一群双链DNA标记物被用于构建一个随机插入的突变体文库（图8.4）。每一个标记物由两端带有20bp臂，中间为40bp的片段组成。每一个标记物的可变区被设计成2×1017分子中出现一次相同序列。在此基础上，可变区不含任何HindIII, KpnI, PstI或SalI限制性位点，这些位点用于后来将标记物克隆到自杀性载体上。通过连接将标记物装配到pUTminiTn5Km2

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350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 中，并作为一群被随机特异标签标记了的转座子而存在于E.coli中。转座子通过结合转移被转到宿主菌中，产生一个突变体库，每一个突变体有一个随机的miniTn5插入。获得的突变体菌株被分别保存于96孔板的小孔中，准备下一步做点杂交（Hensel 等.,1995）。 特异标签突变法技术的第二步是文库的筛选。最初的方法（Hensel 等,1995），先决定标记物的适用性，然后PCR扩增，标记，DNA探针杂交筛选突变子。产生的清晰放射性的带标记物突变体被重新归并到96孔板上，下一步去感染动物（Hensel 等, 1995）。紧跟选择性筛选之后是突变体的恢复，先用PCR扩增制备标记的探针，这些探针代表了在先选择的群体（也即输入群体）和那些选择后的群体（即输出群体）中发现的标记物。从输入和输出群体中得到标记探针，与排列的突变体点杂交，鉴定出输出群体中没有的标记物，使在感染的过程中不能存活的菌株被筛选出来（图8.5）。这些突变体从最初的微量滴定板中被恢复出来，并通过测序得到转座子插入的两侧DNA序列（Hensel 等，1995）。 如上所述，STM依赖突变体的能力以混合的群体在体内扩增，并只能鉴定那些不能与同一批接种中出现的其它毒力菌株反相互补的无毒突变体（Chiang 等，1999）。为了获得可重复的鉴定结果，STM首次应用到一个细菌病原体时需要考虑许多参数。 应用特异标签突变法通常需考虑的问题 特异标签突变体文库的产生和筛选中有一些关键的步骤，这儿，我们例举了与STM相关的主要例子，列举了可用于改善该方法性能的手段。 突变文库的产生 STM的关键步骤之一是选择基因组中产生随机标记插入的程序的高效性。这并不是很容易做到的，因为必需基因的突变将导致一个致死的表型，这样的突变体将不能生长（Lehoux和Levesque，2000）。然而，STM技术的困难时常也归因于缺乏一个合适的体内转移系统。为了提高插入突变的效率，有人已提出修改标准体内程序。在尝试鉴定肺炎链球菌的毒力基因时，将短的随机基因组DNA片段插入到一个带有分子标记的自杀质粒载体上，形成插入复制突变，来构建一个特异标签突变体文库。（Polissi 等，1998）。因为体内转移看来并不产生链球菌突变体的随机突变（Hallet 等，1994），转座子分子被可选择

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379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 的400到600bp的染色体片段代替，这些片段容易在带标记的分子和宿主染色体之间发生同源重组。STM程序中的另外一个改进是在大肠杆菌体内使用穿梭载体进行转座，得到的质粒然后又被转移到靶宿主。采用特异标签的转座子进行穿梭突变可用于建立脑膜炎奈瑟氏球菌的随机突变体文库，该文库可用于对不能使用STM技术的细菌进行体内筛选（Claus 等，1998）。 杂交特异性 在Hensel和同事开发的方法中，通过在用一个动物感染模型之前进行杂交，来检测DNA标记物的特异性。为了避免预筛选过程并提高监测方法的灵敏度和特异性，对原始方法进行了改进，这些原始方法是在突变之前筛选96个标记了的转座子（Mei 等, 1997）。标签选择的主要标准是建立在扩增和标记的效率及杂交的高特异性的基础之上。选中的组里所有被标记的转座子被用于产生96个突变体的分离池。既然每一个突变体池的标记是已知的，对突变体菌株进行标签合适性的预筛选也就不再需要了。而且高特异性的预选择标记物的使用使得用质粒或标签DNA点杂交而不是菌落杂交的分析成为可能，这样增加了测定的灵敏度(Chiang 等, 1999; Mei 等, 1997)。在STM方法的另一个改进中，杂交筛选被采用一系列可重复使用的标记物的PCR检测替代（Lehoux 等, 1999）。为了PCR最佳扩增而设计的12个特异标记物被用于构建12个突变体文库，这些文库建在96孔微量滴定板中。在一个给定的文库中，每一个突变体有相同的标记物，但可能插入在细菌染色体的不同的位置上：作为一个STM工作流程（working scheme），从每个文库中挑出一个突变体以形成12个唯一标记突变体的96池（pools），这些唯一标记突变体随后被用于体内筛选和鉴定弱化了的毒力基因（Lehoux 等, 2002）。 池的复杂度 因为池中的不同突变体菌落的数量增加了，因此那些毒力突变体不能达到产生足够杂交信号数量的可能性也增加了，这可能导致对突变体的鉴定出现错误。池的复杂度看来与杂交信号的强度成反比，因此限制了每一个池中可用的突变体数量（Chiang 等.,1999）。正如伤寒链球菌所展示的，96个不同突变体池获得了强而可重复的杂交信号，而在192个突变体的池中却不行（Hensel 等,1995）。然而，池的复杂度可能因不同的病原体-宿主系统而不同。为了获得研

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408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 究霍乱弧菌中菌落形成因子的可重复的结果，池的复杂度降低到48个菌（Chiang 和Mekanlanos,1999）。 接种体剂量和管理 用于接种的菌的数量和接菌的方式能显著的影响输出池中的不同突变体的比例。这些事件主要是由于在感染进程中出现的选择性过程。用一个带有96个不同突变体的池提供104个细胞的接种量，来研究伤寒链球菌的伤寒症感染，这一研究产生了相矛盾的结果（Chiang 等, 1999），而一个105细胞的接种量获得了可重复的杂交模式和一个弱化了大概4%左右的毒力频率（Hensel 等, 1995）。相比较而言，高接种剂量能使动物的免疫系统疲劳，这可导致突变体生长和存活能力减弱（Chiang 等, 1999）。此外，腹膜腔内96伤寒链球菌突变体的105个细胞与感染动物脾脏中来的大多数菌群产生可重复的杂交信号。同时，在相同接种物的经口接种后，只有一小比例的突变体在脾脏中被发现，然而回收的菌株类型因不同动物而不同（Chiang 等., 1999）。 感染的持续时间 另一个影响STM研究结果的论点是接种后的时间点，在该时间点突变池被回收用于杂交筛选。短暂的培育时间导致不充分的弱化，这样毒力菌没有足够的时间长过弱化的突变体。另一方面，培育时间长能使一些毒力菌株以一种非特异的方式生长大大超过其他毒力菌株。这些参数显而易见的彼此相关，必须为每一个病原体宿主互作进行经验式的优化，以获得从至少感染相同组突变体的两种动物那里得到的标记物的可重复的杂交模式（Chiang 等, 1999）。 STM研究和微阵列技术相结合 正如以上所述，STM技术研究的深入已经使最初的方法有了很大改进。通过将STM技术和高密度阵列相结合，改进了该法的基本程序。最近的关于假结核耶尔森氏菌感染鼠科动物模型的研究中，结合使用了特异标签和DNA微阵列技术（Karlyshev 等, 2001）。最初使用随机产生标记物的文库的实验导致了假结核耶尔森氏菌突变体输入池中不连贯的杂交信号。来源于不同克隆的标签序列分析，揭示了信号强度的变化是由可变区的缺失和标记物的不同的G+C含量造成的（Karlyshev 等，2001）。为了克服这些问题，采用了来源于啤酒酵母全基因组突变方案的预选择标签构建的96个转座子（Winzeler

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437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 等, 1999）。根据解链温度相似性、缺乏二级结构和所有标记物中75%的最大序列相似性的原则，选择出了192个序列。为了提升方法的可靠性以及方便数据整理，通过包含信号序列的嵌套式引物进行三步PCR扩增的方法把每一个转座子用两个标记物标记 (Karlyshev 等, 2001)。为了确认带有相同信号序列的杂交信号具有相似的强度，采用生物素标记了的与保守区域互补的引物从三个不同的转座子中扩增出标记物，然后将标记物与一个包含大约4000个不同的20碱基序列的高密度寡核苷酸微阵列杂交。虽然观察到了克隆之间的微小差异，三个最初系列产生了杂交强度非常相似的可重复的结果。 对于体内筛选实验，假结核耶尔森氏菌Y. pseudotuberculosis特异标签菌株的主文库被用来组成603个转座子突变体的输入池。关于突变体的回收，用生物素化的引物扩增和标记每一个池中的标签，使之与寡核苷酸微阵列杂交。比较来源于输入和输出池中的信号强度，发现了31个被减弱的突变体，包括一个相对丰度在输出池中降低的磷脂酶突变体。转座子插入的序列分析鉴定了在鼠疫耶尔森氏菌和假结核病耶尔森氏菌中都存在的26个基因，还有5个基因是假结核病耶尔森氏菌特有的。本研究推测的毒力基因包括那些参与了脂多糖的生物合成、吸附、磷脂酶活性、离子同化作用和基因调控的基因（Karlyshev 等, 2001）。 总之，本研究从603个突变体菌中证实了31个潜在基因，这个比例比那些主流的用STM做的研究报导的比例要高。正如作者所说（Karlyshev 等, 2001），鉴定率的提高主要归因于对标准STM程序的修改。通过增加检测灵敏度和对数据进行定量分析，以及将预选择序列和高密度阵列杂交技术相结合，可以使鉴定效率和结果可靠性得到优化。双标记序列被标记到每一个突变体中，使方法更好，数据可靠性更高。即使用小的接种量或者更少的输出池菌落的数量，杂交模式也是可重复的。因为阵列上的探针序列拥有相似的杂交特征，和随机序列常一起观察到的信号强度变化可以被降低，因为我们可以选择单一的探针，来分析例如混合培养物、生物膜和微生物群体等高度复杂的环境（Karlyshev 等，2001）。 8.3 通过等位基因交换进行定向突变 通过同源重组进行基因交换已经被延伸应用到将重组或突变的等位基因导入革兰氏阳性和阴性原核生物以及单细胞真核生物。通常采用不复制或有条件地

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466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 激活的质粒载体将突变的等位基因转入宿主菌的方法获得基因失活。在同源重组和失活的等位基因整合进质粒载体之后，通过对一系列药物或化合物有抗性或敏感的选择性，或反向选择标记来鉴定突变体。接下来的章节，我们将评述通过等位基因交换导致基因失活的原理和步骤，并提供用于决定基因功能的大规模功能基因组学研究的例子。 8.3.1 等位交换用的自杀性载体系统 了解体内质粒复制和传代的调控，对于开发等位交换的有效方法是必需的先决条件。自杀性转移系统作为等位交换突变的基石，应该具有这类基因失活类型所必需的一些特性。自杀质粒必须是有条件的复制，这样可以对整合进染色体进行选择。这可以通过使用一个仅能在给定的宿主中自主复制的质粒或通过使用有条件的复制子完成。其次，自杀质粒必须携带一个可选择的标记（例如，编码抗生素抗性的基因）来完成接下来的选择工作。最后，自杀质粒应该对大范围的生物是可选择的，而且在这些生物中，当其他转移方式如转化或者电脉冲转化无效时，可以通过接合来完成转移。后者经常通过把广宿主范围质粒RK2、RP4或RP1的转移起始区转入自杀质粒中来实现（Guiney 和 Yakobson, 1983; Yakobson 和 Guiney, 1984; Furste 等, 1989; Parke, 1990; Jaworski 和 Clewell, 1995）。 在开发等位交换用的转移载体方面已经有许多研究。鉴定一个最合适的自杀性载体，最容易的策略之一是利用复制需要的宿主特异性。例子包括一些不能在大多数非肠杆菌中繁殖的大肠杆菌ColE1和p15A家族的质粒（Parish 和 Stoker, 2000），然而从革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌中分离到的pUB110、pC194和pHT1030质粒，却不能在大肠杆菌中复制。利用依赖宿主特异性蛋白进行复制的质粒，发展了类似的方法（Hashimoto 和 Sekiguchi, 1976; Biek 和 Cohen, 1986; Leenhouts 等, 1991）。目前已知DNA聚合酶1和复制起始蛋白DnaA分别对载体pBR322和pSC101的复制是必需的（Hasunuma 和 Sekiguchi, 1977; Oka 等, 1980）。而且，两个质粒在生长于基本培养基的recD-菌株中是不稳定的（Biek 和 Cohen, 1986）。为了构建带有温敏型复制起始区（逐级升温培养时不稳定）的自杀运载系统，也需要宿主特异性的因子。带有温敏蛋白PolA和RecD的菌株在42℃时不能保留ColE1质粒（Blum 等, 1989; Russell 等,

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495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 1989; Biek 和 Cohen, 1986）。温敏型自杀载体不能在复制缺陷型菌株中繁殖的例子有pSC101、pHSG415和pWV01质粒，该类质粒在许多革兰氏阳性和阴性细菌中使用（Leenhouts 等, 1996; White 等, 1999a; Wolska 等, 1999）。 使用带有R6K复制起始位点（oriR6K）的质粒载体，专为定向突变开发了一个较好的的自杀系统。带oriR6K的质粒载体只能在可表达π蛋白的转基因宿主菌中存在，不能在缺乏编码复制酶所必需的pir基因的菌株中复制。在大肠杆菌中，π蛋白能够通过带有一个拷贝pir基因的原噬菌体而获得。既然大多数的革兰氏阴性细菌不拥有pir基因，依赖 pir的R6K自杀载体可广泛用于基因置换突变（Kaniga 等, 1991; Skorupski 和 Taylor, 1996; Biswas 等, 1993; Kalogeraki 和 Winans, 1997; Alexeyev, 1999）。此外，这些载体包含一个转移起始位点，这个起始位点允许质粒从合适的供体菌通过接合作用转移到大范围的宿主菌中。用一个包含质粒R6K的复制起始区替代被缺失的ColE1复制起始位点（oriE1），得到由pBR322衍生而来的质粒pGP704。使用这个质粒的系统就是这类自杀系统的例子之一（Miller 和 Mekalanos, 1988）。 另外一个通过同源重组来对标记物交换进行选择的方法建立在某些质粒的不相容性基础上。有实验表明来自相同不相容群的质粒的重复感染能应用于替换宿主质粒（Novick 和 Hoppensteadt, 1978）。尽管这个方法有点费力，需要一系列筛选步骤，这对在缺乏合适选择性标记或自杀性载体的生物中产生靶基因破坏是有用的（Bringel 等, 1989; Fedorova 和 Highlander, 1997a,b）。 各种可反向选择的基因已被广泛用来构建自杀载体。在合适的生长条件下，反向选择的基因导致获得这个基因的微生物死亡（Stibitz，1994）。最普遍使用的反向选择标记包括表达对蔗糖（sacB）、链霉素(rpsL)、链胞氨酸(tetAR)敏感的基因(Dean，1981; Maloy 和 Nunn, 1981; Gay 等, 1985)。带有整合了反向选择标记的自杀载体的转化子，由于在染色体上保留了一个自杀载体的拷贝，在反向选择性的化合物存在情况下被排除。反向选择标记经常是对于在含有未很好研究的遗传系统的微生物中构建敲除突变或序列修饰十分的管用。此外，这种标记物的潜力已经被证明可应用于构建突变体、筛选插入序列因子和消除内生质粒等（Reyrat 等，1998）。

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524 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 550 551 8.3.2 通过等位交换进行定向突变的常用策略 在遗传系统已被研究的细菌中，由于基因组序列已知，因此能得到突变的等位基因，用于对目的基因的敲除失活，导致重要的靶基因敲除失活的等位基因的产生。目前已有许多策略通过同源重组将修饰了的等位基因转移到染色体上。用等位交换使基因失活可通过将合成的DNA整合进靶位点，然后用合成的DNA替换野生型基因并缺失靶区域来实现。 通过单交换的重组方式来整合条件复制子：插入-倍增法 有条件的进行复制的自杀质粒，可被用于插入式突变，以产生确定的重复和位于靶基因内部的无效等位基因。基因的内部片段通过PCR扩增或限制性酶切并克隆到自杀性载体来产生。得到的产物通过接合转移、电转化或者化学转化被导入宿主细胞。选择编码质粒的某些特征如抗生素抗性，使质粒整合进宿主染色体并且在克隆的内部片段和受体染色体的相关区域之间发生同源重组。单交换将产生两个截短的位于质粒插入位点两侧的靶基因拷贝（Miller 和 Mekalanos, 1988）(Fig.8.6A) 既然单交换形成靶基因的两个截短拷贝，通过同源重组整合自杀质粒已被用来产生转录和翻译融合体，同时自发地破坏基因（Fig. 8.6B）。许多自杀质粒被特异性修饰，也就是将无启动子的报告基因直接整合到克隆基因片段的下游，以满足实验需要（Kalogeraki 和 Winans, 1997; Shalom 等., 2000; Lai 等., 2001）。载体通过同源重组整合进染色体，之后就在靶基因和报告基因的5’端形成融合，再接着就是带有另一个靶基因的截短拷贝的自杀载体整合到染色体上。当靶基因功能要求必需保留时，可以将一个完整的带有启动子的靶基因的5’端克隆进自杀性载体。在这个例子中，质粒整合将导致在靶基因和报告基因之间形成融合体，此时一个包含内生启动子序列的野生型等位基因是在插入位点的下游（Fig.8.6C）。然而，一个完整的靶基因的3’末端能被用来构建一个反式的部分二倍体菌株，在这个菌株中一个完整的野生型基因拷贝位于载体序列的下游，报告基因盒和一个截短的靶基因拷贝位于这个野生型基因之后（Kalogeraki 和 Winans, 1997）(Fig.8.6D)。 在许多微生物当中，通过同源重组整合自杀性载体都是一种有效进行特异位点突变的方法。这种方法相对容易完成，且比其他突变法受欢迎。因为一个单交

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553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570 571 572 573 574 575 576 577 578 579 580 换产生一个野生型基因的敲除突变，所以这种方法比其他技术更直接。利用总基因组DNA消化后得到的全部克隆片段，可以通过整合载体用于随机的基因失活(Hoch,1991)。然而根据实验目的，应谨慎评价用于基因破坏的自杀性载体，因为这种方法有一些明显的缺点。首先，插入的极性和任何载体上内部启动子的存在，能改变连接到整合位点的基因的表达水平。其次，靶基因的两个突变体拷贝的形成能够影响插入稳定性，并促使同源重组导致质粒消除。最后，由选择压力（抗生素、重金属离子等）产生的生理压力能影响细胞适应性和产生与突变不相关的表现型。 双交换重组产生基因置换：缺失-替代法 为了克服通过整合载体进行基因中断所造成的不稳定因素，通过转座子插入或用一个选择性标记进行部分置换的方法可以突变自杀质粒携带的野生型等位基因（Newland 等, 1985; Goldberg 和 Mekalanos, 1986）(Fig 8.7)。保留突变基因两侧的区域，用以促进与目的基因组发生同源重组。通常可以在一个能复制自杀性载体的宿主中构建相应的靶基因突变，然后带有已破坏的等位基因的质粒被转入目的宿主生物体。可通过正向选择和双交换重组子的筛选分离所需的预期突变体，其中双交换重组子保留了用来替换野生型等位基因的选择性标记但丢失载体编码的抗生素抗性基因。 用IncP不相容群的质粒发展了其它一些缺失置换方法（Mekalanos 等, 1983; Kaper 等., 1984; Sar 等., 1990）。简单的说，采用一个编码卡那霉素抗性蛋白的基因盒可以突变野生型等位基因。突变区域被亚克隆到一个可移动的RP4衍生的质粒，例如pLAFRII，该质粒带有四环素抗性，可通过接合转移转入野生型弧菌（Vibrio）受体菌。通过筛选载体编码的抗生素抗性(Tc) 、突变的等位基因中的药物抗性标记（Km）和受体菌，选择接合子。同源重组后野生型等位基因与突变等位基因发生交换，由此可筛选重组子，还需进一步从受体菌中消除质粒。这可通过再导入另外一个不相容的“剔除”质粒来完成，该质粒属于IncP群，但编码一个不同的药物抗性标记，例如，庆大霉素（Gm）。既然两个同一不相容群的质粒不能在同一宿主细胞中存在，选择“剔除”质粒将导致转移质粒的丢失。因此，如果Gm和Km标记物都被选择，就能筛到丢失了pLAFRII，同时突变的等位基因又整合进了发生同源重组的染色体中的接合子。

可用于基因功能研究的基因组学工具——诱变

582 583 584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 为了获得高转化率和重组率，一个简单但非常有效的等位基因置换技术被开发出来（Baudin 等, 1993; Datsenko 和 Wanner, 2000; Murphy 等, 2000; Yu 等, 2000）。这种技术可以不先克隆靶基因而发生基因置换，并使线状DNA转移到目标宿主中。通过使用30到50个与靶位点和带有抗生素抗性基因的模板载体邻近的区域序列一致的核苷酸引物对，进行PCR扩增来产生突变了的等位基因。当导入到宿主微生物后，通过同源重组，PCR产物能替换目标等位基因。转化之后，通过药物抗性的标记物选择可能的突变体，进一步利用对突变区域进行PCR扩增来筛选突变体。这种靶基因置换的方法最初是用于研究啤酒酵母中有丝分裂的高重组率（Baudin 等, 1993）。与酵母和一些天然感受态细菌不同的是，通过线状DNA转化大多数细菌的频率极低，这是因为细胞间存在外切核酸酶（Lorenz 和 Wackernagel, 1994）。为了解决这个问题，构建了大肠杆菌的高频重组菌，该菌的编码外切酶V的recBCD基因已被细菌噬菌体λ的重组功能替换（Murphy, 1998; Yu 等, 2000）。线状DNA电转化菌株recBCD:: λ的转化率为10-2，基因置换的频率大概是10-4到10-5重组子/存活体(Murphy 等., 2000)。这里描述的基因失活方法可以在一系列生物中产生稳定、容易选择的突变。利用PCR进行基因破坏的应用，在目标基因不必被克隆这方面比其它等位基因交换法有优越性。但一个主要的缺点是双交换重组的效率降低，需要筛选更大数量的突变体。此外，如果用于中断的基因中有一个转录终止子存在，也可能出现极性效应。 通过反向选择标记物构建无标记的缺失 用体外修饰了的等位基因替换原始基因构建无标记的突变细菌，是一种从分子尺度了解基因功能同时决定结构与功能之间关系的基本方法（Reyrat 等, 1998）。 因为将一个质粒的基因整合到染色体上的双交换事件是少见的，如果克隆的基因难以直接进行筛选的话，简化对此类事件的选择就不方便。在此种情况下，可用一个两步程序（图8.8）。首先，带有一个反向选择标记的质粒通过在同源基因之间发生一次单交换而被整合进染色体，在染色体上产生一个靶基因的副本。第二，染色体上的副本通过位于正向重复两侧之间的同源重组而被缺失，最后剩下染色体上的野生型拷贝或突变体拷贝。因为正向重复通常很短，所以期望的重组事件很少发生。质粒的抗标记物表型可用于直接选择质粒整合事件。一旦质粒

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