小牛胸腺DNA与细胞色素C相互作用的电化学和光谱研究

第25卷,第8期　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析2005年8月　　　　　　　　　　　　SpectroscopyandSpectralAnalysisVol125,No18,pp130621308

August,2005　

小牛胸腺DNA与细胞色素C相互作用的电化学和光谱研究

周家宏1,冯玉英1,吴晓红2,杨　辉1,邢　巍3,陆天虹2,33

11南京师范大学分析测试中心,江苏南京　210097　　　　　　　　　　　21南京师范大学化学与环境科学学院环境友好实验室,江苏南京　21009731中国科学院长春应用化学研究所,吉林长春　130022

摘　要　利用电化学和紫外2可见(UV2Vis)反射吸收光谱技术研究了固定到带正电的尼龙膜上的小牛胸腺

DNA(CT2DNA)与马心细胞色素C之间的相互作用,发现马心细胞色素C能以其带正电的活性区域一端吸附到带负电的CT2DNA表面,因此CT2DNA能促进马心细胞色素C的直接电化学反应。主题词　CT2DNA;马心细胞色素C;尼龙膜;电化学;紫外2;相互作用中图分类号:O657　　文献标识码:A　　　文章编号:()2引　言

由于DNA的复制、因子的调节,而调控因子就是各种蛋白质和多肽,调控因子的调节作用主要是通过其与基因的相互作用来完成的,因而研究DNA与生物大分子之间相互作用有助于阐明基因与调控因子的作用机理,对探寻和发现新的基因调控因子和研究多肽药物均具有很大的价值。

马心细胞色素C在体内起着电子传递体的作用,它是由一条104个氨基酸残基组成的肽链和一个与之共价相连的血红素基团组成,血红素位于肽链内,并被肽链包围,处于疏水环境,仅有一个裂缝使血红素的部分边缘可以与溶液相接触,这一区域被认为是细胞色素C分子氧化还原反应的活性区域[1],细胞色素C分子表面带有电荷,正电荷主要分布在细胞色素C活性区域一端,而负电荷位于细胞色素C分子的另一端。过去关于细胞色素C与DNA相互作用的研究主要是从宏观方面分析两者的作用情况[225],表明CT2DNA对细胞色素C的直接电化学具有较强促进作用,但是没有能够从分子水平上阐明两者相互作用的机理,从而进一步探讨CT2DNA对细胞色素C的电化学性质的促进原因。

本文利用UV2Vis反射吸收光谱技术研究了固定到带正电的尼龙膜上的CT2DNA与马心细胞色素C之间的相互作用,探讨了两者相互作用的机理,及CT2DNA对马心细胞色素C电化学反应的促进机理。

1　实验部分

马心细胞色素C为美国Sigma公司产品,CT2DNA为华美公司产品,带正电的尼龙膜为欧洲Roche公司产品,其他试剂均为分析纯,所有溶液都用亚沸水配制。

UV2Vis吸收光谱实验用日本日立公司的U23400型紫外/可见/远红外光谱仪进行,用Al2O3作为参比体。在尼龙膜上滴1mg mL-1的CT2DNA水溶液,晾干,用亚沸水淋洗后,再晾干,得到CT2DNA/尼龙膜。把尼龙膜在马心细胞色素C水溶液中浸20min,取出用亚沸水淋洗,晾干,得到马心细胞色素C/尼龙膜。先在尼龙膜表面上滴上1mg mL-1的CT2DNA水溶液,晾干,用亚沸水淋洗后,浸入马心细胞色素C水溶液中20min,取出后用亚沸水淋洗,晾干,得到马心细胞色素C/CT2DNA/尼龙膜。制得的各种膜都可用于UV2Vis反射吸收光谱的测量。

电化学实验用美国EG&G的M273A的恒电位仪和常规的三电极电化学池进行。把用上述方法制得的马心细胞色素C/尼龙膜或马心细胞色素C/CT2DNA/尼龙膜固定在金电极上

,就可得到这两种膜修饰的金电极,用作为工作电极。对电极是铂丝,参比电极为饱和甘汞电极(SCE)。电解液为

-1

pH7120的011mol L磷酸盐缓冲溶液。所有的实验均在25℃下进行。

　收稿日期:2004203209,修订日期:2004207206

　基金项目:国家自然科学基金(20243002),国家“211”工程重点学科建设项目,江苏省教育厅自然科学基金(04KJB150068,04KJD150110),

南京师范大学科研启动基金,南京师范大学青年基金项目资助

　作者简介:周家宏,1972年生,南京师范大学分析测试中心和江苏省生物医药功能材料工程研究中心副教授　　3通讯联系人

2　结果与讨论

图1,曲线a为尼龙膜的UV2Vis反射吸收光谱。由图可见,尼龙膜在208nm处有一个强的吸收峰。当将CT2DNA固定到尼龙膜上后,除了尼龙膜在208nm处的吸收峰外,在264nm处还有一强的吸收峰,这是CT2DNA的特征吸收峰(图1,曲线b),这表明CT2DNA已经固定到尼龙膜上。CT2DNA具有双螺旋结构,在双螺旋结构的边缘有较多带负电的磷酸残基,因此CT2DNA表面带负电荷,能以静电作用的方式吸附到带正电的尼龙膜表面

。

到尼龙膜表面时,由于尼龙膜表面带正电,因此,马心细胞色素C分子以其带负电的一端以静电作用的方式吸附到尼龙膜表面,而其活性区域远离电极表面,因此观察不到马心细胞色素C的电化学反应

。

Fig12　TheUV2Visreflectancespectroscopyof(a)

C/and(b)cytochromeC/CT2

Fig11　TheUV2Visabsorptionspectroscopyof(a)

nylonmembraneand(b)CT2DNA/nylonmembrane

图2中曲线a为马心细胞色素C/尼龙膜的UV2Vis反射吸收光谱。由该图可观察到位于208,364,410,530nm处

的4个吸收峰,与尼龙膜的UV2Vis反射吸收光谱(图1,曲线a)比较可知,后3个峰是氧化型的马心细胞色素C的特征吸收峰[6]。这说明马心细胞色素C也能吸附到尼龙膜上。这是由于细胞色素C分子表面电荷分布不均匀,其反应活性区域部位带有正电荷,分子另一端带有负电荷,这样可以通过静电作用将细胞色素C以负电端吸附到尼龙膜表面。图2中曲线b为马心细胞色素C/CT2DNA/尼龙膜的紫外2可见反射光谱图,由该图可观察到3种物质的特征吸收峰,与CT2

DNA或细胞色素C单独存在于尼龙膜上的图谱相比,CT2DNA和马心细胞色素C的特征吸收峰的峰位都没有发生变

Fig13　ThecyclicvoltammogramofcytochromeC/CT2DNA/

nylonmembrane/Auelectrodeinthe011mol L-1phosphatebuffersolution(pH712)

化,表明马心细胞色素C和CT2DNA都被固定在膜上了。对上述3种物质的荷电性质的分析表明,带负电的CT2DNA通过静电作用被吸附到尼龙膜上,然后马心细胞色素C以其带正电荷的活性区域端以静电作用的方式吸附在CT2DNA的表面。

电化学实验的结果表明,在马心细胞色素C/尼龙膜的循环伏安曲线中,没有观察到氧化还原峰。我们过去的研究表明,马心细胞色素C能在修饰电极上进行直接电化学反应的原因可用静电作用的机理来描述[7]。如马心细胞色素C分子带正电荷一端,即活性区域一端靠近电极表面,马心细胞色素C分子就能进行直接电化学反应,如带负电的一段靠近电极表面,反应就不易进行。所以,当马心细胞色素C吸附

图3为马心细胞色素C/CT2DNA/尼龙膜修饰金电极在

pH712的011mol L-1磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线。由图可观察到一对氧化还原峰,氧化峰和还原峰的峰电位分别为75和-6mV,峰电位差为81mV。另外,氧化峰和还原峰的峰电流基本相同,这表明马心细胞色素C/CT2DNA/尼龙膜修饰金电极上的马心细胞色素C能进行准可逆的电化学反应,其式电位在35mV左右,这结果与文献中报道的相近[7]。这结果说明CT2DNA对马心细胞色素C的直接电化学反应有促进作用,并进一步证明了这种促进作用的静电作用机理。因为从上面的分析可知,马心细胞色素C分子会以其带正电荷的一端,即活性区域端吸附到表面带负电荷CT2DNA上,因此,马心细胞色素C的活性区域靠近电极表面,从而使马心细胞色素C的直接电化学反应易于进行。

本文所取得的成果是很有意义的,有关分子与DNA的相互作用的研究有不少报道,例如文献[8]。

参考文献

[1]　KoppenolWH,MargoliashE.J.Biol.Chem.,1982,257:4426.[2]　IkedaO,ShirotaY,SakuraiT.J.Electroanal.Chem.,1990,287:179.[3]　ChenXH,RuanCM,KongJL,etal.Anal.Chim.Acta,2000,412:89.[4]　LisdatF,GeB,.,1999,1:65.[5]　LisdatF,GeB,KrauseB,etal.Electroanal.,2001,13(15):1225.

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2001,21(2):222.

[7]　LuTianhong,YuXiujuan,DongShaojun,etal.J.Electroanal.Chem.,1994,369:79.

[8]　ZHANGLi2jin,MINShun2geng,LIGuo2xue,etal(张立金,闵顺耕,李国学,等).SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分

析),2005,25(5):739.

StudyonInteractionbetweenCT2DNAandCytochromeCUsingUV2Vis

SpectroscopyandElectrochemistry

ZHOUJia2hong1,FENGYu2ying1,WUXiao2hong2,YANGHui2,3,L2331.AnalysisandDetectingCentralofNanjing2.EnvironmentalFriendshipScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing

　210097,China

3.ChangchunInstitute,ChineseAcademyofSciences,Jilin　130022,China

Abstract　TheinteractionbetweenCT2DNAimmobilizedonthepositivelychargednylonmembraneandcytochromeCwasstud2iedusingUV2Visreflectanceabsorptionspectroscopyandelectrochemistry.ItwasfoundthatcytchromeCcanbeadsorbedonthenegativechargedCT2DNAsurfacewiththeactivepositivechargearea.Therefore,CT2DNAcanpromotethedirectelectro2chemicalreactionofcytochromeC.

Keywords　CT2DNA;CytochromeC;Nylonmembrane;Electrochemistry;UV2Visspectroscopy;Interaction

(ReceivedMar.9,2004;acceptedJul.6,2004)　　

3Correspondingauthor

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/xu11.html