（自己整理）实验室常用技术

实验室常用技术资料

Lab. experiment technology

LQ

细胞冻存

1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(可以留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养) 5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，加入110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞均匀。

6. 冷存管置于4℃30min----20℃30min----80℃16～18小时(或隔

夜)---液氮槽长期储存。(-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。

7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

细胞复苏

冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。

1 材料：37℃ 恒温水浴箱，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 2 步骤：

1、操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

3、取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。

4、常温离心1000rpm，5min，以70% 酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，加入新鲜培养基，重悬细胞。

5、取出细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养瓶，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。

G418和筛选

1、筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。 1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。 2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量（10000个/ml）接种入24孔培养板中，过夜培养，开始加药。

3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml、400ug/ml。。。。1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。 4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。

6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。 2、确定了最佳筛选浓度后做稳定转染

1、转染：选取对数生长期细胞，接入平皿（4X105个/ml,5ml）,转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，接入12孔板，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合。

2、加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

3、换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大。 4、挑单克隆：显微镜下观察单克隆，加入胰酶消化，将单克隆吸入96孔板（每孔接1个克隆），加培养液继续培养。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。（及早冻存）

5、单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。

Lf2000转染：质粒DNA转染

转染前应筛选合适的DNA:Lf2000转染比例。一般按照1:1，2:1，3:1进行筛选。选择转染比率最高者为合适比例。筛选合适的细胞汇合度，看高汇合度还是低汇合度转染效率高。筛选时注意观察最佳转染时间。

以下操作以24孔板为例：

1、 贴壁细胞： 转染前一天，去不含抗生素的培养液500ul接于培养板(细胞密度0.5-2X105个/ml)，转染时细胞融合可到90-95%。

悬浮细胞：准备转染前取即可，取500ul细胞悬液（4-8X105 个/ml），培养液不含抗生素。 2、 准备混合物：

A：将DNA稀释于50ulOpti中，轻柔混匀。

B：使用前轻柔混匀Lf2000，取合适剂量用50ulOpti 稀释， 室温放置20min(注意：到stepC时要在25min内完成)。 C：加入A和B，轻柔混匀，室温放置20min.

3、 每孔中加入100ul混合物，前后晃动培养板，轻柔混匀。 4、 培养箱培养18-48h，转然后4-6h换液。

PBS配制 500ml

NaCl 4g KCl 0.1g Na2HPO4.12H2O 1.7907g

KH2PO4 0.12g

用400ml蒸馏水溶化，HCL/NaOH调PH至7.3-7.4，加水至500ml,高压灭菌。 胰酶配制

1、PBS 500ml 胰酶 1.25g EDTA 0.1g

搅拌4h

2、滤膜、滤纸用双蒸水浸泡2h,

3、装好滤器，勿按紧，包好，晾干后高压。 4、略烤干 5、层流室过滤

6、分装到高压过的小瓶

7、-20C保存备用，同时做无菌试验。

CuSO4配制

2% CuSO4 1500ml 硫酸铜 30g 双蒸水 1500ml

高压灭菌后，将液体倒入37C恒温箱。

双抗配制

青霉素 100u/ml培养液，链霉素100ug/ml培养液 青霉素 100万单位 链霉素 1g PBS 100ml

配制后浓度为10000u/ml，使用时取10ul/ml培养液。 电泳缓冲液TAE配制 贮存液（50X），1 L Tris 碱 242g 冰乙酸 57.1ml

0.5mol/l EDTA(PH8.0) 100ml 加水定容至1L

ALB培养基配制（400ml）

细菌培养用蛋白胨 4g 细菌培养用酵母提取物 2g 氯化钠 4g

预先在三角烧瓶中加入200ml双蒸水，将上述配方加入其中，搅拌。

5mol/L NaOH调PH至7.4.，加入双蒸水定容至400ml。取200ml做固体培养基装入A瓶，200ml做液体培养基。

称取3g琼脂加入A瓶。另取一小瓶，加入100ml双蒸水（配氨苄）。 将以上三瓶液体高压，15psi,20min。 配氨苄，过滤除菌。

待A、B瓶冷却至50oC，照100ug/ml浓度的氨苄，每瓶加入200ul，之后将A瓶液体倒入培养皿中，将B瓶和培养皿（倒置）贮存于4 oC。

注：溶液尚未冷却时，轻轻转动，使溶解的琼脂均匀分布，应避免产生气泡。使用前1-2小时应取出贮存的平皿。

细胞组织RNA提取（整个过程在冰上进行）

一、溶解细胞

（1） 贴壁细胞：吸去瓶内培养液，PBS冲洗两遍，加入胰酶消化，吸去胰酶加入PBS吹打，

制成细胞悬液，将悬液移入EP管，离心1000 rpm,10min，弃上清。加入Trizol 1ml。反复吹打，使沉淀溶解。（可以先加上500ul吹打，再加500ul充分混匀）

（2） 悬浮细胞：将细胞离心，加入Trizol反复吹打，使沉淀溶解。Trizol量为1ml/5-10X106

个细胞（动植物及酵母）或1ml/1X107个细菌。

（3） 组织：将组织切成小块（100mg），PBS冲洗干净，装入EP管，剪碎（非常碎，剪成

组织悬液，时间可稍长些），加入上500ulTrizol吹打使组织溶解，再加500ul充分混匀。

二、水相与有机相的分离

将上述所得液体于室温放置5min以使蛋白体解离，加入氯仿(0.2ml/ml Trizol),盖上管 盖，剧烈震荡（不要用振荡器）15s，室温放置2-3min。2-8OC下离心12000rpmX15min,离心后液体分三相：下层红色的酚-氯仿相，中间及上层水相。RNA全部位于水相，体积约占加入Trizol的60%。 三、沉淀RNA

将水相移入新的EP管（若要是提取DNA或蛋白质保留有机相）加入异丙醇（0.5ml/ ml Trizol）,-20OC放置90min（可过夜），2-8OC离心12000rpmX10min，可见管底部凝胶状沉淀，即为RNA。 四、洗涤RNA

用75%酒精（1ml/ml Trizol）冲洗沉淀，2-8OC离心7500rpmX5min,弃上清。将所得沉淀置于空气或真空（操作台内）中，干燥（注意不要过干，过干RNA难以溶解）。加入不含Rnase

O

的水或0.5%SDS溶液溶解RNA。琼脂糖凝胶电泳检测。-20C保存。

反转录

RNA 3ul(量可改变)

OLIGO 1ul 65OC水浴，5min H2O 5ul(量可变) 冰上静置1min 5Xbuffer 4ul Rninhibitor 1ul

DNTP 2ul 全部取好混匀后再分加 M-MVLV 1ul

混匀，瞬离，42OC水浴60min 70OC水浴5min,终止反应

PCR

H2O 12.2ul

Buffer 2.5ul 19.2ul DNTP 2.5ul MgCL2 2ul

上游引物 0.75ul 25ul 下游引物 0.75ul TAQ 0.3ul cDNA 4ul

石蜡封口，用PCR仪器，设定PCR条件。待反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测基因表达。 ATF5PCR条件： 94OC 5min 94OC 30s

55OC 30s 35cycle 72OC 30s 72OC 10min

琼脂糖凝胶电泳

1、 制胶：

称取1.2g琼脂糖（跑PCR产物时胶的浓度可大些1.5-1.8g）,加入100ml 0.5X TAE，加热融化后冷却至60OC左右，加入5ulEB，混匀。倒入胶板，除去气泡。冷却30min。硬化后放入电泳槽。（用不完可用保鲜膜包好放入4OC保存）。电泳槽内加电泳缓冲液0.5X TAE，使液面高出凝胶表面1-2mm。 2、 上样：

取5ul样品与上样缓冲液按4：1混匀，用微量加样器小心加入凝胶样品孔内，注意勿溢出孔外。 3、 电泳、紫外光检测和分析

接通电源，电压为5v/cm。电泳完成后，切断电源，紫外灯下观察条带。

质粒转化（操作过程需严格在无菌罩内操作）

1XTSS两步转化法

1、 菌种的复苏：用无菌铂丝直接挑取冻存的大肠杆菌菌株，在

LB琼脂平板表面划线，（同时在ALB固体培养基划板，验证大肠杆菌，正常不生长）置37oC培养12-16小时。

2、 从培养板中挑取单个菌落转到3ml LB液体培养基中，于37oC

摇床震摇,培养过夜直到OD值约0.6再转入含有10mlLB（按比例1：100接）液体培养基的烧瓶中剧烈震摇4h,200rpm/min。 3、 取1ml细菌培养物转移到EP管中，冰上静置10min,离心

3500rpmX5min,弃上清。（注意分组） 4、 加入100ulTSS溶液，反复轻柔吹打以重悬菌液（打开细胞壁）。 5、 加入连接产物1ul(体积不能超过10ul)，轻轻混匀后水浴40min。 6、 42oC热休克90s。

7、 冰浴2min，以冷却细胞。

8、 于EP管中加入100ul 37℃预热的LB培养液，37oC震摇30min。 9、 将100ul菌液均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上。

37oC培养12-16h。[若所转化质粒可用a-互补筛选重组阳性克隆，则加入80ul/40ul X-Gal(20mg/ml)和8ul/4ul IPTG(20mg/ml),混匀后涂板。

10、 将平板置4oC数小时后，观察培养结果（若非蓝白斑选择质粒

无需此步）。 实验设计

1、 转化时设对照组（不转染任何质粒）和转化组（转化目的质粒） 2、 第9步时，对照组分别在LB固体培养基和ALB固体培养基上

涂板，转化组只需用ALB固体培养基

3、 预期结果：对照组在LB固体培养基生长旺盛，在ALB固体

培养基上不生长；转化组在ALB固体培养基生长。

质粒DNA的分离与纯化

碱裂解法小量提取质粒

[材料]

LB液体培养基

STE溶液（0.1M NaCl，10mM Tris-HCl PH8.0，1mM EDTA）

Solution I溶液（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl PH8.0，10mM EDTA） SolutionⅡ溶液（0.2M NaOH，1%SDS，现用现配）

SolutionⅢ溶液（5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml） 3M乙酸钠溶液pH 5.2、纯水、无水乙醇、70%乙醇 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、TE缓冲液（10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA） [方法]

1、挑取含质粒的宿主菌单个菌落接种于5ml ALB液体培养基，37℃振荡培

养20小时以上，至OD600约为0.5。 2、将1.5~3ml菌液转入EP管中，12000rpm离心2分钟沉淀菌斑，弃上清，

倒置于吸水纸上是液体流尽。

3、加入预放置于4℃的STE溶液100ul重悬菌斑，12000rpm离心1分钟，

弃上清，倒置于吸水纸上是液体流尽。 4、加入4℃的100ul的Sol I重悬菌斑，必要时可振荡重悬，4℃放置5~10

分钟。 5、加入200ul新鲜配制的SolⅡ，倒置混匀5~10次，冰上放置2~3min（勿

振），使细菌裂解。 6、加入150ul预置4℃的SolⅢ，温和颠倒数次混匀5sec，冰上放置5min，

使质粒DNA复性。然后15000rpm离心10分钟，上清入新EP管，勿吸沉淀。

7、加入等体积（约450ul）的苯酚/氯仿/异戊醇振荡混匀，15000rpm离心

5min，将上层水相入新EP管，再加等体积的氯仿，振荡混匀，15000rpm离心5min，将上层水相入新EP管。

8、上清入新管，加入二倍体积的预置于－20℃的无水乙醇，再加入原液

1/10体积的3M NaAc，颠倒混匀，－20℃放置1小时，以沉淀质粒DNA。 9、15000rpm离心10min，将上清去掉，再加入1ml 70%的乙醇，沿管壁加

入，8000rpm离心10min，小心将上清弃去。

10、在空气中完全干燥后加入纯水或TE缓冲液30ul溶解沉淀，37℃水浴

30min后放置－20℃保存备用。

质粒提取试剂的配制

SolutionⅠ：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris-HCL（pH8.0）；10mmol/L EDTA

配制方法：

200mmol/L 葡萄糖 25ml （葡萄糖 0.99085g）

0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 2ml 1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） 2.5ml

加ddH2O定容至100ml, 高压蒸汽灭菌15min, 贮存于4℃。 Solution Ⅱ：200mmol/L NaOH；1% SDS（现用现配）

配制方法：

5mmol/L NaOH 40ul 10% SDS 100ul ddH2O 860ul

Solution Ⅲ：5mol/L乙酸钾 60ml；冰乙酸11.5ml；ddH2O 28.5ml；PH4.8

配制方法：

乙酸钾 29.442g 冰乙酸 11.5ml

加ddH2O定容至100ml，贮存于4℃。 STE缓冲液:10mmol/L Tris-HCL（pH8.0）； 0.1mol/L NaCL；10mmol/L EDTA （pH8.0）

配制方法：

NaCL 0.5844g

1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） 1ml 0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） 0.2ml

加ddH2O定容至100ml, 高压蒸汽灭菌15min, 贮存于4℃。

10% SDS（十二烷基磺酸钠） SDS 10g ddH2O 80ml

加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值为7.2，加ddH2O定容至100ml。 (注：SDS为表面活性剂，称量时要戴面罩。10% SDS无须灭菌。) 1mmol/L Tris-HCL（pH8.0） Tris 碱 12.114g 浓盐酸 5.03ml ddH2O 80ml

用浓盐酸调节溶液的pH值为8.0，补ddH2O定容至100ml。 0.5 mmol/L EDTA（pH8.0） EDTA- Na 18.61g ddH2O 80ml 在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值为8.0（约需2gNaOH）ddH2O 定容至100ml，高压灭菌备用。

(注：EDTA二钠盐需加NaOH将pH至调至接近8.0时才能完全溶解。) 3mol/L 乙酸钠（pH5.2）

冰乙酸钠 40.81g ddH2O 80ml

用冰乙酸调节pH至5.2，ddH2O定容至100ml，高压灭菌备用。

QIAGEN质粒大提

提取前准备：

1. RNase A加入Buffer P1,终浓度100ug/ml,2-8℃保存。 2. 检查Buffer P2中SDS状态（低温析出），必要的话37℃预热。 3. 4℃遇冷Buffer P3。 准备材料:

1. 标准的细菌培养物品（接种环、培养皿、摇床等）。 2. 架子（垂直放置柱子。） 3. 冰

4. 70%酒精 5. 异丙醇

6. 质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5） 7. 1.5-2.0ml离心管 8. 4℃离心机

提取步骤：

A)细菌培养、收获和裂解

1.新鲜培养板中挑取单克隆于2-5ml ALB培养基，37℃，300rpm培养8h。（使用的培养器皿体积需大于四倍的培养基体积）

2.按1/500-1/1000比例接种于ALB培养基，37℃，300rpm培养14-16h。高拷贝质粒：取100-200ul接种于100ml ALB培养基。低拷贝质粒：取250-500ul接种于500ml ALB培养基。（使用的培养器皿体积需大于四倍的培养基体积。培养的细菌密度达到3-4X10~9个/ml，这样得到的菌斑重量为3g/L培养基） 3.将获得的菌液4℃，6000g离心15min。（如果此时你想停止提取，可将菌斑冻于-20℃）

4.加入10ml Buffer P1充分重悬菌斑。（确保使用的容器足够装下裂解液，确保使用前加入RNase A，如果Buffer P1内加入LyseBlue,使用前轻柔晃动瓶身以确保LyseBlue混匀，必须确保菌斑充分混匀）

5.加入10ml Buffer P2，轻柔颠倒4-6次混匀彻底，室温（15-25℃）孵育5min。（不能涡旋混匀，这样会使基因断裂。此时溶液变粘稠。不要使裂解反应过程超过5min。加入Buffer P2后立即扣上盖子，避免空气中的CO2使其酸化。如果Buffer P1内加入LyseBlue，那么加入Buffer P2后细菌悬液变蓝，如果悬液不变蓝或仍可见棕色斑块，则继续混匀直到显色）

6.加入10ml Buffer P3，立刻轻柔颠倒4-6次彻底混匀，冰上孵育20min。（使用预冷的Buffer P3和冰浴可以加快沉降，加入Buffer P3后可见白色絮状沉淀，沉淀中含有基因组DNA，蛋白质，细菌碎片和KDS。裂解液需彻底混匀以确保钾、硫酸盐沉淀。如果混合物依然有粘性，那么继续混匀彻底中和溶液。如果使用LyseBlue，蓝色溶液变清。） B)提取上清

7.以4℃，不低于20000g离心30min，立刻取含有质粒的上清。（离

心前，需再次混匀样品。离心需要在非玻璃器皿中进行，例如聚丙烯。离心后上清液清透。）

8.以4℃，不低于20000g离心15min再次离心，取上清。移取120ul上清作为样品1，用于分析以确定生长和裂解的条件是否合适 C)用QIAGEN-tip连接、清洗和洗提质粒DNA

9.向QIAGEN-tip 500中加入10mlBuffer QBT平衡柱子，通过重力使其自然流空。（QIAGEN-tip需要彻底流干，此过程不需要看守，当液面达到柱子上部时自然会停止。）

10.将从第8步获取的上清移入柱子，使其自然流下通过滤膜。（上清应该立刻移入柱子。如果时间停滞过长或者因为蛋白的继续沉降使其浑浊，在放入柱子之前需要重新离心。）移取120ul滤液作为样品2.

11.用2X30ml Buffer QC冲洗柱子。（Buffer QC自然通过柱子，第一遍冲洗足以将绝大多数质粒污染物洗脱，但是当提取量大时，第二遍就非常重要。）移取240ul滤液作为样3。 12.用15ml Buffer QF洗脱DNA。（用15ml或50ml离心管收集洗脱液。不推荐使用聚碳酸酯离心管，因为不能耐受后续步骤使用的酒精。注：如果产物大于45-50Kb，65℃预热洗脱Buffer有助于提高产量。） 移取120ul滤液作为样品4，用于分析。 D)沉淀、清洗、溶解DNA

13.加入10.5ml（0.7倍体积）室温异丙醇到洗脱液中沉淀DNA。立刻混匀，4℃，不低于15000g离心30min。小心弃上清。（一次性锥形底离心管可以选择4℃，5000g离心60min。异丙醇沉淀具有玻璃外观，比酒精沉淀的絮状含盐沉淀难发现。异丙醇沉淀贴壁不牢，弃上清时要非常小心。）

14.加入5ml室温70%酒精，不低于15000g离心10min。小心弃上清避免碰到沉淀。（一次性锥形底离心管可以选择4℃，5000g离心60min。70%酒精用来洗脱沉淀的盐，并且挥发的乙醇可以移走残余的异丙醇，是DNA提取更容易。）

15.空气中干燥沉淀5-10min,用合适体积的质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5）溶解DNA。（溶解DNA时清洗侧壁，充分收集，特别是使用玻璃器皿时。应避免使用移液器反复吹打促进DNA混匀，这可能会导致DNA断裂。沉淀过于干燥会导致DNA难以溶解。DNA溶液最好保存在微碱性环境中，酸性Buffer难以溶解DNA。）

质粒小提试剂盒（所有过程在室温下进行）

E.Z.N. ATM Plasmid Mini Kit I

自 备 物品：13000×g转离心机

无菌1.5ml离心管（4个）

实验前准备：将RNaseA加入到SolutionⅠ瓶中，并置于4℃保存。 用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer。

使用前检查SolutionII，SolutionIII有无结晶析出，如果有将其

37℃温育，使其溶解。

1、 ①挑取冻存的含有质粒的大肠杆菌接种ALB固体培养基，37℃培养至

长出单菌落。

②挑取含有质粒的大肠杆菌（DH5α、JM109）单克隆，接种于1-5ml

的ALB中，37℃，300rpm活化12-16h 。

2、 取1.5-5ml菌液，10000g，室温离心1min，弃上清。

3、 加入250ul Solution I/RNaseA,吹打或涡旋重悬菌斑（吹打至看不到固体

颗粒）。<充分重悬有利于提高产量>

4、 加入250ul Solution II，轻柔颠倒混匀数次，清洗裂解产物<禁用振荡器，

用力过猛会导致染色体DNA断裂，Solution II盖子要拧紧>，可室温静置2min（管中拉丝，水膜形成）。

5、 加入350ul Solution III，轻柔颠倒混匀数次，直至白色絮状沉淀生成。

<加入Solution III后立即混匀，必须完全混匀 > 6、 13000×g，室温离心10min。（迅速进行下一步） （柱子使用前加100-200ul Buffer GPS，室温10000g 离心2min,去除GPS） 7、 将上层清夜小心加入干净的 HiBind Miniprep Column(1){将HiBind

Miniprep Column(1)套入2ml收集管}注意不要混入沉淀，确保没有细菌通过柱子。10000g室温离心1min,使液体完全通过柱子。 8、 弃滤液，重新使用离心管。<将滤液暂存于另一离心管>向柱子中加500ul

Buffer HB，10000×g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。 9、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000×g，室温

离心1min，弃滤液，重新使用离心管。

10、 向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNA Wash Buffer，10000×g，室

温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。

11、 13000×g，室温离心2min，离心空柱子以除去柱子内的酒精。

12、 将柱子放入干净的1.5ml离心管，加入30-50ul Elution Buffer(10Mm

Tris-HCl,PH8.5)或高压过的双蒸水到柱子上，室温静置1-2min, 13000×g，室温离心1min，洗涤DNA，将所得DNA分装入EP管，-20℃保存。（可以进行第二次离心，将残余的质粒洗脱，但是浓度很低）

13、 用琼脂糖凝胶电泳测提取质粒大小，用紫外分光光度计检测质粒浓度。 14、 DNA浓度=A260 X 50 ug/ml

Western blot的原理、操作及注意事项

原理：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织：

组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞：

细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1.双缩脲法：

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。 2.Lowry法：

此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 3.紫外吸收法：

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：

是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质

溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。

此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm

处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。

所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：

光密度之差求 得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。 4. Bradford比色法：

Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。

分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20μl），以0.15mmol/l NaCl补足至100μl，同时以两管100μl的0.15mmol/l NaCl作空白对照。每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100μg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100μg另作一标准曲线进行测定。 5．电泳估算法（我们选择此法）：

样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。 以提取癌组织总蛋白为例：

① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。

② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。 ③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；

④ SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。 二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE） A：实际操作

1. 做胶前的准备

1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。 2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。

3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。

2. 制胶，电泳

1）装好架子。

2)按照下面配方配制分离胶。(单位：ml，Total： 8ml) 2×Sep. buffer 30％ Gel.sol ddH2O TEMED 10%APS

在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。

3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶。(单位：ml，Total： 3.5ml)

7.5％ 4 2.0 1.9 8ul 80ul 10％ 4 2.7 1.2 8ul 80ul 15% 4 4 0 8ul 80ul

30％ Gel.sol ddH2O TEMED 10%APS 3％ 2×Stacking. buffer 1.7 0.35 1.4 5ul 50ul 倒好后插入预先准备好的梳子。

4)待胶凝集好后，上样，电泳。 上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。一般电泳时间在1.5小时左右。 B ：注意事项及常遇到的问题

1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。

2

2）上样蛋白量不应超过30ug/mm (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×

2

5mm=5mm) 。

3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。

4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 5）电泳中常出现的一些现象：

︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。 三、转移

在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。

膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。 A 半干法

即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。 1 实验条件的选择

电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。 目的蛋白分子大小(kDa) 80---140 25---80 15--40 <20 胶浓度 8% 10 12 15 转移时间(h) 1.5-2.0 1.5 0.75 0.5 2 实验操作

（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。

A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。 B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。

C. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。 D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。 （2）转移

A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。 B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，

保持膜的湿润。

C. 将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。

D. E. F. G. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。

将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。

转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。

靠胶滤纸 胶 膜 靠膜滤纸

3 注意事项及常遇到的问题

1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。

4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。

5）转移时间一般为1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

B 湿法

我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。 C 转移后效果的鉴定 1．染胶

用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。 2．染膜

有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。 四、封闭（block）

封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。

常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。

在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小时。

五、孵育一抗

A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。

B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释， 最好采用梯度稀释。

C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上 抗原量适当延长或缩短时间。

注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。

六、洗涤

用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。

洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

七、孵育二抗

孵育 RT1 小时。 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。 二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。

注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。

八、洗涤

用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。 然后5mins *5。 洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。

九、显色（HRP酶）

1．增强化学发光法(ECL)

Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：

鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 试验步骤：

1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。 2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。 3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。

4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。 5）显影、定影。

6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。 2.DAB显色

DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。

对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成

一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。

十、分析结果及其判断

常见问题原因分析及处理方法： 见附录一、二。

附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）

附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）

附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液

1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:

Stock: to use:

20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock 10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml

250mM Tris 15.14g bromphenol blue or total 475.00ml pyronine 4 to taste 2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix): 0.8 bis-acrylamide 0.8g 29.2% acrylamide 29.2g total 100ml

3) 2x Laemmli Separation Buffer:

0.75M Tris-HCl 90.825g

0.2% SDS 10ml 20% SDS total 1000ml pH8.8

4) 2x Laemmli Stacking Buffer:

0.25M Tris 15.14g 0.2% SDS 1g total 500ml pH6.8

5) 10x Laemmli Running Buffer:

250mM Tris 60.55g 1.9M Glycine 285.27g 1% SDS 20g total 2 liters pH8.3

6) Transfer Buffer:

48mM Tris base 5.81g 39mM Glycine 2.93g 0.037% SDS 0.375g 20% MeOH 200ml total 1000ml 7) TBST:

10mM Tris-HCl， 1.21g 100mM NaCl 0.2% Tween-20 Total 1000ml pH7.4

8) Coomassie Stain :

40%MeOH 400ml 10%HAc 100ml

0.1?R 1g Brilliant Blue R total 1000ml 9) Destain:

30%MeOH 300ml 7.5%HAc 75ml total 1000ml 10) 10×丽春红染液配方： 丽春红 2g 磺基水杨酸 30g 三氯醋酸 30g

total 100ml 11）DAB

DAB 50mg 0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml 30%H2O2 30-40ul

先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01％。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/xtu6.html